鈣離子信號(hào)介導(dǎo)Nod樣受體蛋白炎性小體激活的研究進(jìn)展

陳 雨，徐志猛，李 萍

（中國(guó)藥科大學(xué)天然藥物活性組分與藥效國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南京 210009）

Nod樣受體蛋白（Nod-like receptor protein 3，NLRP3）炎性小體作為重要的固有免疫組成部分，能對(duì)包括入侵病原體、宿主細(xì)胞衍生的危險(xiǎn)信號(hào)和環(huán)境刺激物在內(nèi)的各種刺激做出反應(yīng)，在機(jī)體免疫反應(yīng)發(fā)生過(guò)程中起著重要作用。NLRP3炎性小體的異常激活可導(dǎo)致多種自身炎癥或慢性炎癥疾病如阿爾茨海默病、炎癥性腸病和冷熱相關(guān)周期性綜合征的發(fā)生發(fā)展。明確NLRP3炎性小體的激活機(jī)制，對(duì)通過(guò)降低其活性而用于疾病的防治十分重要。

鈣離子作為細(xì)胞中廣泛表達(dá)的第二信使，對(duì)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)、維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)具有重要的作用。胞內(nèi)Ca2+信號(hào)控制多種細(xì)胞過(guò)程，包括增殖和分化、轉(zhuǎn)錄、細(xì)胞代謝和細(xì)胞死亡［1］。研究發(fā)現(xiàn)，在不同NLRP3炎性小體激活劑的作用下細(xì)胞都出現(xiàn)了胞漿Ca2+濃度升高的現(xiàn)象，并且抑制異常的Ca2+流動(dòng)能夠降低細(xì)胞白細(xì)胞介素1β（interleukin-1β，IL-1β）水平［2］。然而，對(duì)于Ca2+的變化如何激活NLRP3炎性小體仍存在著許多有待研究之處。本文就Ca2+在NLRP3炎性小體激活和調(diào)控中的作用進(jìn)行綜述。

1 NLRP3炎性小體的結(jié)構(gòu)和激活

1.1 NLRP3炎性小體的結(jié)構(gòu)

NLRP3炎性小體是細(xì)胞內(nèi)的大分子復(fù)合物，包括傳感器分子NLRP3、適配器凋亡相關(guān)斑點(diǎn)樣蛋白（apoptosis-associated speck-like protein containing a caspase recruitment domain，ASC）、有絲分裂激 酶NIMA相 關(guān) 激 酶7（NIMA-related kinase 7，NEK7）和效應(yīng)器蛋白酶半胱天冬酶1（cysteinedependent aspartate-specifc proteases 1，caspase-1）［3］。NLRP3包含一個(gè)N端pyrin結(jié)構(gòu)域（pyrin domain，PYD）、連接結(jié)構(gòu)NACHT以及C端負(fù)責(zé)感受刺激的亮氨酸重復(fù)序列（leucine-rich repeat，LRRs）。當(dāng)激活時(shí)，NLRP3的LRRs結(jié)構(gòu)域可與NEK7直接結(jié)合，通過(guò)其N(xiāo)端的PYD/PYD同型相互作用招募含PYD和caspase招募域（caspase activation and recruitment，CARD）的ASC，相應(yīng)地，ASC通過(guò)CARD/CARD相互作用招募含CARD域的caspase-1前體聚集［4］。同時(shí)，ASC通過(guò)PYDs寡聚形成螺旋簇狀集合［5］，即所謂的ASC斑點(diǎn)，催化無(wú)活性的caspase-1前體剪切p10、p20亞基［6］，這兩個(gè)亞基進(jìn)一步結(jié)合構(gòu)成有活性的四聚體形式，進(jìn)而活化炎癥因子IL-1β、IL-18，促進(jìn)炎癥免疫反應(yīng)［7］。此外，活化的caspase-1還可誘導(dǎo)一種新型的被稱(chēng)為“細(xì)胞焦亡”的炎性細(xì)胞死亡，這種死亡方式依賴(lài)于一種稱(chēng)為gasdermin D（GSDMD）的蛋白的N端在細(xì)胞膜上形成納米孔，導(dǎo)致細(xì)胞腫脹、釋放炎性介質(zhì)，進(jìn)一步擴(kuò)大炎癥反應(yīng)［8］。

