張 成 趙 菲 李 煬 張 勇 王 馳 耿照玉

(安徽農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物科技學(xué)院，合肥 230036)

環(huán)境溫度驟然升高而引發(fā)的熱應(yīng)激現(xiàn)象引起了家禽生產(chǎn)者的普遍關(guān)注。家禽受到急性熱應(yīng)激時(shí)會(huì)使器官受損，進(jìn)而導(dǎo)致生理機(jī)能紊亂，最終影響家禽正常生長(zhǎng)發(fā)育和健康，造成較大的經(jīng)濟(jì)損失[1-2]。研究表明，熱應(yīng)激狀態(tài)下，家禽抗氧化系統(tǒng)失衡，導(dǎo)致機(jī)體內(nèi)活性氧自由基(ROS)增高，誘發(fā)機(jī)體發(fā)生氧化應(yīng)激損傷[3]。因此，研究如何減少熱應(yīng)激對(duì)肉雞的氧化損傷顯得尤為重要。研究顯示，飼糧中添加具有抗氧化活性的植物源活性物質(zhì)是緩解熱應(yīng)激肉雞氧化應(yīng)激損傷的有效途徑[4]，其中多酚類物質(zhì)表現(xiàn)效果很佳[5-8]。茶多酚具有抗氧化、抗炎、抗癌、抑菌以及清除自由基等多種生物學(xué)功能，其主要成分為兒茶素，而表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG)占兒茶素80%[9]。研究表明，EGCG可降低細(xì)胞內(nèi)ROS及脂質(zhì)過氧化水平，提高細(xì)胞內(nèi)谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)的活性，表明EGCG有顯著的抗氧化效果[10]。Wada等[11]研究表明，EGCG可以提高小鼠胰島細(xì)胞的活力和抗氧化功能，可能與其提高核因子E2相關(guān)因子2(Nrf2)和亞鐵血紅素加氧酶1(HO-1)mRNA的表達(dá)量并減少ROS的生成有關(guān)。韓國(guó)清等[12]在仔豬日糧中添加EGCG顯著提高了仔豬的采食量和血清超氧化物歧化酶(SOD)活性，降低血清丙二醛(MDA)含量，表明EGCG能緩解仔豬斷奶后的氧化應(yīng)激，提高生產(chǎn)性能。熱應(yīng)激的時(shí)長(zhǎng)、溫度高低及模式(持續(xù)和循環(huán))對(duì)家禽抗氧化系統(tǒng)的影響存在差異[3]。研究表明，慢性熱應(yīng)激條件下，飼糧中添加EGCG通過提高肉雞血清和肝臟GSH-Px、SOD和過氧化氫酶(CAT)等抗氧化酶活性，降低MDA水平來改善肉雞生長(zhǎng)性能并減輕應(yīng)激損傷，同時(shí)提高肝臟中Nrf2蛋白的表達(dá)水平[13-14]，提示EGCG提高慢性熱應(yīng)激肉雞抗氧化能力可能介導(dǎo)了Nrf2信號(hào)通路，但其具體機(jī)制仍需進(jìn)一步探究。然而關(guān)于EGCG對(duì)急性熱應(yīng)激肉雞抗氧化能力的影響還未有相關(guān)研究，如何改善急性熱應(yīng)激肉雞的抗氧化能力，其具體機(jī)制是否與Nrf2信號(hào)通路介導(dǎo)相關(guān)，值得進(jìn)一步研究。因此，本研究以淮南麻黃肉雞為研究對(duì)象，旨在考察飼糧中添加EGCG對(duì)急性熱應(yīng)激肉雞抗氧化能力的影響并初步探究其機(jī)理，以期為其作為綠色、安全的飼料添加劑應(yīng)用于家禽生產(chǎn)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

