劉淵 曾玉坤 劉玲 黃演林 余麗華 丁紅珂

（廣東省婦幼保健院醫(yī)學(xué)遺傳中心，廣東 廣州 511442）

Coffin-Lowry綜合征（Coffin-Lowry syndrome，CLS）（OMIM＃303600）是一種罕見的X連鎖顯性遺傳病，發(fā)病率為1∶100 000～1∶50 000間，以男性患者居多［1］。主要為男性受累，臨床癥狀主要為特殊面容、肌張力減退、進(jìn)行性痙攣性截癱、陣發(fā)性運(yùn)動(dòng)障礙、睡眠呼吸暫停、進(jìn)行性脊柱側(cè)凸、心血管疾病、骨骼畸形、感音神經(jīng)性耳聾、視力異常、胼胝體變薄和發(fā)育不全、小腦蚓部發(fā)育不全、腦室周圍白質(zhì)異常，受影響的男性有較嚴(yán)重的智力障礙，受影響的女性往往有輕度到中度的智力障礙但也可能智力正常，也可能有典型的面部、手部和骨骼癥狀［1，2］。CLS的致病基因是核糖體蛋白S6激酶多肽3基因（ribosomal protein S 6 kinase polypeptide 3，RPS6KA3），位于Xp22.2，已有報(bào)道的RPS6KA3相關(guān)變異多達(dá)140余種，其中70%～80%為新發(fā)變異，家系病例報(bào)道相對(duì)較少［1］。由于CLS病例大多為新發(fā)病例，并無家系關(guān)聯(lián)，且早期的患兒臨床表型并無特異，常規(guī)的遺傳檢測(cè)并不能對(duì)該病進(jìn)行高效診斷。本研究中，我們利用高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)2例Coffin-Lowry綜合征家系進(jìn)行變異基因檢測(cè)及分析，并對(duì)檢測(cè)到的變異位點(diǎn)進(jìn)行Sanger測(cè)序驗(yàn)證，對(duì)Coffin-Lowry綜合征患者進(jìn)行了分子診斷，豐富了Coffin-Lowry綜合征的病因信息，同時(shí)為該家庭的臨床診斷和遺傳咨詢提供了遺傳學(xué)證據(jù)。

1 材料與方法

1.1 病歷資料

1.1.1 先證者1 男性，現(xiàn)1歲，足月順產(chǎn)，出生體重3.0kg，出生時(shí)無窒息搶救史。胎兒期發(fā)育持續(xù)小于孕周2～3周。出生3個(gè)月后聽力篩查未通過，且抬頭不穩(wěn)。體格檢查發(fā)現(xiàn)患兒特殊面容（眼距寬、鼻梁扁平、牙間距大）；僅能扶物站立，尚無語言發(fā)育，精神運(yùn)動(dòng)發(fā)育遲緩。

家系調(diào)查：先證者母親未見明顯異常，因再次懷孕，來本中心就診。經(jīng)遺傳咨詢后，家屬知情選擇對(duì)先證者及父母進(jìn)行醫(yī)學(xué)外顯子檢測(cè)，經(jīng)高通量測(cè)序及Sanger測(cè)序驗(yàn)證先證者致病基因?yàn)镽PS6KA3新發(fā)半合子變異［c.1672C＞T（p.R558*）］。孕婦知情選擇行羊水穿刺，利用羊水DNA對(duì)當(dāng)前胎兒檢測(cè)RPS6KA3基因c.1672位點(diǎn)是否與先證者相同，同時(shí)行羊水染色體微陣列分析（chromosomal microarray analysis，CMA）及熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（quantitative fluorescence polymerase chain reaction，QF-PCR）檢測(cè)以排除胎兒染色體異常。