1.2 NLRP3炎性小體的激活

無(wú)論是單獨(dú)刺激NLRP3，還是過(guò)表達(dá)NLRP3以增強(qiáng)NLRP3對(duì)刺激的敏感性，均不足以誘導(dǎo)NLRP3炎性小體激活，說(shuō)明它的激活機(jī)制較為復(fù)雜。研究發(fā)現(xiàn)，NLRP3炎性小體的激活需要兩個(gè)步驟：第一步（啟動(dòng)），通過(guò)激活核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB及其他轉(zhuǎn)錄因子，增強(qiáng)NLRP3、pro-IL-1β基因轉(zhuǎn)錄，提高其表達(dá)水平，并通過(guò)與轉(zhuǎn)錄無(wú)關(guān)的方式降低NLRP3炎性小體激活閾值；第二步（活化），當(dāng)已啟動(dòng)的細(xì)胞受到激活劑刺激時(shí)NLRP3炎性小體就會(huì)被激活。與其他模式識(shí)別受體只能感受少數(shù)幾種刺激不同，NLRP3可識(shí)別多種病原相關(guān)分子模式（pathogenassociated molecular patterns，PAMPs）和危險(xiǎn)相關(guān)分 子 模 式（danger-associated molecular patterns，DAMPs），包括病毒RNA、尿酸單鈉（monosodium urate，MSU）、細(xì)胞外ATP、離子載體尼日利亞菌素等［9］。此外，胞漿的脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）還能引起caspase-11依賴(lài)性的非經(jīng)典N(xiāo)LRP3炎性小體激活［10］。這些激活劑的相同之處在于它們都能誘導(dǎo)細(xì)胞應(yīng)激，細(xì)胞應(yīng)激被NLRP3感知，但NLRP3是如何感知細(xì)胞應(yīng)激，以及哪些通路被誘導(dǎo)最終導(dǎo)致NLRP3炎性小體激活仍有待闡明。

NLRP3炎性小體的激活包含多個(gè)上游信號(hào)，包括活性氧（reactive oxygen species，ROS）上升、鉀離子（K+）外排、溶酶體破裂、反式高爾基體網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)（trans-Golgi network，TGN）解體、線(xiàn)粒體功能障礙等。例如，降低ROS的產(chǎn)生或使用ROS清除劑均能強(qiáng)有力地降低NLRP3炎性小體激活，但是有研究表明，抑制ROS并不直接影響NLRP3炎性小體的激活，而是負(fù)調(diào)控NLRP3炎性小體激活的啟動(dòng)步驟［11］。而大多數(shù)的NLRP3炎性小體激動(dòng)劑都能引起K+外流［12］，并且單獨(dú)細(xì)胞外低鉀便足以誘導(dǎo)NLRP3炎性小體激活，其機(jī)制為鉀離子外流后導(dǎo)致NEK7與LRR結(jié)合，從而激活NLRP3炎性小體，但是有學(xué)者提出不同觀點(diǎn)，Zhang等［13］認(rèn)為其作用其實(shí)是影響靜息膜電位，而且局部免疫調(diào)節(jié)劑咪喹莫特和相關(guān)分子CL097觸發(fā)的NLRP3炎性小體激活與K+外排并無(wú)關(guān)［14］。關(guān)于溶酶體損傷導(dǎo)致的NLRP3炎性小體激活至今仍沒(méi)有較明確的機(jī)制，目前認(rèn)知僅限于通過(guò)胞吞作用引起溶酶體破裂，組織蛋白酶釋放到胞質(zhì)中，導(dǎo)致NLRP3炎性小體活化。但是，雖然溶酶體組織蛋白酶對(duì)NLRP3炎性小體激活十分重要，單獨(dú)基因敲除并未見(jiàn)顯著影響［15］。不同的NLRP3炎性小體激動(dòng)劑均會(huì)引起TGN解體，之后通過(guò)帶負(fù)電荷的磷脂酰肌醇-4-磷酸（phosphatidylinositol-4-phosphate，PtdIns4P）結(jié)合NLRP3，誘導(dǎo)銜接蛋白ASC聚合，激活下游信號(hào)傳導(dǎo)級(jí)聯(lián)［16］，但為什么NLRP3炎性小體需要在分散的反式高爾基體網(wǎng)絡(luò)上特異性組裝，目前尚不清楚。因此，在關(guān)于NLRP3炎性小體激活信號(hào)的研究上仍存在許多爭(zhēng)論。