選取10日齡體重(170±2) g的淮南麻黃公雞144羽，隨機(jī)分為3組：對(duì)照組(Ⅰ組)、急性熱應(yīng)激組(Ⅱ組)、急性熱應(yīng)激+EGCG組(Ⅲ組)，每組6個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)8羽。Ⅰ組和Ⅱ組飼喂基礎(chǔ)飼糧，Ⅲ組飼喂在基礎(chǔ)飼糧中添加400 mg/kg EGCG的試驗(yàn)飼糧。10～21日齡，環(huán)境溫度由30 ℃降溫至(22±1) ℃，隨后保持該溫度至93日齡。94日齡時(shí)，Ⅰ組環(huán)境溫度維持為(22±1) ℃，Ⅱ組和Ⅲ組環(huán)境溫度升高到(33±1) ℃，維持該溫度12 h并禁食，熱應(yīng)激處理后屠宰取樣。雞舍用排風(fēng)扇進(jìn)行縱向通風(fēng)，用加濕器控制濕度(相對(duì)濕度65%左右)，用加熱器控制溫度。

1.2 飼養(yǎng)管理

試驗(yàn)在安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)試驗(yàn)基地開展，試驗(yàn)雞自由采食和飲水，常規(guī)管理?；A(chǔ)飼糧參照《雞飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)》(NY/T 33-2004)配制，基礎(chǔ)飼糧組成及營(yíng)養(yǎng)成分見表1。EGCG純度為98%，購自杭州怡倍嘉茶葉科技有限公司。

表1 飼糧組成與營(yíng)養(yǎng)水平(干物質(zhì)基礎(chǔ))Table 1 Composition and nutrient levels of the basal diets (air-dry basis)

1.3 樣品采集

在每個(gè)重復(fù)中隨機(jī)選取體重相近的2羽肉雞，翅靜脈采血5 mL，3 000 r/min離心15 min，分離血清，置于-20 ℃保存待測(cè)。采血后，頸靜脈放血處死后，迅速打開腹腔，采取肝臟、脾臟、空腸樣品，裝于無菌的凍存管并液氮速凍后置于-80 ℃冰箱保存待測(cè)。

1.4 檢測(cè)指標(biāo)

1.4.1器官指數(shù)的測(cè)定

取肝臟、肌胃、脾臟、十二指腸、空腸、回腸稱重，計(jì)算器官指數(shù)。

肝臟指數(shù)=肝臟質(zhì)量/體重
肌胃指數(shù)=肌胃質(zhì)量/體重
脾臟指數(shù)=脾臟質(zhì)量/體重
十二指腸指數(shù)=十二指腸質(zhì)量/體重
空腸指數(shù)=空腸質(zhì)量/體重
回腸指數(shù)=回腸質(zhì)量/體重

1.4.2血清和組織器官中抗氧化指標(biāo)測(cè)定

血清和組織器官中CAT、GSH-Px、總SOD(T-SOD)活力以及蛋白羰基(PC)和MDA含量采用南京建成生物工程研究所的試劑盒按照說明書進(jìn)行測(cè)定。組織樣品制備過程如下：稱取空腸、肝臟和脾臟樣品(0.5～1.0 g)，按質(zhì)量(g)∶體積(mL)=1∶9 的比例加入預(yù)冷的生理鹽水，在冰浴條件下用勻漿機(jī)勻漿，然后于4 ℃冷凍離心機(jī)中3 500 r/min離心10 min，取上清液進(jìn)行測(cè)定。采用的儀器為SUNRISE酶標(biāo)儀和TU-1900紫外可見光分光光度計(jì)。

1.4.3肝臟中Nrf2通路相關(guān)基因表達(dá)測(cè)定

采用上海Yeasen生物技術(shù)公司的Trizol試劑提取肝臟總RNA，用Nano-drop 2000分光光度計(jì)在260和280 nm處測(cè)定吸光度值，進(jìn)行RNA純度檢測(cè)。檢測(cè)合格后反轉(zhuǎn)錄成cDNA。利用NCBI搜索目標(biāo)基因序列，運(yùn)用Primer 5進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，引物由安徽通用生物科技有限公司合成?；虮磉_(dá)水平用ABI 7500實(shí)時(shí)定量PCR儀進(jìn)行測(cè)定。qRT-PCR 反應(yīng)體系為20 μL：cDNA 2 μL，上游引物1 μL，下游引物1 μL，PCR Master Mix(2×)10 μL，ddH2O 6 μL。選擇β-肌動(dòng)蛋白(β-actin)作為內(nèi)參基因，使用2-ΔΔCt方法計(jì)算目的基因的表達(dá)量。引物序列及參數(shù)見表2。

