一株釀酒酵母在青稞酒生產(chǎn)中的應(yīng)用

祁萬(wàn)軍，李善文，陳占秀，黃和強(qiáng)，孔令武，車富紅，馮聲寶

（青?；ブ囡乒煞萦邢薰荆嗪；ブ?810500）

白酒是我國(guó)的傳統(tǒng)蒸餾酒，也是世界六大蒸餾酒之一[4]，它具有悠久的歷史，采用固態(tài)酒醅發(fā)酵和固態(tài)蒸餾的傳統(tǒng)操作，是世界上獨(dú)特的釀酒工藝。白酒是以多菌種自然培養(yǎng)的大曲作為糖化發(fā)酵劑，利用糧食谷物為原料，經(jīng)蒸煮糖化發(fā)酵，蒸餾貯存、勾兌而成的蒸餾酒。不同的釀酒壞境造就了不同的釀酒微生物，從而形成了中國(guó)豐富多彩的白酒香型，青稞香型白酒釀造地處青藏高原與黃土高原結(jié)合部，獨(dú)特的地理環(huán)境造就了獨(dú)特的微生物環(huán)境，也賦予了青稞酒獨(dú)特的風(fēng)格特點(diǎn)。青稞酒的釀造工藝可概括為“清蒸清燒四次清”[7]，發(fā)酵窖池采用天然的昆侖山花崗巖為壁，以祁連山松木板為底，這些獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，賦予了青稞酒區(qū)別于其他白酒的典型風(fēng)格。青稞酒釀造裝甑遵循“輕”“松”“薄”“勻”“緩”“凈”，整個(gè)發(fā)酵遵循“養(yǎng)大米查、保二米查、擠三米查、追四米查”的原則[3]，量質(zhì)摘酒后分級(jí)貯存在陶缸和不銹鋼罐中，基酒酒齡不少于1.5 年，調(diào)味酒酒齡不少于3 年，基酒、調(diào)味酒經(jīng)過(guò)分析、嘗評(píng)、勾兌、調(diào)味后，最終形成互助青稞酒“青稞清香純正、清雅怡悅，口感綿甜柔和、悠長(zhǎng)”的特點(diǎn)。

白酒的釀造方式是多微共酵，酵母菌作為主要的釀酒微生物之一存在于釀造過(guò)程中，在白酒釀酒過(guò)程中起著至關(guān)重要的作用，尤其是釀酒酵母決定著白酒產(chǎn)量和質(zhì)量，優(yōu)良的釀酒酵母應(yīng)用能提高白酒品質(zhì)，目前中國(guó)白酒行業(yè)對(duì)自身環(huán)境篩選菌種并在釀造生產(chǎn)應(yīng)用的研究較少，何宏魁等[1]從大曲中分離得到1 株酵母菌,制備成酵母曲應(yīng)用于白酒的生產(chǎn)中，可以提高白酒的出酒率，提升白酒品質(zhì)。較多的白酒釀造發(fā)酵動(dòng)力一般來(lái)源于傳統(tǒng)干酵母的使用，導(dǎo)致釀造原酒的口感穩(wěn)定性差，產(chǎn)品風(fēng)味物質(zhì)與酒質(zhì)不佳。本試驗(yàn)利用青稞酒獨(dú)特的釀造微生物環(huán)境，通過(guò)分子生物技術(shù)選育出高產(chǎn)醇產(chǎn)酯的釀酒酵母，結(jié)合菌種中試擴(kuò)培設(shè)備擴(kuò)大培養(yǎng)出酵母菌液并應(yīng)用于青稞酒釀造，通過(guò)對(duì)發(fā)酵過(guò)程酒醅與原酒理化指標(biāo)、原酒產(chǎn)量、原酒斤酒耗糧、出酒率、優(yōu)級(jí)率、感官品評(píng)綜合分析，研究應(yīng)用高產(chǎn)乙醇釀酒酵母對(duì)青稞酒產(chǎn)量、酒質(zhì)的影響。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