2 鈣離子信號(hào)與NLRP3炎性小體激活

離子流在NLRP3炎性小體激活過(guò)程中具有舉足輕重的地位，而Ca2+作為調(diào)控細(xì)胞功能的一種重要離子流，其動(dòng)態(tài)平衡障礙影響許多神經(jīng)退行性疾病的發(fā)展［17］。在以NLRP3獲得性突變?yōu)樘卣鞯睦錈嵯嚓P(guān)周期綜合征（cryopyrin-associated periodic syndrome，CAPS）患者中，發(fā)現(xiàn)外周血單個(gè)核細(xì)胞內(nèi)Ca2+升高后［2］，鈣離子在NLRP3炎性小體激活過(guò)程中發(fā)揮的作用開(kāi)始被廣泛研究。

2.1 Ca2+濃度控制方式

胞質(zhì)Ca2+濃度通過(guò)Ca2+的流入和流出實(shí)現(xiàn)平衡，細(xì)胞質(zhì)Ca2+內(nèi)流有兩種主要途徑：（1）來(lái)自細(xì)胞內(nèi)存儲(chǔ)，如內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（endoplasmic reticulum，ER）和線(xiàn)粒體；（2）來(lái)自胞外液。靜息狀態(tài)下，胞外液和ER腔內(nèi)Ca2+水平維持在毫摩爾級(jí)，而細(xì)胞胞漿Ca2+水平較低，細(xì)胞質(zhì)通過(guò)質(zhì)膜鈣ATP酶（plasma membrane Ca2+ATPase，PMCA）和肌質(zhì)網(wǎng)膜鈣ATP酶（smooth endoplasmic reticular Ca2+ATPase，SERCA）轉(zhuǎn)運(yùn)體的擠壓將胞漿Ca2+濃度維持在100 nmol/L左右。另外，Na/Ca交換器（Na+/Ca2+exchanger，NCX）和Na/Ca/K交換器（Na+/Ca2+-K+exchanger，NCKX）是Ca2+的二級(jí)調(diào)節(jié)器，控制細(xì)胞內(nèi)外鈉鈣交換［18］。

刺激條件下，Ca2+信號(hào)通路激活，質(zhì)膜離子通道通過(guò)電壓變化或與配體結(jié)合觸發(fā)，造成細(xì)胞內(nèi)外鈣離子流動(dòng)變化。胞漿Ca2+激增激活Ca2+結(jié)合蛋白和各種細(xì)胞活動(dòng)。多種Ca2+可滲透通道參與細(xì)胞外Ca2+的內(nèi)流：（1）電壓門(mén)控Ca2+通道（voltagegated Ca2+channel，VOCs）：膜去極化時(shí)激活，是電興奮細(xì)胞中最主要的Ca2+流入方式；（2）受體門(mén)控通道（receptor-operated Ca2+entry，ROCs）：當(dāng)Ca2+激動(dòng)劑結(jié)合到ROC，導(dǎo)致磷脂酶C（phospholipase C，PLC）信號(hào)通路激活，ER Ca2+釋放；（3）配體門(mén)控的瞬時(shí)受體電位通道（transient receptor potential，TRP）：是非興奮性細(xì)胞主要的Ca2+流入方式，在膜和細(xì)胞器膜上多有分布，按氨基酸序列分為7個(gè)亞科：TRPC、TRPV、TRPA、TRPM、TRPML、TRPP和TRPN，并且能與Ca2+釋放激活的Ca2+通道（Ca2+release-activated Ca2+，CRAC）相互作用，控制Ca2+信號(hào)；（4）存儲(chǔ)操控通道（store-operated Ca2+entry，SOCs），如CRAC：當(dāng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)Ca2+儲(chǔ)存耗盡時(shí)，基質(zhì)相互作用分子（stromal interaction molecule，STIM）與質(zhì)膜中的Orai通道相作用，激活鈣池調(diào)控鈣離子通道（store-operated Ca2+entry，SOCE），引起細(xì)胞外Ca2+進(jìn)入，以維持細(xì)胞內(nèi)外鈣離子的動(dòng)態(tài)平衡［19］，Ca2+可滲透通道如圖1所示。

