馮 鵬，費(fèi) 璇，陳 言，郭青龍，方偉蓉*

（1中科健康產(chǎn)業(yè)集團(tuán)有限公司，南京 210008；2中國(guó)藥科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與臨床藥學(xué)學(xué)院，南京 211198）

肝臟作為人體最大的代謝器官，參與機(jī)體蛋白質(zhì)、脂肪、維生素等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的代謝過(guò)程，一旦出現(xiàn)受損，就可能誘發(fā)一系列代謝性疾病，甚至導(dǎo)致死亡［1］。肝損傷通常是肝臟暴露于高水平毒素下的結(jié)果，這些毒素可以是酒精等化學(xué)物質(zhì)、藥物、病毒等，這與肝臟代謝功能障礙密不可分［2］。研究表明，當(dāng)肝臟出現(xiàn)受損，就會(huì)刺激肝細(xì)胞發(fā)生增殖和炎癥反應(yīng)等進(jìn)行修復(fù)；當(dāng)出現(xiàn)持續(xù)肝損傷時(shí)，可能會(huì)促進(jìn)肝組織進(jìn)行性纖維的形成，而炎癥細(xì)胞會(huì)釋放炎癥因子如腫瘤壞死因子（TNF-α）、白介素1β（IL-1β）等參與調(diào)節(jié)肝臟纖維化的形成，最終導(dǎo)致肝硬化和肝癌［3］。近些年來(lái)，肝病的發(fā)病率隨著肥胖及代謝綜合征的增加而逐年攀升，但可用于肝損傷治療的藥物很少，多依據(jù)病因進(jìn)行治療，對(duì)于病毒性肝損傷多給予核苷類似物等抗病毒藥物，對(duì)于藥源性肝損傷多以臨床對(duì)癥治療為主，雖然藥物治療以中藥為主，但其作用機(jī)制仍需進(jìn)一步探究［4］。

靈芝作為一味名貴中藥材，以子實(shí)體入藥，含有脂肪酸、多種氨基酸、三萜類、多糖類等物質(zhì)。靈芝孢子糖肽（Ganoderma lucidumspore glycopeptides，GLSG）是從靈芝子實(shí)體中經(jīng)蛋白酶酶解后醇提得到的糖肽，其主要成分有靈芝多糖、靈芝總?cè)啤㈧`芝多糖肽等［5］。靈芝多糖可以通過(guò)淋巴細(xì)胞和髓細(xì)胞喚起對(duì)腫瘤、病毒、細(xì)菌和真菌的免疫防御而發(fā)揮抗腫瘤作用［6］，通過(guò)上調(diào)B細(xì)胞和抗凋亡蛋白而最終產(chǎn)生降血糖作用等［5］。另外，有學(xué)者從靈芝子實(shí)體中提取分離得到多個(gè)靈芝三萜類化合物，并發(fā)現(xiàn)可一定程度上抑制一氧化氮的產(chǎn)生而發(fā)揮抗炎效應(yīng)［7］。有研究表明，靈芝多糖［8］、靈芝超微粉［9］、靈芝孢子油［10］、靈芝總?cè)疲?1］等可以顯著降低肝損傷模型小鼠血清中谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）和谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）活性，通過(guò)肝組織病理學(xué)切片觀察發(fā)現(xiàn)模型小鼠肝組織損傷程度明顯減輕。以上發(fā)現(xiàn)均提示靈芝中的多種有效成分具有保肝作用。

本研究建立了乙醇致小鼠急性肝損傷以及CCl4致小鼠急性和慢性肝損傷的模型，探索靈芝孢子糖肽對(duì)肝損傷的保護(hù)作用及作用機(jī)制，為靈芝孢子糖肽的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料

1.1 藥物與試劑

靈芝孢子糖肽（南京中科集團(tuán)有限公司）；水飛薊素（silymarin）膠囊（德國(guó)MEDA Pharma GmbH& Co.KG公司）；CCl4（上海中怡醫(yī)療科技有限公司）；ALT測(cè)試盒、AST測(cè)試盒（南京建成生物工程研究所）；小鼠IL-6、TNF-α和iNOS ELISA檢測(cè)試劑盒（上海酶聯(lián)生物科技有限公司）。