釀酒菌種：釀酒酵母S.cerevisiaeQK6，菌種從青稞酒釀造環(huán)境篩選獲得，QK6釀酒酵母有較高的產(chǎn)醇產(chǎn)酯能力。

儀器設(shè)備：超凈工作臺(tái)（VS-1300L-V），蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；高壓滅菌鍋（LDZF-50L），上海申安醫(yī)療機(jī)械廠；恒溫恒濕培養(yǎng)箱（HSX-250HC)，上海島韓實(shí)業(yè)有限公司；全溫?fù)u瓶柜（HYG-A），常州恒隆儀器有限公司；電子天平（ME3002），梅特勒-托利多國(guó)際貿(mào)易有限公司公司；電子顯微鏡（BX53)，奧林巴斯有限公司；一級(jí)種子罐（HB-JZ），濟(jì)南漢博設(shè)備技術(shù)有限公司；擴(kuò)培罐（HB-KP），濟(jì)南漢博設(shè)備技術(shù)有限公司；糊化罐（HB-HH），濟(jì)南漢博設(shè)備技術(shù)有限公司；糖化罐（HB-TZ），濟(jì)南漢博設(shè)備技術(shù)有限公司；過(guò)濾罐（HB-GX），濟(jì)南漢博設(shè)備技術(shù)有限公司。

1.2 酵母培養(yǎng)基制備與試劑

1.2.1 培養(yǎng)基

WL 培養(yǎng)基：酵母粉2 g、蛋白胨2.5 g、葡糖糖2.5 g、瓊脂10 g、青霉素500 μL、鏈霉素500 μL、曲拉通1 mL。

麥芽汁培養(yǎng)基：青稞、麥芽、無(wú)菌水。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)試劑

淀粉酶（上?；瘜W(xué)試劑有限公司）；糖化酶（上?；瘜W(xué)試劑有限公司）；無(wú)水乙醇（上海化學(xué)試劑有限公司）；實(shí)驗(yàn)采用所有試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 酵母擴(kuò)培方法與工藝[5]

1.2.1.1 酵母擴(kuò)培方法

菌種活化→一級(jí)三角瓶接種培養(yǎng)（4 L)→二級(jí)卡式罐接種培養(yǎng)（20 L)→三級(jí)種子罐青稞麥汁接種培養(yǎng)（80 L）→四級(jí)擴(kuò)培罐青稞麥汁接種培養(yǎng)（380 L）→酵母菌液冷藏→鮮酵母應(yīng)用于釀造車間，全流程無(wú)菌操作，卡式罐、種子罐、擴(kuò)培罐蒸汽滅菌30 min。

1.2.1.2 酵母擴(kuò)培工藝（圖1）[2]

圖1 酵母擴(kuò)培工藝流程圖

（1）麥汁制備[6]

糊化：青稞粉20 kg、麥芽粉10 kg、淀粉酶250 g、下料水90 L。

糖化：麥芽粉40 kg、下料水200 L。

（2）糊化過(guò)程全程開攪拌（糊化升溫過(guò)程中沸騰后密閉保壓），糖化罐下料，兌醪時(shí)手動(dòng)開糖化攪拌。

（3）糊化兌醪結(jié)束后，清洗糊化罐，加熱100 L水至78 ℃?zhèn)溆谩?/p>

（4）糖化結(jié)束進(jìn)行碘檢，如分解不徹底，則適當(dāng)延長(zhǎng)糖化時(shí)間；糖化向過(guò)濾打料前，向過(guò)濾槽加熱水至漫過(guò)篩板，打料后靜置10 min 過(guò)濾，待麥汁清亮后打回流，然后過(guò)濾麥汁進(jìn)糖化煮沸鍋；過(guò)濾過(guò)程中濾速過(guò)慢，可開耕刀攪拌均勻靜止后過(guò)濾，或自麥汁出口頂熱水1 min，可開耕刀攪拌均勻靜止后過(guò)濾。