表2 Nrf2信號(hào)通路相關(guān)基因的引物序列Table 2 Primers sequences for Nrf2 signaling pathway-related genes

1.5 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示，使用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析(One-way ANOVA)，Duncan氏法進(jìn)行多重比較，以P<0.05為差異顯著,P<0.01為差異極顯著作為判斷標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 EGCG對(duì)急性熱應(yīng)激肉雞器官指數(shù)的影響

由表3可見，急性熱應(yīng)激和EGCG對(duì)肝臟指數(shù)、肌胃指數(shù)、十二指腸指數(shù)、空腸指數(shù)和回腸指數(shù)均無顯著影響(P>0.05)。然而，與Ⅰ組相比，Ⅱ組肉雞脾臟指數(shù)顯著下降(P<0.05)，提示急性熱應(yīng)激損害了肉雞的器官免疫功能。

表3 EGCG對(duì)急性熱應(yīng)激肉雞器官指數(shù)的影響Table 3 Effects of EGCG on organ index of acute heat-stressed broilers g/kg

2.2 EGCG對(duì)急性熱應(yīng)激肉雞血清抗氧化功能的影響

由表4可見，盡管急性熱應(yīng)激和EGCG對(duì)血清中MDA、PC含量和GSH-Px活力均無顯著影響(P>0.05)，但與Ⅰ組相比，Ⅱ組肉雞血清中MDA和PC含量分別提高了77.19%和25.14%(P<0.10)；與Ⅱ組相比，Ш組肉雞血清中MDA和PC含量分別降低了42.57%和21.19%。另外，與Ⅰ組相比，Ⅱ組肉雞血清中T-SOD和CAT活力顯著降低(P<0.05)；與Ⅱ組相比，Ш組肉雞血清中CAT和GSH-Px活力分別提高了48.87%和20.13%(P<0.10)。上述結(jié)果提示，EGCG可提高急性熱應(yīng)激肉雞機(jī)體的抗氧化功能。

表4 EGCG對(duì)急性熱應(yīng)激肉雞血清抗氧化功能的影響Table 4 Effects of EGCG on antioxidant function in serum of acute heat-stressed broilers

2.3 EGCG對(duì)急性熱應(yīng)激肉雞脾臟抗氧化功能的影響

由表5可見，與Ⅰ組相比，Ⅱ組肉雞脾臟中T-SOD 和CAT活力顯著降低(P<0.05)；與Ⅱ組相比，飼糧中添加EGCG可顯著提高急性熱應(yīng)激肉雞脾臟中CAT活力(P<0.05)，提示EGCG對(duì)急性熱應(yīng)激肉雞脾臟抗氧化活力有顯著的提高效果。

表5 EGCG對(duì)急性熱應(yīng)激肉雞脾臟抗氧化功能的影響Table 5 Effects of EGCG on antioxidant function in spleen of acute heat-stressed broilers

2.4 EGCG對(duì)急性熱應(yīng)激肉雞空腸抗氧化功能的影響

由表6可見，與Ⅰ組相比，Ⅱ組肉雞空腸中MDA含量顯著上升(P<0.05)；與Ⅱ組相比，飼糧中添加EGCG可顯著降低急性熱應(yīng)激肉雞空腸中MDA含量(P<0.05)，表明EGCG能降低急性熱應(yīng)激肉雞空腸的氧化損傷。

表6 EGCG對(duì)急性熱應(yīng)激肉雞空腸抗氧化功能的影響Table 6 Effects of EGCG on antioxidant function in jejunum of acute heat-stressed broilers