2.2 Ca2+信號(hào)在NLRP3炎性小體激活中的作用

早期研究主要是根據(jù)鈣離子螯合劑BAPTAAM抑制IL-1β分泌的能力將Ca2+流動(dòng)與NLRP3炎性小體激活聯(lián)系起來(lái)的。如Chu等［20］發(fā)現(xiàn)BAPTA-AM可 抑 制NLRP3炎性小體激活和IL-1β分泌。接著，細(xì)胞外Ca2+被證明可單獨(dú)刺激依賴(lài)于NLRP3炎性小體的IL-1β分泌。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞外Ca2+或其他NLRP3炎性小體的激動(dòng)劑可以通過(guò)鈣傳感受體（calcium-sensing receptor，CASR）和PLC之間的相互作用觸發(fā)細(xì)胞內(nèi)Ca2+信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)，繼而影響NLRP3［21］。Lee等［22］提出PLC介導(dǎo)的磷脂酰肌醇4，5-二磷酸（phosphatidylinositol 4，5-bisphosphate，PIP2）水解產(chǎn)物肌醇1，4，5-三磷酸（inositol 1，4，5-triphosphate，IP3）激活ER上的IP3受體（1，4，5-trisphosphate receptor，IP3R），進(jìn)而觸發(fā)ER Ca2+釋放和NLRP3炎性小體激活。作者還發(fā)現(xiàn)，使用PLC的抑制劑抑制了多種刺激誘導(dǎo)的IL-1β分泌，而PLC的直接激活則可在沒(méi)有任何其他刺激的情況下誘導(dǎo)NLRP3炎性小體激活。同理，敲除IP3R或藥理學(xué)抑制其表達(dá)均可減弱Ca2+流動(dòng)和NLRP3炎性小體激活。

此后，對(duì)其他多種不同結(jié)構(gòu)激活劑刺激NLRP3炎性小體激活的研究進(jìn)一步證實(shí)了Ca2+的作用。研究發(fā)現(xiàn)，腦心肌炎病毒（EMCV）通過(guò)刺激細(xì)胞內(nèi)存儲(chǔ)Ca2+釋放到細(xì)胞質(zhì)中進(jìn)而激活NLRP3炎性小體［23］。登革熱2型病毒及其非結(jié)構(gòu)蛋白2A和2B激活NLRP3炎性小體與釋放ER Ca2+有關(guān)［24］。ATP誘導(dǎo)的IL-1β釋放需要細(xì)胞外Ca2+內(nèi)流和ER介導(dǎo)的Ca2+釋放［25］。紫外線(xiàn)誘導(dǎo)的NLRP3炎性小體激活需要升高的細(xì)胞內(nèi)Ca2+［26］。膽固醇依賴(lài)性溶胞素激活NLRP3炎性小體需要Ca2+內(nèi)流，而Ca2+內(nèi)流對(duì)于植物凝集素激活NLRP3炎性小體也是必需的［27］。這表明細(xì)胞內(nèi)Ca2+信號(hào)在NLRP3炎性小體激活過(guò)程中扮演著至關(guān)重要的角色。

Figure 1 Ca2+regulation channel in cell

但是，針對(duì)Ca2+在NLRP3炎性小體激活中的作用，Katsnelson等［28］提出了不同看法，他們研究了NLRP3炎性小體激動(dòng)劑刺激下，胞漿內(nèi)鈣離子上升對(duì)小鼠原代樹(shù)突細(xì)胞、原代巨噬細(xì)胞NLRP3炎性小體激活情況和下游炎癥信號(hào)反應(yīng)的影響。首先，在內(nèi)源性ATP門(mén)控P2X7受體通道、外源性離子載體尼日利亞菌素或促溶酶體LLME激活NLRP3炎性小體過(guò)程中，胞漿Ca2+增加并不是必要條件。其次，在小鼠樹(shù)突狀細(xì)胞中，與Ca2+流動(dòng)相關(guān)的G蛋白偶聯(lián)受體的激動(dòng)劑對(duì)NLRP3炎性小體信號(hào)激活的作用被K+外排激動(dòng)劑逆轉(zhuǎn)。并且，雖然BAPTA-AM和2-APB強(qiáng)烈抑制了尼日利亞菌素誘導(dǎo)的NLRP3炎性小體信號(hào)傳導(dǎo)，但其作用機(jī)制與Ca2+穩(wěn)態(tài)無(wú)關(guān)［29］。因此，Ca2+在NLRP3炎性小體激活過(guò)程中發(fā)揮的作用仍需要進(jìn)一步探索。

