張 艷，江振洲*，張陸勇，2**

（1中國藥科大學藥物科學研究院新藥篩選中心，南京 210009；2廣東藥科大學新藥研發(fā)中心，廣州 510006）

中藥補骨脂是豆科植物補骨脂的干燥成熟果實，具有抗腫瘤（如肝癌、乳腺癌、胃癌等）、治療骨質疏松和銀屑病等多種功效［1］，主要含有香豆素、單萜酚、黃酮、苯并呋喃類等活性成分［2］，補骨脂素（psoralen，PSO）屬于其中的呋喃香豆素類化合物［3］。香豆素類化合物進入機體后，分布于心、肝、肺、脾等組織中，然后主要在肝中代謝［4］。

由于環(huán)境因素與人們生活方式的改變，肝病的發(fā)病率呈現(xiàn)逐年上升趨勢，其中化學性肝損傷是常見的病因［5-6］。四氯化碳（carbon tetrachloride，CCl4）誘發(fā)的急性肝損傷是經(jīng)典的化學性肝損傷模型，其病理進程與某些人類肝臟疾病類似，故是保肝藥物藥效評價的常用動物模型［7］。

CYP2E1是細胞色素P450的重要亞型，占肝中總CYP450含量的5%～7%，是肝組織中氯代烴類化合物的主要代謝酶，可以代謝產生有毒或反應性中間體，與多種肝臟疾病的發(fā)病機制有關［8］。

目前關于補骨脂素治療肝臟疾病的報道主要集中在改善肝細胞脂肪變性、抗肝癌以及抗肝纖維化作用方面［9-12］，而對于急性肝損傷藥效作用的研究很少。本研究旨在探究補骨脂素對于CCl4致急性肝損傷的改善作用以及可能機制，以期為補骨脂素及補骨脂藥材的臨床應用提供理論依據(jù)。

1 材料

1.1 藥品與試劑

補骨脂素（批號JZ18071201，純度大于98%，南京景竹生物科技有限公司）；烯丙基化硫（diallyl sulfide，DAS，美國Sigma公司）；CCl4（AR級，上海凌峰化學試劑有限公司）；RIPA裂解液、BCA蛋白濃度測定試劑盒（上海碧云天生物技術研究所）；總RNA提取試劑，HiScript?Q RT SuperMix for qPCR（+gDNA wiper）逆轉錄試劑盒，AceQ?qPCR SYBR?Green Master Mix DNA擴增試劑盒（南京諾唯贊生物科技有限公司）；GAPDH抗體（美國Proteintech公司）；CYP2E1抗體（英國Abcam公司）。ALT、AST血生化試劑盒（南京威特曼生物科技有限公司）。所用引物由上海英濰捷基公司合成。

1.2 儀 器

BT25S分析天平（德國Sartorius公司）；Legend Micro 21R低溫離心機，Varioskan Lux多功能微孔板讀數(shù)儀，Nanodrop ND-2000超微量核酸蛋白測定儀，Applied Biosystems StepOneTM實時熒光定量PCR儀（美國Thermo公司）；TL系列中高通量組織細胞研磨破碎儀（北京鼎昊源科技有限公司）；D1100-230V恒溫金屬?。绹鳯abnet公司）；Power-Pac?HC電泳儀電源，Gel Doc XR+凝膠成像儀（美國Bio-Rad公司）；BX53生物顯微鏡（日本Olympus公司）。

1.3 動 物

SPF級雌性C57BL/6J小鼠，6～8周齡，體重18~22 g，購自上海靈暢生物技術有限公司，生產許可證號SCXK（滬）2018-0003。所有動物實驗均符合動物倫理委員會標準。

2 方法

2.1 造模及給藥方法

48只雌性C57BL/6J小鼠分為6組，每組8只，分別為溶劑對照組（Control）、模型組（Model）、陽性藥組（DAS）、補骨脂素低、中、高劑量組（PSO-L、PSO-M、PSO-H）。補骨脂素給藥組每天灌胃給予PSO 25、50、100 mg/kg（0.5% CMC-Na配制的混懸液），陽性藥組每天灌胃給予DAS 200 mg/kg，溶劑對照組和模型組灌胃給予相應體積的0.5%CMCNa，連續(xù)4 d。模型組、給藥組和陽性藥組在第4天給藥后1 h，單次腹腔注射給予CCl4100μL/kg（橄欖油配制，體積分數(shù)為2%），溶劑對照組則腹腔注射給予同樣體積的橄欖油。第5天給藥結束后2 h眼球采血，頸椎脫臼處死小鼠，分離肝臟。

另取12只C57BL/6J小鼠，6只為對照組，連續(xù)灌胃0.5%CMC-Na 5 d，6只為單給補骨脂素組，即單獨灌胃PSO 100 mg/kg 5 d，檢測對CYP2E1蛋白表達量的影響。