2.5 EGCG對(duì)急性熱應(yīng)激肉雞肝臟抗氧化功能的影響

由表7可見，與Ⅰ組相比，Ⅱ組肉雞肝臟中T-SOD和GSH-Px活力顯著降低(P<0.05)，MDA和PC含量極顯著上升(P<0.01)；與Ⅱ組相比，飼糧中添加EGCG可顯著提高急性熱應(yīng)激肉雞肝臟中GSH-Px活力(P<0.05)，同時(shí)極顯著降低MDA含量(P<0.01)。上述結(jié)果提示，EGCG對(duì)急性熱應(yīng)激肉雞肝臟的抗氧化能力有顯著的提高效果。

表7 EGCG對(duì)急性熱應(yīng)激肉雞肝臟抗氧化功能的影響Table 7 Effects of EGCG on antioxidant function in liver of acute heat-stressed broilers

2.6 EGCG對(duì)急性熱應(yīng)激肉雞肝臟Nrf2信號(hào)通路中關(guān)鍵基因表達(dá)的影響

由表8可知，與Ⅰ組相比，Ⅱ組肉雞肝臟中Nrf2、CAT和NQO1mRNA表達(dá)量顯著降低(P<0.05)，GSH-PxmRNA表達(dá)水平極顯著降低(P<0.01)，而Keap1mRNA表達(dá)量顯著升高(P<0.05)；與Ⅱ組相比，Ⅲ組肉雞肝臟中CATmRNA表達(dá)量顯著升高(P<0.05)。上述結(jié)果提示EGCG提高急性熱應(yīng)激肉雞肝臟抗氧化能力可能介導(dǎo)了Nrf2信號(hào)通路。

表8 EGCG對(duì)急性熱應(yīng)激肉雞肝臟Nrf2信號(hào)通路相關(guān)基因表達(dá)的影響Table 8 Effects of EGCG on the expression of Nrf2 signaling pathway-related genes in liver of acute heat-stressed broiler

3 討 論

3.1 EGCG對(duì)急性熱應(yīng)激肉雞器官指數(shù)的影響

器官指數(shù)是衡量動(dòng)物機(jī)體系統(tǒng)發(fā)育狀況和功能的重要指標(biāo)。對(duì)于家禽而言，脾臟是最為重要的免疫器官，其生長(zhǎng)發(fā)育是家禽免疫系統(tǒng)功能的基礎(chǔ)[15]。大量研究表明，熱應(yīng)激會(huì)使機(jī)體器官發(fā)育受阻，免疫器官指數(shù)顯著降低，脾臟表現(xiàn)尤甚[16]，這主要是由于熱應(yīng)激一方面導(dǎo)致了脾臟炎癥的發(fā)生，另一方面導(dǎo)致了抗氧化系統(tǒng)受損，最終導(dǎo)致脾臟細(xì)胞的凋亡。與此一致，本研究表明，急性熱應(yīng)激顯著降低了肉雞脾臟指數(shù)。Zhang等[6]研究表明，白藜蘆醇(多酚類物質(zhì))可顯著降低慢性熱應(yīng)激對(duì)肉雞脾臟等器官指數(shù)的負(fù)面影響。然而，Aydogan等[17]研究表明，同為多酚類物質(zhì)的EGCG對(duì)正常飼養(yǎng)條件下肉雞肝臟、心臟、脾臟、胰腺和法氏囊指數(shù)均無顯著影響。此外，本研究發(fā)現(xiàn)，EGCG對(duì)急性熱應(yīng)激肉雞器官指數(shù)無顯著影響，但其如何影響慢性熱應(yīng)激條件下肉雞的器官指數(shù)尚需深入研究。