1.1.2 先證者2 男性，現(xiàn)4歲，患兒出生時(shí)哭聲弱、聽力篩查未通過；家屬告知4個(gè)月大時(shí)患兒表現(xiàn)為豎頭不穩(wěn)、不能翻身、肢體活動(dòng)偏少、肌張力低下、自主意識(shí)欠佳；患兒表現(xiàn)為精神運(yùn)動(dòng)發(fā)育遲緩、特殊面容、眼距寬、鼻梁平、極重度耳聾。曾行頭部磁共振成像（magnetic resonance imaging，MRI）檢查，提示腦室增寬、腦外間隙增寬、腦萎縮等。高通量測(cè)序結(jié)果顯示患兒為RPS6KA3新發(fā)半合子變異（c.325＋2＿325＋3insT），現(xiàn)要求針對(duì)先證者RPS6KA3基因變異位點(diǎn)進(jìn)行產(chǎn)前診斷。

家系調(diào)查：先證者母親現(xiàn)30歲，孕16周，未見明顯異常。經(jīng)遺傳咨詢后，家屬知情選擇對(duì)先證者RPS6KA3基因變異位點(diǎn)進(jìn)行家系驗(yàn)證。孕婦知情選擇行羊水穿刺，利用羊水DNA對(duì)當(dāng)前胎兒檢測(cè)RPS6KA3基因的先證者變異位點(diǎn)，同時(shí)行羊水CMA及QF-PCR檢測(cè)以排除胎兒染色體異常。

本文所涉及研究獲得了廣東省婦幼保健院機(jī)構(gòu)審查委員會(huì)及倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)。所有樣品的采集均取得了參與者的書面知情同意書。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 外周血及羊水DNA提取 經(jīng)知情同意后，采集先證者及其父母外周血2ml（EDTA抗凝）；孕婦在超聲引導(dǎo)下進(jìn)行羊水穿刺，抽取20ml羊水，所采集樣本及時(shí)送到實(shí)驗(yàn)室處理。利用柱提法對(duì)外周血和羊水進(jìn)行基因組DNA提取，所用試劑盒為德國(guó)Qiagen公司生產(chǎn)的Qiamp DNA Blood Mini Kit。提取完成后，用NanoDrop2000超微量分光光度計(jì)及Qubit定量試劑盒（Thermo Fisher）對(duì)DNA進(jìn)行純度和濃度的測(cè)定，合格DNA保存于－20℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 羊水染色體微陣列分析 通過快速Q(mào)FPCR法對(duì)D13S305、D18S978、D21S11等11個(gè)STR位點(diǎn)，分析胎兒染色體非整倍體情況，及排除采集胎兒標(biāo)本無母體DNA污染。采用美國(guó)Affymetrix公司的單核苷酸多態(tài)性微陣列檢測(cè)平臺(tái)（Affymetrix CYTOSCAN 750K），取300 ng基因組DNA按照實(shí)驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)流程進(jìn)行酶切、連接、PCR、純化、片段化、標(biāo)記、雜交、洗滌、掃描。運(yùn)用4.2版的Chromosome Analysis Suite軟件進(jìn)行分析。結(jié)果判讀參考人類孟德爾遺傳在線數(shù)據(jù)庫(kù)（OnlineMendelian Inheritance in Man，OMIM）、DECIPHER數(shù)據(jù)庫(kù)、臨床基因組變異數(shù)據(jù)庫(kù)（Clin Var）、Database of Genomic Variants數(shù)據(jù)庫(kù)和在臨床基因組資源（clinical genome resource，ClinGen）等數(shù)據(jù)庫(kù)綜合分析。

1.2.3 二代測(cè)序 基因組DNA經(jīng)片段化、連接接頭、擴(kuò)增純化后進(jìn)行液相探針捕獲（illuminaTruSeq protocol），捕獲探針覆蓋了具有已知功能的4000種臨床致病基因，其中包含50 584個(gè)編碼區(qū)和8 421 879個(gè)堿基對(duì)。平均測(cè)序深度為300X以上，最高測(cè)序深度為500X；大于10X的覆蓋范圍占致病基因的98.9%，大于20X的覆蓋范圍占致病基因的98.5%。使用HiSeq2000測(cè)序儀（Illumina，Inc.，San Diego，CA）進(jìn)行測(cè)序。所得原始數(shù)據(jù)經(jīng)過質(zhì)檢、過濾、序列比對(duì)及變異注釋等生物信息學(xué)分析。