1.2 儀 器

電子天平（北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司）；TGL-16型低溫高速離心機(jī)（湖南湘儀實(shí)驗(yàn)儀器開(kāi)發(fā)有限公司）；酶標(biāo)儀（美國(guó)Thermo公司）。

1.3 動(dòng) 物

昆明種小白鼠，雄性，體重20~25 g，分別購(gòu)自遼寧長(zhǎng)生生物技術(shù)股份有限公司，生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（遼）2020-0001，合格證編號(hào)：2107262011-00522362；河南斯克貝斯生物科技股份有限公司，生產(chǎn)許可證：SCXK（豫）2020-0005，合格證編號(hào)：410983201100113624；飼料：顆粒飼料，由中國(guó)藥科大學(xué)動(dòng)物室供給；飼養(yǎng)條件：恒溫，18~24℃；恒濕，相對(duì)濕度70%。所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均符合動(dòng)物倫理委員會(huì)標(biāo)準(zhǔn)。

2 方法

2.1 靈芝孢子糖肽的制備方法

依據(jù)文獻(xiàn)中的提取方法并加以改良，對(duì)采收而得的靈芝孢子粉進(jìn)行低溫物理破壁處理；將破壁后的靈芝孢子粉進(jìn)行二氧化碳超臨界萃取，兩次分離后，收集油脂和脫脂破壁靈芝孢子粉；將脫脂破壁靈芝孢子粉與純凈水混合后，加堿溶液調(diào)節(jié)pH至5~10；加入酶進(jìn)行酶解，邊攪拌邊將酶解液升溫至90~100℃并保溫1~2 h，得到提取液，分離，收集澄清濾液；加入乙醇，靜置后收集沉淀；真空低溫干燥后，粉碎過(guò)篩，即得靈芝孢子糖肽粉末［12-13］。

2.2 對(duì)乙醇致小鼠急性肝損傷的影響

60只雄性昆明小鼠隨機(jī)分為6組，每組10只動(dòng)物：空白對(duì)照組、模型對(duì)照組、水飛薊素組（60 mg/kg）、靈芝孢子糖肽低劑量（65 mg/kg）、中劑量（130 mg/kg）、高劑量（260 mg/kg）組。各組灌胃給予相應(yīng)的藥物，空白對(duì)照組和模型對(duì)照組每天灌胃等體積CMC-Na，給藥體積為0.01 mL/g，每日1次，連續(xù)14 d。從灌胃給藥第4天開(kāi)始，給藥1 h后，除空白對(duì)照組外，各組飲用水更換為5%乙醇水溶液；給藥第14天上午8點(diǎn)至9點(diǎn)，除空白對(duì)照組外，其余各組均按20 mL/kg的劑量灌胃31.5%乙醇水溶液［14］。9 h后，腹腔注射水合氯醛（400 mg/kg）麻醉，摘眼球取血，靜置2 h后，4℃3 500 r/min離心10 min，分離血清，測(cè)定ALT和AST含量。小鼠處死后置于冰上迅速開(kāi)腹，剖取肝臟，稱重記錄，計(jì)算肝指數(shù)（肝濕重/體重×100%）。

2.3 對(duì)CCl4致小鼠急性肝損傷的影響

60只雄性昆明小鼠隨機(jī)均分為6組：空白組、模型組、水飛薊素組（60 mg/kg）、靈芝孢子糖肽低劑量（65 mg/kg）、中劑量（130 mg/kg）、高劑量（260 mg/kg）組。各組灌胃給予相應(yīng)的藥物，空白組和模型組每天灌胃等體積CMC-Na，給藥體積為0.01 mL/g，每日1次，連續(xù)14 d。各組末次給藥1 h后，除空白組外，其余各組均按10 mL/kg的劑量腹腔注射0.5%CCl4大豆油溶液［15］。24 h后，腹腔注射水合氯醛（400 mg/kg）麻醉，摘眼球取血，靜置2 h后，4℃3 500 r/min離心10 min，分離血清，測(cè)定ALT和AST含量。小鼠處死后置于冰上迅速開(kāi)腹，剖取肝臟，稱重記錄，計(jì)算肝指數(shù)。