2.3 NLRP3炎性小體激活過(guò)程中Ca2+信號(hào)的變化

如上所述，在NLRP3炎性小體激活過(guò)程中常伴隨著Ca2+的升高，但目前一個(gè)突出問(wèn)題是NLRP3炎性小體激活過(guò)程中增加的細(xì)胞內(nèi)Ca2+來(lái)源和機(jī)制。研究表明，在ATP/尼日利亞菌素刺激下，從細(xì)胞外進(jìn)入和細(xì)胞內(nèi)存儲(chǔ)池中釋放的Ca2+均有助于NLRP3炎性小體的活化［2］。

2.3.1 胞漿膜鈣離子通道開(kāi)放 在NLRP3炎性小體激動(dòng)劑刺激下，胞漿膜上的鈣離子通道發(fā)生變化，影響胞漿內(nèi)鈣離子濃度。鈣內(nèi)流是NLRP3炎性小體激活過(guò)程中的近端步驟，而NLRP3炎性小體的不同激活劑可能使用不同的質(zhì)膜離子通道介導(dǎo)鈣內(nèi)流：（1）激活電壓門(mén)控Ca2+通道（VOCs）：質(zhì)膜極化可調(diào)節(jié)Ca2+信號(hào)，在NLRP3激動(dòng)劑誘導(dǎo)的細(xì)胞外Ca2+進(jìn)入過(guò)程中，K+外流抵消了膜去極化作用，從而促進(jìn)Ca2+進(jìn)一步內(nèi)流［13］；（2）激活受體門(mén)控通道（ROCs）：細(xì)胞外ATP與嘌呤能受體P2X結(jié)合后，導(dǎo)致質(zhì)膜中的陽(yáng)離子滲透通道開(kāi)放，誘導(dǎo)胞質(zhì)鈣增加［30］；細(xì)胞外ADP通過(guò)P2Y1受體介導(dǎo)鈣信號(hào)，增加Ca2+流動(dòng)，并以細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶5（extracellular signal-regulated kinase 5，ERK5）依賴(lài)性方式激活NLRP3炎性小體［31］；增加的［Ca2+］ex通過(guò)G蛋白介導(dǎo)的CASR信號(hào)通路觸發(fā)單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞大胞飲［32］；（3）激活配體門(mén)控的瞬時(shí)受體電位通道（TRP）：在LPS啟動(dòng)NLRP3過(guò)程伴隨TRP通道依賴(lài)性Ca2+信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，LPS誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生第二信使甘油二酯（diacylglycerol，DAG），DAG以Toll樣受體4（Toll-like receptor 4，TLR4）依賴(lài)的方式直接激活TRPC6，TRPC6介導(dǎo)的Ca2+流入反過(guò)來(lái)激活肌球蛋白輕鏈激酶（myosin light chain kinase，MYLK），導(dǎo)致LPS/TLR4介導(dǎo)的NF-κB激活［33］。而在NLRP3激活過(guò)程中，晶體或脂質(zhì)體刺激誘導(dǎo)ROS爆發(fā)，繼而產(chǎn)生代謝物ADP-核糖，通過(guò)TRPM2通 道誘 導(dǎo)ROS依 賴(lài)的 鈣內(nèi) 流 和IL-1β釋放［34］；并且TRPM2同一家族的其他成員（TRPM7、TRPV2、TRPA1和TRPV1）也與炎性小體激活有關(guān)［35-36］。（4）激活存儲(chǔ)操控通道（SOCs）：當(dāng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)Ca2+儲(chǔ)存耗盡時(shí)，激活SOCE，引起細(xì)胞外Ca2+進(jìn)入，而抑制SOCE的主要組分STIM1、SERCA2均顯著阻礙了NLRP3炎性小體的組裝［37］。

2.3.2 細(xì)胞存儲(chǔ)的鈣離子釋放 細(xì)胞存儲(chǔ)的鈣離子也會(huì)釋放到胞漿中。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)作為細(xì)胞內(nèi)鈣離子的主要存儲(chǔ)庫(kù)，其鈣釋放對(duì)維持鈣穩(wěn)態(tài)是極其重要的，并且阻斷內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上鈣釋放通道影響NLRP3炎性小體激活。使用藥理方法抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)主要的鈣離子釋放通道IP3R可阻斷多種激活劑誘導(dǎo)的NLRP3炎性小體激活。通過(guò)阻斷其上游的PLC產(chǎn)生IP3同樣能抑制NLRP3炎性小體激活。此外，其他內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣離子釋放通道，如蘭尼堿受體（ryanodine receptor，RyR）通道開(kāi)放也能從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔釋放鈣離子［38］。溶酶體作為酸性Ca2+存儲(chǔ)體，具有一系列Ca2+可滲透通道，以允許Ca2+釋放［39］，在MSU誘導(dǎo)的NLRP3炎性小體激活模型中，往往伴隨著溶酶體膜破壞，溶酶體內(nèi)Ca2+流出［40］。

