王麗新，姜修博，郭巧珍，王籽橙，王 勃，王玉霞，瞿文生*，段小濤**

（1天津大學(xué)化工學(xué)院，天津 300350；2軍事醫(yī)學(xué)研究院毒物藥物研究所，抗毒藥物與毒理學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100850；3南京工業(yè)大學(xué)生物與制藥工程學(xué)院，南京 211800）

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，在我國(guó)占比惡性腫瘤的7%～10%，并呈逐年上升趨勢(shì)。到2020年，乳腺癌的新增病例數(shù)達(dá)到了270萬(wàn)［1］。乳腺癌主要分為三陰型、HER2/neu陽(yáng)性、Luminal A和Luminal B 4種亞型［2］。乳腺癌的轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致患者預(yù)后不良的重要因素。現(xiàn)在已知的乳腺癌轉(zhuǎn)移類型有如下3種：局部擴(kuò)展、淋巴轉(zhuǎn)移、血運(yùn)轉(zhuǎn)移。目前針對(duì)轉(zhuǎn)移并無(wú)特效治療手段，因此，尋找新的控制乳腺癌轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵基因，掌握特定蛋白在乳腺癌轉(zhuǎn)移中的作用機(jī)制，明確轉(zhuǎn)移相關(guān)的分子靶標(biāo)，對(duì)于乳腺癌臨床治療具有重要意義。

9次跨膜超家族蛋白2（transmembrane 9 superfamily protein member 2，TM9SF2）具有9個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域，在整個(gè)進(jìn)化過程中保守［3-4］，研究表明TM9蛋白可能在吞噬、黏附和營(yíng)養(yǎng)吸收中發(fā)揮關(guān)鍵作用［5-7］，其中TM9SF1的表達(dá)與膀胱癌呈正相關(guān)［8］，TM9SF4的過表達(dá)與腫瘤轉(zhuǎn)移表型正相關(guān)［9-11］。TM9SF2在各種分型的乳腺癌（MCF-7、T-47D、SKBR-3、ZR-75-1、MDA-MB-231、MDA-MB-435、MDAMB-134）細(xì)胞系中均有表達(dá)，而在正常細(xì)胞中表達(dá)量較低［12］。通過對(duì)腫瘤基因組圖譜數(shù)據(jù)（TCGA）進(jìn)行分析，約35%的大腸癌患者TM9SF2的mRNA水平升高［13］。另有研究發(fā)現(xiàn)，長(zhǎng)的基因間非編碼RNA 01232（LINC01232）通過調(diào)節(jié)TM9SF2在胰腺癌中發(fā)揮致癌活性［14］。通過乳腺癌整合數(shù)據(jù)分析平臺(tái)（breast cancer integrative platform，BCIP）分析TM9SF2 mRNA的表達(dá)水平在癌旁組織和乳腺癌組織中的差異，結(jié)果發(fā)現(xiàn)TM9SF2的mRNA水平在腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)量比在正常細(xì)胞中高［15］。本研究對(duì)三陰性乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞株中TM9SF2的蛋白表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè)，并通過靶向沉默TM9SF2，探究TM9SF2對(duì)三陰性乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231的增殖和轉(zhuǎn)移能力的影響，并進(jìn)一步探討了TM9SF2調(diào)控三陰性乳腺癌的分子機(jī)制。

1 材料

1.1 試 劑

DMEM培養(yǎng)基（德國(guó)Sigma公司）；胎牛血清、胰酶、磷酸鹽緩沖液（PBS）（美國(guó)Gibco公司）；Lipofectamine-iMAX（美國(guó)Invitrogen公司）；苯甲基磺酰氟（PMSF）、蛋白酶抑制劑、磷酸酶抑制劑（Phostop）（美國(guó)Selleck公司）；Bradford蛋白定量試劑盒（美國(guó)Thermo公司）；兔抗人TM9SF2（美國(guó)Abcam公 司）；兔 抗 人Snail、Slug、N-cadherin、PI3K、p-AKT、ERK、SRC、GAPDH、兔二抗（美國(guó)CST公司）、聚偏二氟乙烯膜（PVDF，美國(guó)Millipore公司）。

1.2 儀 器

酶標(biāo)儀、細(xì)胞培養(yǎng)箱、水平離心機(jī)、高速低溫離心機(jī)（美國(guó)Thermo公司）；顯微圖像采集系統(tǒng)、電泳儀、電轉(zhuǎn)儀（美國(guó)Bio-Rad公司）；微量移液器（德國(guó)Eppendorf公司）。

1.3 細(xì) 胞

人乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-231、非致瘤的乳腺上皮細(xì)胞株MCF-10A購(gòu)自美國(guó)模式培養(yǎng)物集存庫(kù)（ATCC），由軍事科學(xué)院軍事醫(yī)學(xué)研究院毒物藥物研究所保存。

2 方法

2.1 siRNA合成

本研究用到的siRNA的核酸序列如表1所示，由廣州銳博生物科技有限公司進(jìn)行設(shè)計(jì)并合成。

Table 1 siRNA Sequence

2.2 細(xì)胞培養(yǎng)

