◎ 黃 英

（深圳信測標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)服務(wù)有限公司，廣東 深圳 518000）

四環(huán)素類藥物是一種廣譜抗生素，包括金霉素、土霉素、四環(huán)素、強力霉素等，對革蘭氏陰性需氧菌和厭氧菌、立克次體、螺旋體及某些原蟲等有抗菌作用，常用于預(yù)防和治療動物疾病[1]。但由于部分養(yǎng)殖人員為追求經(jīng)濟(jì)利益，不加以控制地使用四環(huán)素類藥物，導(dǎo)致藥物在動物體內(nèi)殘留，食用后直接危害到人們的身體健康[2]。為此，我國連續(xù)幾年將金霉素、土霉素、四環(huán)素、強力霉素列入食品安全風(fēng)險監(jiān)測范圍，并加大對市場流通的畜禽產(chǎn)品抽查。目前，檢測金霉素、土霉素、四環(huán)素、強力霉素的方法有微生物學(xué)法、酶聯(lián)免疫法、液相色譜法和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[3]，對比這幾種方法，液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法準(zhǔn)確度較高。本文參照國家標(biāo)準(zhǔn)[4-5]，對液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法的前處理方法和儀器采集方法作出優(yōu)化。

1 材料與方法

1.1 材料和試劑

檸檬酸、磷酸氫二鈉、乙酸乙酯，分析純，大茂化學(xué)試劑廠；乙二胺四乙酸二鈉，分析純，福晨化學(xué)試劑有限公司；甲酸，質(zhì)譜純，F(xiàn)isher；甲醇、乙腈，質(zhì)譜純，壇墨質(zhì)檢；四環(huán)素、土霉素、金霉素、強力霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液（100 μg·mL-1），農(nóng)業(yè)部環(huán)境保護(hù)科研檢測所；BRP固相萃取柱（60 mg/3 mL），月旭。

1.2 設(shè)備

AB SCIEX液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀（上海硅儀生化科技有限公司）、氮吹儀（北京恒奧德儀器儀表有限公司）、離心機(jī)（鹽城市凱特實驗儀器有限公司）、超聲機(jī)（深圳市潔盟清洗設(shè)備有限公司）、天平（上海精其儀器有限公司）、攪拌機(jī)（美的）和pH計（上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司）[4]。

1.3 方法

1.3.1 配制標(biāo)準(zhǔn)曲線濃度

取四環(huán)素、土霉素、金霉素、強力霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液各0.10 mL，用甲醇+水（1+9）定容至10 mL作為標(biāo)準(zhǔn)混合使用液。用甲醇+水（1+9）（含0.2%甲酸）稀釋標(biāo)準(zhǔn)混合使用液，配制濃度為5～250 ng·mL-1，作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.2 樣品提取

稱取均質(zhì)雞肉試樣5 g（精確至0.01 g）于50 mL離 心 管，用 約50 mL Na2EDTA-Mcllvaine緩 沖 液（0.1 mol·L-1pH=4.0）分3次冰水浴超聲提取，每次旋渦10 min，超聲提取10 min，3 200 r·min-1離心8 min，合并上清液并定容至50 mL，混勻，3 200 r·min-1離心10 min，用快速濾紙過濾（離心時溫度低于15 ℃）。

1.3.3 樣品凈化與濃縮

準(zhǔn)確吸取10 mL提取液，以1滴/s的速度過BRP固相萃取柱，待樣液完全流出后，依次用5 mL水和5 mL甲醇+水（1+19）淋洗，棄去全部流出液，減壓抽干1 min，最后用10 mL甲醇+乙酸乙酯（1+9）洗脫，洗脫液氮吹濃縮至近干，用1.0 mL甲醇+水（1+9）（含0.2%甲酸）溶解殘渣，經(jīng)0.22 μm濾膜過濾，待測定。

1.4 液質(zhì)條件

1.4.1 液相條件

色 譜 柱C18（3.0×100 mm，2.6 μm）；流 速0.35 mL·min-1；柱溫40 ℃；流動相A：0.2%甲酸水；流動相B：0.2%甲酸-甲醇；洗脫梯度：0 min 95%A，1.0 min 85%A，2.0 min 60%A，5.0 min 10%A，6.0 min 60% A，6.1 min 95%A，8.0 min 95%A。

1.4.2 質(zhì)譜條件

ESI+離子化；MRM掃描；離子源：電壓5 500 V，溫度500 ℃；碰撞氣8 psi。

2 結(jié)果與分析

2.1 前處理方法

樣品凈化使用了BRP固相萃取柱，吸附容量是C18鍵合硅膠固定相的3～10倍，相當(dāng)于Oasis? HLB固相萃取柱，可達(dá)到較好的凈化效果?？紤]到液質(zhì)方法中流動相為0.2%甲酸水和0.2%甲酸-甲醇，所以濃縮后殘渣用甲醇+水（1+9，含0.2%甲酸）溶解[5]。

2.2 色譜質(zhì)譜條件的優(yōu)化

考慮到三氟乙酸可能引起信號抑制，采用甲酸代替三氟乙酸配成0.2%甲酸水溶液作為水相。將金霉素、土霉素、四環(huán)素、強力霉素混合標(biāo)準(zhǔn)溶液注入質(zhì)譜儀中，在SIM和Product Ion模式下，得到母離子和相應(yīng)的離子碎片；在MRM模式下，優(yōu)化錐孔電壓和碰撞能量，優(yōu)化后的母離子、子離子、碰撞電壓參數(shù)見表1，其MRM色譜圖見圖1。

圖1 4種混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的MRM色譜圖

表1 四環(huán)素類藥物參數(shù)表

2.3 線性關(guān)系及檢出限

將1.3.1配制濃度在1.4與2.2條件下測定，以峰面積對應(yīng)的濃度進(jìn)行線性回歸，線性關(guān)系見表2。根據(jù)信噪比S/N≥3和S/N≥10計算檢出限和定量限分別為5 μg·kg-1、10 μg·kg-1。

表2 四環(huán)素類藥物線性方程及相關(guān)系數(shù)表

2.4 回收率及精密度

取16份雞肉樣品各5 g，分為3組，分別添加標(biāo)準(zhǔn)混合使用液0.05 mL、0.50 mL、1.00 mL 3個水平，按照1.3.2與1.3.3方法操作，在1.4與2.2條件下上機(jī)測定，計算3組濃度的回收率及精密度，結(jié)果見表3。

表3 回收率及精密度結(jié)果表

2.5 實例

2021年實驗室采用該方法對大連中食國實檢測技術(shù)有限公司進(jìn)行能力驗證，即雞肉中四環(huán)素、土霉素、金霉素和強力霉素殘留量的測定。檢測結(jié)果顯示，四 環(huán) 素 類藥物含量為0.345～1.16 mg·kg-1，RSD為0.12%～6.08%，回收率為86.15%～102.00%，Z值為-0.44～1.27，結(jié)果均為滿意。

3 結(jié)論

通過對前處理技術(shù)和儀器參數(shù)的優(yōu)化，以提高液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定雞肉中四環(huán)素類藥物殘留方法的準(zhǔn)確度。試驗結(jié)果表明，優(yōu)化后該方法可以達(dá)到準(zhǔn)確的分析效果，適用于雞肉中四環(huán)素類藥物的測定。