1.2.4 Sanger測(cè)序 根據(jù)高通量測(cè)序結(jié)果，采用Primer 5軟件設(shè)計(jì)引物，用先證者及父母外周血DNA進(jìn)行變異位點(diǎn)Sanger測(cè)序驗(yàn)證，并進(jìn)一步對(duì)孕婦胎兒是否攜帶相同位點(diǎn)進(jìn)行產(chǎn)前診斷。一代測(cè)序的結(jié)果與數(shù)據(jù)庫(kù)的序列進(jìn)行比對(duì)，確定二代測(cè)序發(fā)現(xiàn)的疑似致病變異。參考序列數(shù)據(jù)來自數(shù)據(jù)庫(kù)UCSC Genome Browser（http：∥genome.ucsc.edu），序列版本號(hào)：GRCh37／hg 19。

家系1變異，上游引物：AGGTCAGCACTCAT CATCTTG，下游引物：TGAAAGGCTGGCATTT TATC；

家系2變異，上游引物：TGTATTATAGCAG GGTCTTATTTTAAC，下游引物：ATAACATGC CAAGGAGTCCC

2 結(jié)果

2.1 羊水染色體微陣列分析及QF-PCR結(jié)果 提示胎兒染色體未出現(xiàn)非整倍體及微缺失和微重復(fù)異常。

2.2 二代測(cè)序及家系驗(yàn)證 家系1中，父母子核心家系醫(yī)學(xué)外顯測(cè)序發(fā)現(xiàn)先證者RPS6KA3基因發(fā)生變異c.1672C＞T（p.R558*），先證者父母未發(fā)現(xiàn)該變異位點(diǎn)（圖1）。家系2中，父母子核心家系醫(yī)學(xué)外顯測(cè)序發(fā)現(xiàn)先證者RPS6KA3基因發(fā)生變異c.325＋2＿325＋3insT，先證者父母未發(fā)現(xiàn)該變異位點(diǎn)。

圖1 先證者1家系的高通量測(cè)序結(jié)果（RPS6KA3基因?yàn)榉戳x鏈編碼基因）

2.3 一代測(cè)序驗(yàn)證及產(chǎn)前診斷結(jié)果 Sanger測(cè)序驗(yàn)證結(jié)果顯示，先證者1的RPS6KA3基因發(fā)生變異，c.1672C＞T（p.R558*）半合子，為無義變異（圖2）。

圖2 家系1父母子及胎兒一代測(cè)序結(jié)果（上游引物：AGGTCAGCACTCATCATCTTG，下游引物：TGAAAGGCTGGCATTTTATC）

先證者2在c.325＋2＿325＋3insT發(fā)生半合子移碼變異（圖3），先證者父親、母親及胎兒該位點(diǎn)均未發(fā)現(xiàn)先證者變異類型，兩個(gè)家系中的先證者判斷均為新發(fā)變異。對(duì)當(dāng)前胎兒均進(jìn)行了CMA檢測(cè)，結(jié)果正常，經(jīng)遺傳咨詢，先證者父母決定保留胎兒，截至該文撰稿時(shí)未發(fā)現(xiàn)異常情況。

圖3 家系2父母子及胎兒一代測(cè)序結(jié)果（上游引物：TGTATTATAGCAGGGTCTTATTTTAAC，下游引物：ATAACATGCCAAGGAGTCCC）