用DMEM完全培養(yǎng)基（含有10%胎牛血清和1%青鏈霉素）在37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)細(xì)胞，細(xì)胞融合率達(dá)90%及以上，用胰蛋白酶消化，人乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-231的傳代比例一般為1∶3，非致瘤的乳腺上皮細(xì)胞株MCF-10A一般按照1∶2的比例傳代。

2.3 敲低TM9SF2基因

將MDA-MB-231細(xì)胞以每毫升1×105個(gè)細(xì)胞的密度接種于6孔板，每孔2 mL，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h，待細(xì)胞融合率達(dá)35%左右，對(duì)MDAMB-231細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)。將轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine-iMAX 4μL與opti-MEM培養(yǎng)基100μL混合，同時(shí)將2μmol/L siRNA儲(chǔ)存液加入opti-MEM 100μL混合，5 min后，將兩者混勻，室溫放置15 min后滴加到相應(yīng)孔板中，培養(yǎng)6 h后換培養(yǎng)液，48 h后可進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.4 MTS法檢測(cè)增殖活性

MDA-MB-231細(xì)胞經(jīng)siRNA轉(zhuǎn)染48 h后，進(jìn)行消化，再用DMEM完全培養(yǎng)基混懸，對(duì)每組轉(zhuǎn)染序列的細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，并調(diào)整每組細(xì)胞的濃度為每毫升1×105個(gè)細(xì)胞，接種到96孔板進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，每孔加細(xì)胞懸液100μL，搖晃孔板使細(xì)胞分布均勻，在37℃、5%CO2條件下進(jìn)行培養(yǎng)，在接種后的12，24，48，72，96 h，每孔細(xì)胞加入MTS溶液20μL，輕晃使其分布均勻，繼續(xù)37℃孵箱內(nèi)孵育培養(yǎng)2 h，酶標(biāo)儀檢測(cè)570 nm波長(zhǎng)處的吸收度，根據(jù)吸收度制作細(xì)胞的對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)曲線。

2.5 Transwell小室侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)轉(zhuǎn)移能力

MDA-MB-231細(xì)胞經(jīng)siRNA轉(zhuǎn)染48 h后，進(jìn)行消化，再用無(wú)血清DMEM培養(yǎng)基混懸，對(duì)每組轉(zhuǎn)染序列的細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，并調(diào)整每組細(xì)胞的濃度為每毫升2.5×104個(gè)細(xì)胞，在Transwell小室的下層孔中加入DMEM完全培養(yǎng)基800μL，在上室加入混勻的細(xì)胞懸液200μL，置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)36~48 h，用4%多聚甲醛固定20 min，1%結(jié)晶紫染色1 h后，用棉簽小心擦去膜上面的細(xì)胞，在顯微鏡下觀察細(xì)胞染色情況，用顯微圖像采集系統(tǒng)進(jìn)行拍照。

2.6 劃痕愈合遷移實(shí)驗(yàn)檢測(cè)轉(zhuǎn)移能力

siRNA轉(zhuǎn) 染MDA-MB-231細(xì) 胞48 h后，利 用10μL槍頭在細(xì)胞層中形成劃痕，生理鹽水洗去漂浮細(xì)胞，更換無(wú)血清培養(yǎng)基，于0 h，24 h在顯微鏡下觀察細(xì)胞遷移情況，并隨機(jī)選取3處進(jìn)行拍照。每組轉(zhuǎn)染序列設(shè)3個(gè)復(fù)孔。

2.7 Western blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)相關(guān)蛋白的表達(dá)情況

MDA-MB-231細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h后，收集細(xì)胞，用RIPA裂解液（含有PMSF、protease inhibitor cocktail、phostop）進(jìn)行蛋白提取，加上樣緩沖液，100℃煮沸15 min，用10% SDS-PAGE電泳分離蛋白，再轉(zhuǎn)印至PVDF膜上，將PVDF膜放在用TBST配制的含5%脫脂牛奶溶液中室溫封閉1 h，再分別加入相應(yīng)一抗，4℃過夜，次日以TBST洗滌3次，加入二抗，室溫孵育1 h，TBST洗滌3次，定影顯色，用GAPDH作內(nèi)參對(duì)照，檢測(cè)不同轉(zhuǎn)染組別的MDAMB-231細(xì)胞的蛋白表達(dá)情況。

2.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)使用Graph Pad Prism 5統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)及圖像處理。采用單因素方差分析，以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 TM9SF2在MDA-MB-231細(xì) 胞 和MCF-10A細(xì)胞的表達(dá)量差異

體外培養(yǎng)三陰性細(xì)胞株MDA-MB-231以及非致瘤的乳腺上皮細(xì)胞株MCF-10A，采用Western blot檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)TM9SF2蛋白表達(dá)情況，結(jié)果表明TM9SF2在MDA-MB-231中的表達(dá)量明顯高于MCF-10A（圖1）。結(jié)果證明，TM9SF2在惡性和轉(zhuǎn)移程度都較高的MDA-MB-231中高表達(dá)。