2.2 肝臟指數(shù)

小鼠肝臟用生理鹽水漂洗干凈，濾紙吸干稱重，計算肝臟指數(shù)，即肝臟占體重的質量分數(shù)。

2.3 血清生化指標檢測

將小鼠血樣3 500 r/min離心10 min，移液器吸取上層血清至1.5 mL EP管中，按血生化試劑盒說明測定血清ALT、AST水平。

2.4 肝臟病理學檢測

取肝臟左側大葉中間部分，在10%中性甲醛中固定48 h，然后進行石蠟包埋、切片、脫蠟、蘇木精-伊紅（HE）染色，最后在BX53顯微鏡下觀察肝組織病理學形態(tài)變化。

2.5 Western blot檢測相關蛋白表達

稱取肝組織50 mg，加入RIPA裂解液提取肝總蛋白，使用BCA法定蛋白，金屬浴煮蛋白，-20℃保存變性蛋白。取等體積蛋白進行SDS-PAGE凝膠電泳，在冰上恒流模式下進行轉膜，5% BSA封閉2 h，4℃孵育一抗過夜。第2天用TBST洗膜，孵育二抗1 h，再洗膜，采用化學發(fā)光法曝光。使用Image J進行蛋白條帶的灰度分析。

2.6 RT-PCR檢測相關基因表達

稱取肝組織30 mg，加Trizol裂解液1 mL提取總RNA。使用超微量核酸蛋白測定儀檢測RNA濃度，在逆轉錄儀上將RNA逆轉錄成cDNA。運用實時熒光定量PCR法測定cDNA樣品中的TNF-α、IL-6和CYP2E1的基因水平。選用GAPDH作為內參基因，引物序列如表1所示。

Table 1 Primer sequences for Real-time quantitative PCR assay

2.7 免疫組織化學染色

將肝組織的石蠟切片進行脫蠟，抗原修復，封閉，4℃一抗孵育過夜，PBS漂洗，室溫孵育二抗，再PBS漂洗，DAB顯色，蘇木精染色，BX53顯微鏡下觀察CYP2E1蛋白表達量變化及肝細胞定位情況。

2.8 統(tǒng)計分析

使用GraphPad Prism 6.01軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計處理，實驗結果以±s,表示。組間數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析采用One-Way ANOVA檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。免疫組化圖使用Image J掃描陽性區(qū)域比率進行統(tǒng)計分析。

3 結果

3.1 補骨脂素對CCl4致急性肝損傷模型中小鼠體重及肝臟指數(shù)的影響

體重結果如圖1所示，各組小鼠在第4天腹腔注射CCl4或者橄欖油后，體重均有所下降，而各組間體重無明顯差異。從肝臟指數(shù)結果來看，模型組和陽性藥組的肝臟指數(shù)有所升高，但沒有統(tǒng)計學差異；與模型組相比，補骨脂素給藥組的肝臟指數(shù)則均有明顯上升，并呈一定的劑量相關性。

Figure 1 Effect of psoralen(PSO)on the body weight(A)and liver index(B)in CCl4-induced acute liver injury mouse model taking diallyl sulfide(DAS)as positive control(±s,,n=8)

3.2 補骨脂素對CCl4致急性肝損傷模型中小鼠血清生化水平的影響

如圖2血清生化結果顯示，與溶劑對照組相比，模型組ALT和AST水平顯著升高，補骨脂素給藥后，呈劑量相關性的降低ALT和AST水平，補骨脂素的中、高劑量組幾乎可以使ALT、AST恢復到溶劑對照組水平。

3.3 肝組織病理學檢測

肝HE染色結果如圖3所示，溶劑對照組小鼠肝細胞結構完整，肝索排列整齊，而模型組可見大量炎性細胞浸潤和肝細胞壞死，補骨脂素給藥后，低劑量組的肝細胞仍可見部分病變區(qū)域，而中、高劑量組改善明顯，幾乎無肝細胞壞死和炎性細胞浸潤，但是補骨脂素給藥組均會出現(xiàn)不同程度的肝細胞增大現(xiàn)象，呈現(xiàn)空泡樣改變。

3.4 Western blot和RT-PCR測定補骨脂素對CYP2E1蛋白和基因水平的影響

如圖4-A所示，與溶劑對照組相比，模型組的CYP2E1表達下調，與模型組相比，補骨脂素給藥組的CYP2E1表達均低于模型組，但是隨著劑量升高，呈現(xiàn)上調趨勢，陽性藥組的CYP2E1蛋白表達則無明顯變化。