2.4 Ca2+信號(hào)促進(jìn)NLRP3炎性小體激活的機(jī)制

2.4.1 Ca2+與cAMP平衡 盡管關(guān)于Ca2+的流動(dòng)與NLRP3炎性小體激活的關(guān)系已有大量研究，但Ca2+流動(dòng)導(dǎo)致NLRP3炎性小體激活的分子機(jī)制仍存在許多空白。研究發(fā)現(xiàn)Ca2+可促進(jìn)LPS刺激的巨噬細(xì)胞游離裂解液中自發(fā)的NLRP3-ASC結(jié)合，提示Ca2+可直接調(diào)節(jié)NLRP3炎性小體的激活。但是研究并沒(méi)有闡述Ca2+如何促進(jìn)復(fù)合物形成，以及Ca2+的直接靶點(diǎn)究竟是什么。另外，研究還揭示了環(huán)磷酸腺苷（cyclic adenosine monophosphate，cAMP）生成與NLRP3激活的關(guān)系，cAMP與NLRP3直接結(jié)合抑制炎性小體組裝，而CASR激活導(dǎo)致cAMP下調(diào)，釋放被抑制的NLRP3。在CAPS患者體內(nèi)，由于存在NLRP3功能獲得性突變，cAMP與NLRP3的親和力明顯低于正常，并且通過(guò)增加cAMP能降低CAPS患者外周血單核細(xì)胞中的IL-1β。該研究有力地表明細(xì)胞內(nèi)NLRP3炎性小體的狀態(tài)取決于Ca2+與cAMP的平衡［22］。

之后的研究證實(shí)并對(duì)此發(fā)現(xiàn)進(jìn)行了補(bǔ)充。一些代謝物，如醋酸鹽可通過(guò)PLC-IP3途徑減少Ca2+流動(dòng)，并伴隨著cAMP增加，之后活化PKA，通過(guò)自噬或蛋白酶體途徑泛素化降解NLRP3，從而抑制炎性小體激活［41］。Ca2+濃度的升高也會(huì)激活下游JNK信號(hào)通路以及誘導(dǎo)后續(xù)的ASC接頭蛋白低聚。在乙醇誘導(dǎo)的神經(jīng)元細(xì)胞中，乙醇通過(guò)N-甲基-D-天冬氨酸受體（NMDA receptor，NMDAR）誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)Ca2+增加，激活鈣調(diào)蛋白依賴(lài)的蛋白激酶Ⅱ（calmodulin dependent kinase II，CAMKⅡ），之后通過(guò)激活JNK1促進(jìn)NLRP3炎性小體組裝和活化［42］。Chen等［43］首次發(fā)現(xiàn)細(xì)胞六型分泌系統(tǒng)效應(yīng)蛋白EvpP能通過(guò)抑制Ca2+依賴(lài)性MAPK-JNK通路，影響ASC低聚，阻斷NLRP3炎性小體激活。最新研究表明，細(xì)菌感染通過(guò)Ca2+結(jié)合蛋白TBC1結(jié)構(gòu)域家族成員9（Ca2+-binding protein TBC1 domain family member 9，TBC1D9）增加Ca2+水平，激活TBK1，從而促進(jìn)自噬［44］，而自噬與NLRP3炎性小體的激活密切相關(guān)［45］。