（5）漩沉結(jié)束后，麥汁經(jīng)薄板進(jìn)入混合罐，過(guò)料過(guò)程中不降溫。

（6）混合罐蒸汽滅菌100～105 ℃（沸騰后保壓），30 min。

（7）種子罐、擴(kuò)培罐空罐蒸汽滅菌：蒸汽壓力0.05 MPa，滅菌30 min，通無(wú)菌氧氣備壓至0.05 MPa，降溫備用。

（8）管道提前蒸汽滅菌后，將混合罐滅菌后的麥汁倒入種子罐100 L，2 個(gè)擴(kuò)培罐各150～200 L，降溫備用接種培養(yǎng)。

（9）種子罐培養(yǎng)完成后向2 個(gè)擴(kuò)培罐中各接種50 L，30 ℃培養(yǎng)，培養(yǎng)完畢，種子罐用無(wú)菌氧氣背壓，壓入儲(chǔ)存罐降溫至0 ℃。

（10）各罐接種過(guò)程中所用管道用蒸汽滅菌30 min，接頭處用75 %酒精噴霧擦拭滅菌，避免雜菌污染。

（11）對(duì)接種擴(kuò)大培養(yǎng)的酵母鮮菌液在冷藏灌-4 ℃保存。

1.2.2 酵母應(yīng)用方法與工藝

1.2.2.1 青稞酒釀酒酵母應(yīng)用及釀造工藝（圖2）

圖2 青稞酒釀造工藝流程圖

互助青稞酒的釀造工藝可概括為“清蒸清燒四次清”，發(fā)酵窖池為花崗巖制成的條石窖。原料蒸煮50 min左右，并在蒸煮過(guò)程中加入一定比例的水做悶頭漿，蒸煮后的糧醅揚(yáng)冷加入大曲、QK6 酵母等糖化發(fā)酵劑及適量的谷糠，翻拌均勻入窖發(fā)酵。糧醅從入窖發(fā)酵到出窖蒸餾、出甑散冷、拌糠、加曲至下一次入窖發(fā)酵的時(shí)間為一個(gè)發(fā)酵周期，大米查、二米查發(fā)酵周期為25 d，三米查、四米查為15 d，從原糧投入到最后出糟為一輪次，合計(jì)80 d，整個(gè)發(fā)酵遵循“養(yǎng)大米查、保二米查、擠三米查、追四米查”的原則。為保證發(fā)酵的順利進(jìn)行，每輪次糧醅入窖前必須徹底清洗窖池，入窖后及時(shí)封窖、踩窖。達(dá)到發(fā)酵周期的酒醅進(jìn)行蒸餾，蒸餾時(shí)采用不銹鋼制作的甑鍋和冷卻器進(jìn)行固態(tài)隔水單釜式蒸餾，經(jīng)緩火蒸餾，掐頭去尾，量質(zhì)摘酒后分級(jí)貯存在陶缸和不銹鋼罐中，基酒酒齡不少于1.5 年，調(diào)味酒酒齡不少于3年?；?、調(diào)味酒經(jīng)過(guò)分析、嘗評(píng)、勾兌、調(diào)味后，最終形成互助青稞酒“青稞清香純正、清雅怡悅，口感綿甜柔和、悠長(zhǎng)”的特點(diǎn)。

1.2.2.2 酵母應(yīng)用方法

高產(chǎn)乙醇釀酒酵母擴(kuò)培后進(jìn)行冷藏罐存放，在釀造車間糧醅蒸煮攤晾后加入。酵母數(shù)量以2×104CFU/mL 為添加標(biāo)準(zhǔn)，青稞酒發(fā)酵窖池每窖投糧為3 t，實(shí)驗(yàn)選擇按3 個(gè)方案進(jìn)行，發(fā)酵過(guò)程按時(shí)間節(jié)點(diǎn)進(jìn)行取樣檢測(cè)，各方案選擇取樣窖池點(diǎn)為：方案一（11 排8 和5 排8）QK6 酵母菌液用量7 kg/窖；方案二（11 排3 和5 排3）酵母菌液用量10 kg/窖；方案三（4 排3 和10 排3）干酵母添加量0.3 kg/窖。通過(guò)對(duì)發(fā)酵過(guò)程酒醅理化指標(biāo)、原酒產(chǎn)量、原酒斤酒耗糧、出酒率、優(yōu)級(jí)率、原酒理化指標(biāo)和感官品評(píng)綜合分析，研究應(yīng)用高產(chǎn)乙醇釀酒酵母對(duì)青稞酒產(chǎn)量、酒質(zhì)的影響，具體酵母應(yīng)用方法見表1。