如圖4-B所示，與溶劑對照組相比，正常小鼠單給補骨脂素100 mg/kg可以明顯下調CYP2E1的蛋白水平。

如圖4-C所示，CYP2E1的PCR結果與Western blot結果基本一致，模型組CYP2E1明顯下調，補骨脂素給藥后有所上調。

Figure 2 Effect of psoralen on serum alanine aminotransferase(ALT)(A)and aspartate aminotransferase(AST)(B)levels in CCl4-induced acute liver injury mouse model(±s,,n=8)

Figure 3 Effect of psoralen on liver histopathology of mice in CCl4-induced acute liver injury mouse model(HE staining,×200)

3.5 免疫組化測定補骨脂素對CYP2E1蛋白表達的影響

免疫組化及半定量分析結果（圖5）顯示，各組CYP2E1蛋白表達趨勢與Western blot結果基本一致，模型組CYP2E1有所下調，而補骨脂素中、高劑量給藥后可以上調CYP2E1的表達。

3.6 補骨脂素對CCl4致小鼠急性肝損傷模型中炎癥因子基因水平的影響

PCR結果如圖6所示，與溶劑對照組相比，模型組炎癥因子表達明顯上調，補骨脂素給藥后可以呈劑量相關性的下調炎癥因子基因水平。

Figure 4 Effect of psoralen on the protein and gene expression level of CYP2E1(±s,,n=3-8)

Figure 5 Effect of psoralen on expression of CYP2E1 in CCl4-induced acute liver injury mouse model by IHC and semi-quantitative analysis(±s,,n=3)

Figure 6 Effect of psoralen on mRNA levels of TNF-α(A)and IL-6(B)in CCl4-induced acute liver injury mouse model(±s,,n=8)

4 討論

在CCl4致小鼠急性肝損傷模型中，主要是破壞肝細胞，使細胞膜通透性改變，細胞內的ALT和AST大量進入血液，導致血液中轉氨酶水平顯著上升［13］。組織病理學變化主要是肝細胞壞死、炎性細胞浸潤和肝索結構排列紊亂［14］。病理進程具有時間依賴性，最早的組織損傷出現(xiàn)在6 h后，12 h左右可以觀察到明顯的組織損傷，24 h達到損傷高峰［15-16］，所以本研究選擇CCl4造模24 h后解剖動物。在補骨脂素給藥后，25、50、100 mg/kg 3個劑量均能不同程度地降低轉氨酶水平，改善小鼠肝細胞壞死和炎性細胞浸潤情況，而且中、高劑量組的改善作用明顯。以上結果表明補骨脂素對于CCl4致小鼠急性肝損傷具有明顯的改善作用。

CCl4致急性肝損傷模型的發(fā)病機制主要是CCl4在CYP2E1的代謝下，產生毒性自由基CCl-3和CCl3O-2，破壞細胞膜結構，使膜通透性增大，引起膜脂質過氧化反應，使肝細胞變性、壞死［17-18］。肝臟是補骨脂素給藥后分布最多的器官［19］，也是主要的代謝器官［4］，文獻報道補骨脂素對小鼠肝CYP2E1活性和蛋白水平可產生抑制作用［20］?；谝陨涎芯拷Y果提示補骨脂素有可能通過影響CYP2E1發(fā)揮肝保護作用。

從Western blot和免疫組化結果來看，模型組的CYP2E1蛋白表達下調，在模型早期，在CCl4的刺激下機體會出現(xiàn)自我保護機制［15］，即大量CCl4進入機體經(jīng)CYP2E1代謝產生毒性自由基，這些毒性自由基會負反饋抑制CYP2E1的表達。補骨脂素給藥后，小鼠肝細胞損傷逐漸改善，產生的毒性自由基減少，對CYP2E1的負反饋抑制作用減弱，所以隨著補骨脂素劑量增加，CYP2E1的表達有逐漸上升趨勢，但是均低于模型組，這可能是因為補骨脂素本身可以抑制CYP2E1的表達，單給補骨脂素的Western blot結果也證明，補骨脂素100 mg/kg明顯抑制CYP2E1的蛋白水平。陽性藥DAS是CYP2E1的競爭性抑制劑［21-22］，主要影響CYP2E1的酶活性，對CYP2E1蛋白表達量影響較小，所以與溶劑對照組相比，陽性藥組的CYP2E1蛋白水平幾乎沒有變化。上述結果說明，補骨脂素對于CYP2E1蛋白表達量的抑制，可能與其發(fā)揮藥效作用的機制有關，通過抑制CYP2E1的表達，減少CCl4經(jīng)CYP2E1代謝產生毒性自由基，從而拮抗肝損傷。

綜上所述，補骨脂素對于CCl4致小鼠急性肝損傷具有改善作用，其可能作用機制之一是抑制CYP2E1的蛋白表達，從而減輕CCl4誘發(fā)的急性肝損傷。