2.4.2 線(xiàn)粒體損傷Ca2+流動(dòng)激活NLRP3炎性小體的另一重要機(jī)制是通過(guò)誘導(dǎo)線(xiàn)粒體損傷。Ca2+通過(guò)線(xiàn)粒體內(nèi)膜中的線(xiàn)粒體鈣單向轉(zhuǎn)運(yùn)體（mitochondrial calcium uniporter，MCU）和線(xiàn)粒體外膜中的電壓依賴(lài)性陰離子選擇通道（voltage dependent anion selective channel，VDAC）流入線(xiàn)粒體，導(dǎo)致線(xiàn)粒體鈣超載，線(xiàn)粒體活性氧（mitochondrial reactive oxygen species，mROS）增加，線(xiàn)粒體膜電位下降，通透性轉(zhuǎn)換孔開(kāi)放，以及釋放線(xiàn)粒體DNA（mitochondrial DNA，mtDNA）和心磷脂。研究人員證實(shí)，在ATP刺激過(guò)程中，Ca2+流動(dòng)的關(guān)鍵作用就是誘導(dǎo)線(xiàn)粒體損傷，接著產(chǎn)生的mtDNA和心磷脂，經(jīng)氧化直接結(jié)合NLRP3［2］。其中細(xì)胞質(zhì)mtDNA與NLRP3共定位并增強(qiáng)IL-1β的分泌，而氧化的mtDNA進(jìn)一步誘導(dǎo)IL-1β產(chǎn)生［46］。而線(xiàn)粒體膜電位下降和通透性轉(zhuǎn)換孔開(kāi)放，釋放細(xì)胞色素c，細(xì)胞色素c通過(guò)抑制呼吸鏈復(fù)合物Ⅲ來(lái)促進(jìn)ROS產(chǎn)生，ROS一方面進(jìn)一步激活I(lǐng)P3R，另一方面通過(guò)與硫氧還原蛋白（thioredoxin-interacting protein，TXNIP）結(jié)合激活NLRP3［47］。

Ca2+流動(dòng)通過(guò)影響線(xiàn)粒體影響NLRP3炎性小體激活的機(jī)制得到了廣泛認(rèn)可。首先，從結(jié)構(gòu)上來(lái)說(shuō)，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線(xiàn)粒體的空間排列促進(jìn)了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線(xiàn)粒體之間的聯(lián)系，這對(duì)于Ca2+從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)轉(zhuǎn)移到線(xiàn)粒體和NLRP3炎性小體激活都是至關(guān)重要的［48］。其次，研究證實(shí)，多種NLRP3炎性小體激動(dòng)劑都能使線(xiàn)粒體鈣離子超載，而減少線(xiàn)粒體鈣離子能降低mROS水平，減少mtDNA產(chǎn)生，降低炎性水平［2］。Li等［49］使用高濃度葡萄糖誘導(dǎo)血管平滑肌細(xì)胞（VSMCs）糖尿病模型，發(fā)現(xiàn)該造模過(guò)程激活Ca2+信號(hào)通路，導(dǎo)致線(xiàn)粒體損傷，釋放mtDNA至胞漿，影響糖尿病小鼠NLRP3炎性小體激活和VSMCs重塑。并且，影響線(xiàn)粒體鈣離子進(jìn)入通道影響炎癥反應(yīng)已得到實(shí)驗(yàn)支持。在銅綠假單胞菌感染的原代人氣道上皮細(xì)胞模型中，由于線(xiàn)粒體Ca2+超載導(dǎo)致的線(xiàn)粒體失調(diào)促進(jìn)NLRP3炎性小體激活［50］；藥理學(xué)抑制MCU顯著改善體內(nèi)外炎癥反應(yīng)［51］。最后，Ca2+本身就控制著線(xiàn)粒體動(dòng)力學(xué)的許多方面。例如，Ca2+影響線(xiàn)粒體的能動(dòng)性，而微管驅(qū)動(dòng)的線(xiàn)粒體與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的結(jié)合是NLRP3炎性小體復(fù)合物組裝的必要條件［48］；Ca2+調(diào)控線(xiàn)粒體融合和分裂的相關(guān)過(guò)程，而線(xiàn)粒體融合的關(guān)鍵調(diào)控因子Mitofusin 2已被證明在RNA病毒感染模型中影響NLRP3炎性小體活化水平［52］；在少突膠質(zhì)細(xì)胞和阿爾茨海默病轉(zhuǎn)基因小鼠中，下調(diào)線(xiàn)粒體分裂蛋白Drp1表達(dá)極大程度上降低了NLRP3炎性小體激活和炎性反應(yīng)［53］。

2.4.3 干擾Ca2+敏感的酶 除此之外，激活或失活Ca2+敏感的酶，也能影響NLRP3炎性小體的激活。經(jīng)典的NLRP3炎性小體激活劑刺激導(dǎo)致Ca2+流動(dòng)，增加鈣蛋白酶活力，活化的鈣蛋白酶釋放被細(xì)胞骨架隔離的caspase-1，以調(diào)節(jié)NLRP3炎性小體活化，而使用不同機(jī)制的鈣蛋白酶抑制劑均能降低IL-1β水平，反之，敲除內(nèi)源性的抑制劑鈣蛋白酶抑制蛋白（CAST）增強(qiáng)IL-1β水平［13］。Ca2+信號(hào)調(diào)節(jié)NLRP3炎性小體激活的機(jī)制如圖2所示。