2.4 先證者1歲前后表型對(duì)比見表1。

表1 先證者1歲前后出現(xiàn)的表型

3 討論

對(duì)CLS病例的首次描述是Coffin等［3］在1966年完成的。此后，對(duì)該綜合征的基礎(chǔ)研究證實(shí)是由于RPS6KA3基因變異所致［1］。RPS6KA3位于X染色體短臂，含有22個(gè)外顯子，編碼產(chǎn)物為絲氨酸／蘇氨酸激酶rsk（核糖體s6激酶）家族的一個(gè)成員，該激酶包含740個(gè)氨基酸（90 kDa），共有2個(gè)不同的激酶催化結(jié)構(gòu)域，該激酶是RAS-RAF-MEK-ERK信號(hào)通路中MAP激酶ERK下游重要效應(yīng)分子之一，廣泛表達(dá)于哺乳動(dòng)物并控制細(xì)胞的生長(zhǎng)和分化，已有研究在小鼠和果蠅模型中證實(shí)了該激酶對(duì)神經(jīng)元功能的影響，這可能與CLS患兒的精神運(yùn)動(dòng)功能障礙有關(guān)［4，5］。RPS6KA3具有很強(qiáng)的等位基因異質(zhì)性，迄今已在CLS患者中鑒定出140多個(gè)不同的失活變異，其中大約30%的變異是錯(cuò)義變異，15%的為無義變異，20%的是剪接錯(cuò)誤和30%的微小缺失或插入［1］。

目前，CLS確診主要依賴于患兒臨床表現(xiàn)和分子診斷，臨床表現(xiàn)包括面部畸形（如前額突起、眼距增寬、鼻梁扁平、厚唇外翻等）、精神運(yùn)動(dòng)發(fā)育遲緩、語言聽力障礙、骨骼畸形等［1，6］。對(duì)于CLS患者來說，越早診斷對(duì)于患者的正確治療越有幫助，包括監(jiān)測(cè)某些特定并發(fā)癥和提高患兒生活質(zhì)量等方面都至關(guān)重要［1］。雖然表型對(duì)CLS的提示有很大幫助，但對(duì)臨床醫(yī)生的經(jīng)驗(yàn)要求較高，即使高度懷疑也無法做出精準(zhǔn)診斷。另一方面，在CLS患兒出生后的首年內(nèi)，大多生長(zhǎng)發(fā)育參數(shù)在正常范圍，其他體征并不明顯，也不特異，常僅伴有關(guān)節(jié)張力低下和關(guān)節(jié)松弛表現(xiàn)，并不會(huì)被注意到，這些都提高了對(duì)CLS患兒早期診斷的難度［7］。本文所描述2例先證者均在1歲后才出現(xiàn)典型的面部特征和精神運(yùn)動(dòng)發(fā)育異常（見表1）。

隨著分子技術(shù)的發(fā)展，遺傳病的診斷越來越多地采用更先進(jìn)的分子遺傳學(xué)檢測(cè)技術(shù)，可對(duì)患者進(jìn)行早期診斷和監(jiān)測(cè)。從最近幾年的CLS病例來看，多依賴高通量測(cè)序技術(shù)診斷［8-15］，也有用其他分子方法對(duì)覆蓋RPS6KA3基因區(qū)域的染色體微小重復(fù)的診斷［16，17］。

本報(bào)道描述的第一個(gè)家系中，先證者轉(zhuǎn)診到我中心時(shí)已有1歲，問診發(fā)現(xiàn)先證者在胎兒期即有表現(xiàn)出生長(zhǎng)發(fā)育小于孕周2～3周，但當(dāng)時(shí)未行進(jìn)一步的遺傳病診斷，足月出生時(shí)也無特殊異常?；純撼錾?個(gè)月后也表現(xiàn)出相關(guān)發(fā)育遲緩，未找到病因，患兒母親又再次懷孕，患者父母心理負(fù)擔(dān)極大。到本中心就診時(shí)，患兒已表現(xiàn)特殊面容明顯（眼距寬、鼻梁扁平、牙間距大），語言精神運(yùn)動(dòng)發(fā)育明顯遲緩，提示遺傳病可能性大。高通量測(cè)序及Sanger測(cè)序驗(yàn)證先證者致病基因?yàn)镽PS6KA3半合子變異，確定患兒為CLS患者，且為新發(fā)變異［c.1672C＞T（p.R558*）］（圖2）。對(duì)于二代測(cè)序結(jié)果再次咨詢后，孕婦選擇了羊水穿刺手術(shù)，利用羊水DNA對(duì)當(dāng)前胎兒RPS6KA3基因進(jìn)行了檢測(cè)，并未發(fā)現(xiàn)與先證者相同變異。同時(shí)，為排除胎兒染色體數(shù)目異常及染色體微缺失和微重復(fù)綜合征，對(duì)當(dāng)前胎兒同時(shí)進(jìn)行了快速Q(mào)F-PCR檢測(cè)及羊水染色體微陣列分析，結(jié)果均為正常。本病例中變異位點(diǎn)RPS6KA3［c.1672C＞T（p.R558*）］為無義變異，早前國(guó)外有過1例相同位點(diǎn)的報(bào)道［18］，本研究為中國(guó)人群首次報(bào)道此變異位點(diǎn)。