Figure 1 MCF-10A cells had lower expression of TM9SF2 than MDAMB-231 cells

3.2 敲低TM9SF2的效率驗(yàn)證

用siNC、siTM9SF2（1、2、3序列）轉(zhuǎn)染乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231，細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h后，Western blot檢測(cè)結(jié)果（圖2）顯示，與對(duì)照組相比，轉(zhuǎn)染了siTM9SF2（1、2、3序列）的細(xì)胞中TM9SF2的蛋白表達(dá)水平明顯下調(diào)。

Figure 2 Gene silencing efficiency in MDA-MB-231 cells

3.3 敲低TM9SF2對(duì)細(xì)胞增殖能力的影響

MTS檢測(cè)結(jié)果顯示：在細(xì)胞貼壁的0、24、48、72和96 h用MTS試劑盒檢測(cè)細(xì)胞增殖活性，敲低TM9SF2的細(xì)胞增殖活性明顯低于對(duì)照組（圖3），提示敲低TM9SF2抑制MDA-MB-231的增殖能力。

Figure 3 Effects of silencing the TM9SF2 gene on proliferation of MDA-MB-231 cell lines（±s,,n=3）

3.4 敲低TM9SF2對(duì)細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力的影響

Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，敲除TM9SF2的細(xì)胞轉(zhuǎn)移數(shù)顯著減少（圖4-A），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖4-B）。劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，敲低TM9SF2的細(xì)胞劃痕間隙變化降低（圖4-C）。

Figure 4 Effects of silencing TM9SF2 on migration in MDA-MB-231 cell lines

3.5 敲低TM9SF2后相關(guān)信號(hào)通路的變化

Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，敲低TM9SF2可下調(diào)PI3K蛋白表達(dá)；并影響AKT蛋白磷酸化激活（圖5-A），而對(duì)于SRC與ERK通路影響較小。提示TM9SF2主要通過PI3K-AKT通路，調(diào)控三陰性乳腺癌的增殖。敲低TM9SF2后Snail、Slug和N-cadherin在蛋白水平表達(dá)均出現(xiàn)明顯下調(diào)（圖5-B），這些是EMT通路的重要轉(zhuǎn)錄因子和相關(guān)蛋白，由此表明敲低TM9SF2影響EMT過程進(jìn)而影響MDA-MB-231的轉(zhuǎn)移。

4 討論

本實(shí)驗(yàn)通過對(duì)高表達(dá)TM9SF2的MDA-MB-231細(xì)胞進(jìn)行基因沉默，檢測(cè)細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移能力的變化，結(jié)果表明，TM9SF2在MDA-MB-231細(xì)胞中發(fā)揮了促進(jìn)增殖和轉(zhuǎn)移的作用。接下來的實(shí)驗(yàn)可以采用Transwell小孔鋪人工基底膜膠（Matrigel）進(jìn)一步檢測(cè)TM9SF2是否對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞的侵襲產(chǎn)生影響。實(shí)驗(yàn)后續(xù)通過對(duì)其分子機(jī)制的研究，發(fā)現(xiàn)敲低TM9SF2可下調(diào)PI3K的表達(dá)，抑制下游AKT磷酸化的發(fā)生，但并不顯著影響SRC和ERK的表達(dá)。PI3K-AKT信號(hào)通路在多種細(xì)胞功能（例如細(xì)胞存活、生長(zhǎng)、增殖和代謝）中起著至關(guān)重要的作用，在許多人類腫瘤中均被異常激活［16］。TM9SF2特異性通過PI3K-AKT通路影響三陰性乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-231的增殖。由此說明可以通過降低TM9SF2的表達(dá)來抑制三陰性乳腺癌的增殖。但是具體通過PI3K-AKT通路的哪個(gè)分子對(duì)增殖產(chǎn)生影響并未十分明確，而且PI3K-AKT也會(huì)對(duì)腫瘤細(xì)胞的遷移、黏附、腫瘤血管生成以及細(xì)胞外基質(zhì)的降解等過程產(chǎn)生影響，所以對(duì)TM9SF2促進(jìn)腫瘤增殖的具體分子機(jī)制還有待進(jìn)一步的探究。Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果還證明，TM9SF2通過上調(diào)EMT通路的重要轉(zhuǎn)錄因子Snail、Slug和通路的相關(guān)蛋白N-cadherin來增強(qiáng)細(xì)胞的轉(zhuǎn)移能力。因此，通過抑制TM9SF2基因發(fā)揮生物作用可以減少三陰性乳腺癌細(xì)胞進(jìn)行EMT過程，這一過程可能發(fā)生在腫瘤產(chǎn)生早期，因此通過對(duì)TM9SF2基因表達(dá)的控制有助于患者降低遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移發(fā)生概率，從而提高患者預(yù)后的生存質(zhì)量。

Figure 5 Effects of silencing the TM9SF2 gene on the expressions of protein related to proliferation(A)and metastasis(B)in MDA-MB-231 cell lines

TM9SF2調(diào)控三陰性乳腺癌的作用機(jī)制以及TM9SF2在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中起到的作用有待進(jìn)一步深入研究。