3.2 EGCG對(duì)急性熱應(yīng)激肉雞血清和組織器官抗氧化能力的影響

肉雞對(duì)高溫有一定的耐受性，但該能力是有限的，隨著溫度的升高和時(shí)間的延長(zhǎng)，機(jī)體內(nèi)的氧化還原平衡被破壞，ROS大量聚集并誘導(dǎo)氧化應(yīng)激，導(dǎo)致細(xì)胞脂質(zhì)、蛋白質(zhì)和DNA過氧化[18]。血清抗氧化酶的變化反映了動(dòng)物機(jī)體抗氧化能力的改變，而MDA和PC含量反映了機(jī)體氧化損傷的程度[19]。前期研究發(fā)現(xiàn)，37 ℃的高溫可導(dǎo)致雪峰烏骨雞血清中GSH-Px、CAT等抗氧化酶活性顯著降低，抗氧化能力減弱，脂質(zhì)發(fā)生過氧化反應(yīng)[5]，而營(yíng)養(yǎng)調(diào)控可有效提高抗氧化酶活性[20]。EGCG的B環(huán)上含有活躍的羥基氫，可用于清除自由基，是純天然的高效抗氧化劑。研究表明，EGCG能顯著降低慢性熱應(yīng)激肉雞血清中MDA含量，顯著升高抗氧化酶CAT、SOD和GSH-Px活性，表明EGCG可通過提高抗氧化酶活性，進(jìn)而緩解熱應(yīng)激導(dǎo)致的氧化損傷[13,19]。本研究表明，飼糧中添加EGCG可分別提高急性熱應(yīng)激肉雞血清中GSH-Px和CAT活力達(dá)20.13%和48.87%，同時(shí)降低血清中MDA和PC含量達(dá)42.57%和21.99%，說明EGCG在一定程度上改善了肉雞機(jī)體的抗氧化能力，緩解了急性熱應(yīng)激引起的氧化應(yīng)激，但其作用機(jī)理需要進(jìn)一步探究。

熱應(yīng)激是影響腸道形態(tài)和功能的主要因素之一，小腸作為家禽消化吸收營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的主要場(chǎng)所，對(duì)家禽的生長(zhǎng)發(fā)育起著至關(guān)重要的作用[21]。當(dāng)家禽處于熱應(yīng)激狀態(tài)下，一方面高溫引起的氧化應(yīng)激破壞了抗氧化系統(tǒng)[22]，另一方面機(jī)體為了加快散熱，會(huì)加速血液流向體表，使得流向腸道的血液大大減少，導(dǎo)致腸道供血不足，從而造成腸道細(xì)胞的凋亡，壞死甚至脫落等現(xiàn)象，是腸道病變和黏膜損傷的重要原因[23]。雷昕[9]研究發(fā)現(xiàn)，飼糧添加EGCG可顯著提高慢性熱應(yīng)激肉雞空腸中GSH-Px、SOD和CAT活性，同時(shí)降低MDA含量，提示其顯著提高了慢性熱應(yīng)激肉雞空腸抗氧化性能，并降低氧化損傷。本研究表明，急性熱應(yīng)激和EGCG對(duì)肉雞空腸抗氧化酶無顯著影響，但急性熱應(yīng)激顯著提高了肉雞空腸中MDA含量，而飼糧中添加EGCG可顯著將其降低，說明EGCG可有效降低急性熱應(yīng)激對(duì)肉雞腸道的氧化損傷。

脾臟作為最重要的外周免疫器官，參與細(xì)胞和體液免疫過程。Zhang等[6]研究證明，慢性熱應(yīng)激顯著降低肉雞脾臟中CAT、T-AOC和T-SOD活力，同時(shí)顯著提高M(jìn)DA含量，表明熱應(yīng)激對(duì)肉雞脾臟抗氧化能力有抑制作用，而飼糧添加白藜蘆醇具有顯著的緩解作用。盡管EGCG具有抗氧化作用，但其對(duì)熱應(yīng)激肉雞脾臟抗氧功能的調(diào)控作用還未見報(bào)道。本研究發(fā)現(xiàn)，急性熱應(yīng)激顯著降低了脾臟中T-SOD和CAT活力，而飼糧中添加EGCG可顯著提高急性熱應(yīng)激肉雞脾臟中CAT活力，提示其可有效緩解急性熱應(yīng)激對(duì)肉雞脾臟抗氧化功能的負(fù)面作用。