2.4 對(duì)CCl4致小鼠慢性肝損傷的影響

60只雄性昆明小鼠隨機(jī)均分為6組：空白組、模型組、水飛薊素組（60 mg/kg）、靈芝孢子糖肽低劑量（65 mg/kg）、中劑量（130 mg/kg）、高劑量（260 mg/kg）組。除空白對(duì)照組外，其余所有小鼠腹腔注射0.1% CCl4大豆油溶液（10 mL/kg），每周2次，連續(xù)6周［16］；各組灌胃給予相應(yīng)的藥物，空白和模型組每天灌胃給予等體積CMC-Na，給藥體積為0.01 mL/g，每日1次，連續(xù)給藥6周。24 h后，腹腔注射水合氯醛（400 mg/kg）麻醉，摘眼球取血，靜置2 h后，4℃3 500 r/min離心10 min，分離血清，測(cè)定ALT和AST含量。小鼠處死后置于冰上迅速開(kāi)腹，剖取肝臟，稱重記錄，計(jì)算肝指數(shù)。

將肝臟左葉固定、脫水、石蠟包埋、切片，蘇木精-伊紅（HE）染色后于光學(xué)顯微鏡下觀察小鼠肝臟病理改變并進(jìn)行病理學(xué)評(píng)分［17］，肝臟剩余部分按每克肝組織加入生理鹽水9 mL勻漿后，根據(jù)ELISA試劑盒方法，檢測(cè)肝組織炎癥因子IL-6、TNF-α、iNOS含量。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)軟件為SPSS 22.0，多組間比較方差齊性時(shí)采用單因素方差分析進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，兩兩比較；采用ANOVA檢驗(yàn)，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，P<0.05表示有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 靈芝孢子糖肽對(duì)乙醇致小鼠急性肝損傷的影響

與空白組相比，乙醇模型組小鼠的體重、肝指數(shù)、血清AST和ALT含量明顯升高（P<0.01）。與乙醇模型組相比，靈芝孢子糖肽給藥14 d，低、中、高劑量組和水飛薊素組均可顯著降低肝損傷小鼠肝指數(shù)、血清AST和ALT含量（P<0.01）。結(jié)果見(jiàn)表1。

Table 1 Effects of Ganoderma lucidum spore glycopeptides(GLSG)on weight,liver index,serum AST and ALT in mice with acute liver injury induced by ethanol(±s,,n=10)

Table 1 Effects of Ganoderma lucidum spore glycopeptides(GLSG)on weight,liver index,serum AST and ALT in mice with acute liver injury induced by ethanol(±s,,n=10)

AST:Aspartate aminotransferase;ALT:Alanine aminotransferase*P<0.05,**P<0.01 vs model group

Group Control Model Silymarin GLSG Dosage/（mg/kg）60 65 130 260 Liver index/%4.59±0.23**5.70±0.37 4.60±0.40**4.90±0.53**4.76±0.39**4.65±0.27**AST/（U/L）23.74±5.65**172.27±33.74 74.42±7.38**105.23±8.45**94.87±10.66**73.97±8.77**ALT/（U/L）3.11±0.96**120.42±6.36 44.83±2.81**75.88±5.35**70.33±3.05**50.45±3.56**

3.2 對(duì)CCl4致小鼠急性肝損傷的影響

與空白組相比，CCl4致急性肝損傷模型組小鼠的肝指數(shù)、血清AST和ALT含量明顯升高（P<0.01）。與模型組相比，靈芝孢子糖肽低、中、高劑量組和水飛薊素組均可顯著降低小鼠的肝指數(shù)、血清AST和ALT含量（P<0.01）。結(jié)果見(jiàn)表2。