第二個(gè)家系中，先證者為RPS6KA31新發(fā)半合子變異（c.325＋2＿325＋3insT）（圖3），此位點(diǎn)的變異也有過報(bào)道［19］，本文為中國(guó)人群也是首次報(bào)道，家系驗(yàn)證顯示患兒為新發(fā)變異。據(jù)患兒父母提供資料顯示，該患兒出生時(shí)哭聲弱、聽力篩查未通過；4個(gè)月時(shí)顯示肌張力低下；患兒現(xiàn)4歲，主要表現(xiàn)為精神運(yùn)動(dòng)發(fā)育遲緩、特殊面容、眼距寬、鼻梁平、極重度耳聾?；純涸啻涡蓄^部MRI檢查，提示腦室增寬、腦外間隙增寬、腦萎縮等，為CLS常見表型。患兒母親因再次懷孕前來咨詢，家系驗(yàn)證顯示先證者為新發(fā)變異，同時(shí)父母選擇對(duì)本次妊娠行羊水穿刺術(shù)，利用羊水DNA對(duì)當(dāng)前胎兒RPS6KA3基因驗(yàn)證，結(jié)果顯示胎兒RPS6KA3基因未檢測(cè)到c.325＋2＿325＋3insT變異，未重復(fù)先證者基因型。對(duì)當(dāng)前胎兒同時(shí)進(jìn)行了快速Q(mào)F-PCR檢測(cè)及羊水染色體微陣列分析，結(jié)果也均為正常。

對(duì)于發(fā)現(xiàn)CLS患者家庭，先證者RPS6KA3變異來源決定了遺傳咨詢和指導(dǎo)的決策，對(duì)家庭再生育的指導(dǎo)至關(guān)重要。如患兒的變異來自攜帶者母親，該母親即存在50%風(fēng)險(xiǎn)將該變異遺傳給下一代，下一代如果是男性，則為CLS患者，如為女性，則會(huì)出現(xiàn)CLS相關(guān)發(fā)育異常高風(fēng)險(xiǎn)［1］。本研究中，通過二代測(cè)序技術(shù)，我們發(fā)現(xiàn)了2例CLS病例，通過家系驗(yàn)證并未發(fā)現(xiàn)患兒父母攜帶先證者變異，判斷2例患兒均為新發(fā)變異，夫妻目前再次生育CLS患兒風(fēng)險(xiǎn)低?？紤]到母親存在生殖腺嵌合的可能，對(duì)患兒母親再次懷孕也進(jìn)行了RPS6KA3基因產(chǎn)前診斷，均未檢測(cè)到與先證者相同變異，同時(shí)也為胎兒做出了常規(guī)的染色體微缺失微重復(fù)和常見染色體非整倍體檢測(cè)，為此2個(gè)家庭做出了關(guān)鍵的生育指導(dǎo)。近年來，二代測(cè)序技術(shù)（next generation sequencing，NGS）在罕見遺傳病領(lǐng)域的診斷在學(xué)術(shù)界已基本達(dá)成共識(shí)，在國(guó)內(nèi)外得到廣泛應(yīng)用。如果患者的表型特異性強(qiáng)，符合某一類遺傳病，可使用基因靶向測(cè)序，如耳聾基因靶向測(cè)序；但很多遺傳病，如CLS，早期表型（1歲以前）不明顯，且常規(guī)的檢測(cè)無法找到病因，可考慮用全外顯子測(cè)序或全基因組測(cè)序。