Figure 2 Regulation of NLRP3 inflammasome activation by Ca2+signaling

3 調(diào)控Ca2+的相關(guān)藥物及靶點(diǎn)研究現(xiàn)狀

3.1 鎮(zhèn)痛

在LPS誘導(dǎo)的炎性疼痛小鼠模型中，Yin等［54］發(fā)現(xiàn)芍藥苷可通過(guò)抑制TRPV1激活，降低細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度，抑制PKC活性，最終導(dǎo)致減少NLRP3炎性小體激活及caspase-11介導(dǎo)的非經(jīng)典細(xì)胞焦亡，起到鎮(zhèn)痛作用。

3.2 心力衰竭

最近，新型口服降糖藥物鈉/葡萄糖共轉(zhuǎn)運(yùn)體2（SGLT2）抑制劑恩格列凈和卡格列凈，已被證實(shí)與2型糖尿病患者心血管死亡和心力衰竭住院率降低相關(guān)［55-56］。恩格列凈可減輕2個(gè)無(wú)高血糖和糖尿病的心衰模型（射血分?jǐn)?shù)保持的心力衰竭HFpEF和射血分?jǐn)?shù)降低的心力衰竭HFrEF）的心功能障礙。這些有益的心臟效應(yīng)與心肌NLRP3炎性小體通路和下游細(xì)胞因子信號(hào)通路的激活減少有關(guān)。此外，研究發(fā)現(xiàn)恩格列凈以Ca2+依賴(lài)的方式減弱心肌細(xì)胞NLRP3炎性小體啟動(dòng)，這表明鈣離子穩(wěn)態(tài)在恩格列凈抗心衰過(guò)程中發(fā)揮重要作用［57］。

3.3 其他

激活配體門(mén)控的瞬時(shí)受體電位通道是藥物研發(fā)的重要靶點(diǎn)，其中TRPV4是一種廣泛表達(dá)的Ca2+通道［58］。TRPV4通過(guò)調(diào)節(jié)Ca2+進(jìn)入調(diào)節(jié)各種生理過(guò)程相關(guān)的細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)，是治療人類(lèi)疾病的一個(gè)重要靶點(diǎn)。TRPV4通過(guò)增加腦出血后的胞漿內(nèi)Ca2+觸發(fā)的炎癥反應(yīng)導(dǎo)致了小鼠神經(jīng)元死亡［59］；孟魯司特通過(guò)調(diào)節(jié)TRPV4通道抑制出血性膀胱炎大鼠模型損傷［60］。事實(shí)上，針對(duì)TRPV4拮抗劑的研究在過(guò)去的十年中蓬勃發(fā)展。據(jù)報(bào)道，超過(guò)10種獨(dú)特的化學(xué)類(lèi)型可抑制該離子通道［61］，第1個(gè)TRPV4拮抗劑GSK2798745已經(jīng)進(jìn)入臨床試驗(yàn)階段［62-63］。

4 結(jié)語(yǔ)和展望

在過(guò)去的十年中，已經(jīng)證實(shí)了Ca2+在NLRP3炎性小體激活中的關(guān)鍵作用，但關(guān)于Ca2+與NLRP3炎性小體激活的關(guān)系仍存在許多問(wèn)題有待闡明。本文綜述了Ca2+與NLRP3炎性小體激活的關(guān)系，重點(diǎn)梳理了已有的關(guān)于Ca2+流動(dòng)激活NLRP3炎性小體的機(jī)制，包括直接結(jié)合NLRP3、通過(guò)CAMKIIJNK影響ASC低聚、造成線(xiàn)粒體鈣超載引發(fā)線(xiàn)粒體失穩(wěn)和影響Ca2+敏感的酶。多種形式的細(xì)胞應(yīng)激，包括質(zhì)膜損傷、溶酶體損傷和離子失衡，都可能影響Ca2+流動(dòng)來(lái)激活NLRP3炎性小體。進(jìn)一步研究鈣離子并且了解NLRP3炎性小體激活和調(diào)控的詳細(xì)機(jī)制將進(jìn)一步促進(jìn)對(duì)炎癥的理解，并能為治療NLRP3炎性小體驅(qū)動(dòng)的炎癥性疾病提供新思路。