3.3 對(duì)CCl4致小鼠慢性肝損傷的影響

與空白組相比，CCl4致慢性肝損傷模型組小鼠的肝指數(shù)、血清AST和ALT含量明顯升高（P<0.01）。與模型組相比，靈芝孢子糖肽中、高劑量組和水飛薊素組均可顯著降低小鼠肝指數(shù)和血清AST（P<0.05）；靈芝孢子糖肽低、中、高 劑量組和水飛薊素組均可顯著降低小鼠血清ALT含量（P<0.05，P<0.01）。結(jié)果見(jiàn)表3。肝臟HE染色結(jié)果（圖1）所示，空白組肝小葉結(jié)構(gòu)正常，肝細(xì)胞條索樣分布，無(wú)腫脹變性。模型組肝細(xì)胞腫脹，呈脂肪變性和氣球樣變性，炎細(xì)胞呈局灶性浸潤(rùn)，病理評(píng)分較空白組顯著升高（P<0.01）。水飛薊素組中肝組織可見(jiàn)炎性細(xì)胞灶性分布，有小部分細(xì)胞呈氣球樣變，病理評(píng)分較模型組顯著降低（P<0.01）。靈芝孢子糖肽低、中、高劑量組則未見(jiàn)明顯的脂肪變性，肝細(xì)胞氣球樣變或炎性病灶減少，病理評(píng)分較模型組顯著降低（P<0.05，P<0.01）。病理評(píng)分結(jié)果見(jiàn)表4。與空白組相比，模型組肝組織勻漿IL-6、TNF-α和iNOS含量明顯升高（P<0.01）。與模型組相比，靈芝孢子糖肽低、中、高劑量組和水飛薊素組均可顯著降低IL-6、TNF-α含量（P<0.05，P<0.01），靈芝孢子糖肽中、高劑量組和水飛薊素組顯著降低iNOS含量（P<0.01）。結(jié)果見(jiàn)表5。

Table 2 Effects of GLSG on weight,liver index,serum AST and ALT in mice with acute liver injury induced by CCl4(±s,,n=10)

Table 2 Effects of GLSG on weight,liver index,serum AST and ALT in mice with acute liver injury induced by CCl4(±s,,n=10)

**P<0.01 vs model group

Group Control Model Silymarin GLSG Dosage/（mg/kg）60 65 130 260 Liver index/%3.96±0.17**6.44±1.23 4.00±0.18**4.43±0.33**4.40±0.37**4.07±0.39**AST/（U/L）9.54±0.34**42.45±2.66 15.47±1.38**30.34±3.37**26.55±2.78**22.76±0.98**ALT/（U/L）2.38±1.05**55.99±4.28 3.45±0.96**25.20±2.43**10.27±0.72**3.01±0.76**

Table 3 Effects of GLSG on liver index,serum AST and ALT in mice with chronic liver injury induced by CCl4(±s,,n=10)

Table 3 Effects of GLSG on liver index,serum AST and ALT in mice with chronic liver injury induced by CCl4(±s,,n=10)

*P<0.05,**P<0.01 vs model group

Group Control Model Silymarin GLSG Dosage/（mg/kg）60 65 130 260 Liver index/%3.98±0.17**6.03±0.39 4.07±0.38*4.80±0.81 4.44±0.46*4.23±0.24*AST/（U/L）32.49±8.88**103.95±30.18 58.21±13.78*89.65±16.50 75.52±12.85*62.13±10.29*ALT/（U/L）0.75±0.27**83.54±7.74 38.40±4.06**62.54±4.17*56.42±11.04*47.37±5.25**

Figure 1 Liver histopathological characteristics of mice with chronic liver injury induced by CCl4（×200）

Table 4 Effects of GLSG on liver histopathological score in mice with chronic liver injury induced by CCl4(±s,,n=6)

Table 4 Effects of GLSG on liver histopathological score in mice with chronic liver injury induced by CCl4(±s,,n=6)

*P<0.05,**P<0.01 vs model group

Group Control Model Silymarin GLSG Dosage/（mL/kg）60 65 130 260 Score 0.00±0.00**6.50±0.55 1.33±0.42**4.17±0.31*2.00±0.37**1.50±0.22**

4 討論

目前，臨床上肝病治療仍是一大難題。一方面，肝臟中存在大量代謝酶，參與機(jī)體營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的代謝過(guò)程，藥物可因代謝問(wèn)題在肝臟蓄積而致毒；另一方面，可用于治療的藥物十分短缺，藥物治療仍以中藥及復(fù)方居多。但由于中藥成分復(fù)雜，作用機(jī)制不明確，若使用不當(dāng)，也可造成肝損傷［18］。因此，迫切需要尋找安全有效的治療肝損傷的中藥。