肝臟作為動(dòng)物體內(nèi)最重要的器官之一，具有代謝和解毒的作用。肉雞分別在35和38 ℃的環(huán)境中暴露3 h后，肝臟中MDA和PC的含量顯著升高，表明肉雞暴露于高溫下會(huì)導(dǎo)致肝臟脂質(zhì)和蛋白質(zhì)的氧化損傷[24]。體外試驗(yàn)表明，EGCG可提高人體肝細(xì)胞SOD活性，同時(shí)降低MDA含量，提示其可提高肝細(xì)胞抗氧化能力，同時(shí)降低氧化損傷[25]。薛菠[14]研究發(fā)現(xiàn)，飼糧中添加EGCG可顯著提高慢性熱應(yīng)激肉雞肝臟中SOD、GSH-Px和CAT的活性，同時(shí)顯著降低MDA含量。本研究表明，急性熱應(yīng)激肉雞肝臟中MDA和PC含量極顯著升高，T-SOD 和GSH-Px活力顯著降低，而飼糧中添加EGCG可極顯著降低急性熱應(yīng)激肉雞肝臟中MDA含量，同時(shí)顯著提高GSH-Px活力，表明EGCG能有效提高急性熱應(yīng)激肉雞肝臟抗氧化能力，從而緩解急性熱應(yīng)激對(duì)肝臟造成的損傷?？梢?，EGCG具有良好的護(hù)肝作用，能有效緩解急性和慢性熱應(yīng)激對(duì)肉雞肝臟抗氧化功能的損害，緩解肝臟氧化損傷。

3.3 EGCG對(duì)急性熱應(yīng)激肉雞肝臟Nrf2信號(hào)通路抗氧化基因表達(dá)的影響

大量研究表明，Nrf2作為抗氧化系統(tǒng)中重要的轉(zhuǎn)錄因子[26-27]，對(duì)于維持機(jī)體氧化平衡以及調(diào)控下游CAT和NQO1等抗氧化酶基因的表達(dá)具有至關(guān)重要的作用[28-30]。敲除Nrf2基因的小鼠對(duì)氧化應(yīng)激的敏感性增加，而使用激活劑增強(qiáng)Nrf2的表達(dá)可在一定程度上保護(hù)動(dòng)物免受氧化損傷。EGCG是綠茶多酚中含有的Nrf2活化劑，Wang等[31]研究表明飼糧中添加EGCG可上調(diào)蛋雞子宮Nrf2和HO-1mRNA表達(dá)量，從而提高蛋雞的抗氧化能力，緩解釩誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激。薛波[14]研究表明，EGCG可顯著提高慢性熱應(yīng)激肉雞肝臟中Nrf2蛋白的表達(dá)水平。本研究顯示，急性熱應(yīng)激顯著降低肉雞肝臟中Nrf2、GSH-Px、CAT和NQO1的mRNA表達(dá)量，并顯著提高Keap1的mRNA表達(dá)量，這可能是急性熱應(yīng)激導(dǎo)致肉雞發(fā)生氧化應(yīng)激損傷的主要原因，而飼糧中添加EGCG可顯著提高急性熱應(yīng)激肉雞肝臟中CATmRNA表達(dá)量，說明EGCG可能介導(dǎo)激活Nrf2信號(hào)通路提高機(jī)體抗氧化能力，進(jìn)而有效緩解急性熱應(yīng)激導(dǎo)致的氧化損傷。但具體機(jī)制尚需進(jìn)一步研究，后續(xù)研究可進(jìn)一步檢測(cè)Nrf2信號(hào)通路關(guān)鍵蛋白的表達(dá)水平，如結(jié)果與mRNA水平的結(jié)果一致，則可進(jìn)一步在細(xì)胞水平開展研究，基于Nrf2信號(hào)通路揭示EGCG緩解肉雞急性熱應(yīng)激的機(jī)制。

4 結(jié) 論

飼糧添加EGCG可提高急性熱應(yīng)激肉雞抗氧化能力，進(jìn)而緩解急性熱應(yīng)激造成的氧化損傷，其機(jī)制可能與EGCG激活Nrf2信號(hào)通路關(guān)鍵抗氧化基因表達(dá)有關(guān)。