Table 5 Effects of GLSG on liver IL-6,TNF-αand iNOS in mice with chronic liver injury induced by CCl4(±s,,n=6)

Table 5 Effects of GLSG on liver IL-6,TNF-αand iNOS in mice with chronic liver injury induced by CCl4(±s,,n=6)

*P<0.05,**P<0.01 vs model group

Group Control Model Silymarin GLSG Dosage/（mg/kg）60 65 130 260 IL-6/（ng/g）549.67±32.94**977.26±63.15 672.96±112.53**840.70±87.99**780.47±45.45**724.92±38.91**TNF-α/（ng/g）2812.31±634.00**5042.47±454.89 3481.61±516.39**4373.53±270.56*3730.50±224.90**3488.37±357.10**iNOS/（ng/g）137.35±19.26**229.81±20.67 155.09±20.83**194.62±20.38 173.95±11.83**169.67±15.73**

靈芝孢子是靈芝子實(shí)體在成熟期集中噴發(fā)后采收制備而成的棕褐色固體粉末［19］，目前已被浙江、安徽等省份列入中藥炮制規(guī)范品種。靈芝孢子粉及其提取物目前也是研究開(kāi)發(fā)的熱點(diǎn)之一。以靈芝孢子為原料，經(jīng)過(guò)破壁脫脂、水提、醇沉等工藝制備而成的靈芝孢子糖肽［12，20］，是靈芝孢子中提取富集的有效部位群，其多糖含量大于等于40%，多肽含量大于等于20%，同時(shí)包含幾丁質(zhì)、纖維素等成分。目前，有多篇文獻(xiàn)報(bào)道來(lái)源于靈芝子實(shí)體的靈芝多糖肽的藥理活性廣泛，其針對(duì)抗腫瘤［21］、護(hù)肝［22］、心臟血管疾病預(yù)防及治療［23］等領(lǐng)域，具有很好的功效，而且安全性高，未發(fā)現(xiàn)不良反應(yīng)。靈芝孢子與靈芝子實(shí)體的活性物質(zhì)相似，而且靈芝孢子糖肽與靈芝多糖肽的制備工藝高度相似。因此，可以推斷靈芝孢子糖肽可能具有與靈芝多糖肽相似的藥理活性，當(dāng)前關(guān)于靈芝孢子糖肽的研究報(bào)道較少，值得進(jìn)一步深入研究。

本研究建立乙醇致小鼠急性肝損傷以及CCl4致小鼠急性和慢性肝損傷的模型，各模型組小鼠體內(nèi)肝指數(shù)、AST和ALT含量顯著增加，灌胃給予低、中、高劑量的靈芝孢子糖肽顯著降低3種肝損傷模型小鼠的肝指數(shù)、血清ALT和AST含量，減少肝細(xì)胞脂肪變性、炎性病灶及氣球樣變減少，改善肝臟組織病理學(xué)損傷。以上結(jié)果提示靈芝孢子糖肽具有保肝活性，對(duì)該品種的深入研究具有良好的市場(chǎng)前景。

肝損傷往往伴隨炎癥反應(yīng)的發(fā)生，結(jié)果表明靈芝孢子糖肽可以顯著降低CCl4致慢性肝損傷小鼠肝組織勻漿炎癥因子IL-6、TNF-α和iNOS含量，說(shuō)明靈芝孢子糖肽可能通過(guò)抑制炎癥反應(yīng)而降低肝損傷，從而發(fā)揮保肝作用。

本研究應(yīng)用3種肝損傷模型對(duì)靈芝孢子糖肽的護(hù)肝、抗炎活性進(jìn)行了基礎(chǔ)藥效學(xué)的研究，結(jié)果表明靈芝孢子糖肽可能通過(guò)抑制炎癥反應(yīng)發(fā)揮保肝作用，具體的分子機(jī)制仍需進(jìn)一步探討。