表1 酵母釀造應(yīng)用方案

2 結(jié)果與分析

2.1 酵母擴(kuò)培穩(wěn)定性結(jié)果（圖3）

圖3 電子顯微鏡酵母數(shù)量圖

通過(guò)對(duì)酵母擴(kuò)培過(guò)程三角瓶、種子罐、擴(kuò)培罐逐級(jí)培養(yǎng)的菌種數(shù)量進(jìn)行顯微鏡計(jì)數(shù)，酵母菌種數(shù)量能夠穩(wěn)定達(dá)到2.0×104CFU/mL，釀酒酵母投入釀造應(yīng)用前菌種質(zhì)量較佳。

2.2 發(fā)酵過(guò)程理化參數(shù)變化與分析

2.2.1 發(fā)酵過(guò)程溫度變化結(jié)果（圖4—圖7）

圖4 各方案大米查釀造過(guò)程中溫度變化

圖5 各方案二米查釀造過(guò)程中溫度變化

圖6 各方案三米查釀造過(guò)程中溫度變化

圖7 各方案四米查釀造過(guò)程中溫度變化

根據(jù)試驗(yàn)記錄數(shù)據(jù)分析作出各方案試驗(yàn)窖在發(fā)酵周期內(nèi)的溫度變化曲線圖，可以看出，3 個(gè)方案的發(fā)酵溫度變化基本遵循“前緩、中挺、后緩落”的規(guī)律[8]。3 個(gè)方案的大米查酒醅溫度在6～10 d 內(nèi)達(dá)到頂溫，正常入窖的窖池頂溫為36～37 ℃；二米查酒醅在5～9 d 內(nèi)達(dá)到頂溫，發(fā)酵頂點(diǎn)溫度為32～35 ℃。入窖溫度高的窖池溫度上升很快，其他窖池升溫正常但回落比較緩慢，三米查升溫更快，在3～5 d 內(nèi)達(dá)到頂溫，發(fā)酵頂點(diǎn)溫度為36～38 ℃。四米查在3～6 d 內(nèi)達(dá)到頂溫，發(fā)酵頂點(diǎn)溫度在36 ℃以上，個(gè)別窖池頂溫超過(guò)40 ℃。

2.2.2 發(fā)酵過(guò)程酸度變化結(jié)果（圖8—圖11）

圖8 各方案大米查酒醅發(fā)酵酸度變化圖

圖9 各方案二米查酒醅發(fā)酵酸度變化圖

圖10 各方案三米查酒醅發(fā)酵酸度變化圖

圖11 各方案四米查酒醅發(fā)酵酸度變化圖

從酸度曲線變化圖可以看出，在一米查發(fā)酵中3個(gè)方案窖池的酸度持續(xù)上升，入窖溫度高的窖池升溫快，酸度上升也快，發(fā)酵結(jié)束后酒醅酸度較高，出窖前期雖有所降低，但一米查酒醅出窖時(shí)的酸度值達(dá)到了2.0；而在二米查發(fā)酵中酸度波動(dòng)較明顯，入窖10 d左右，檢測(cè)酸度已經(jīng)達(dá)到了大米查酒出窖時(shí)的酸度值；三米查、四米查的酸度隨著發(fā)酵天數(shù)的增多而上升，但是上升幅度均比較小。整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中，酒醅中酸度隨窖池溫度上升而增加，溫度上升快的產(chǎn)酸多。整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中酸度波動(dòng)較大，酸度值一直在1.2～3.55之間波動(dòng)。

2.2.3 發(fā)酵過(guò)程酒精度變化結(jié)果（圖12—圖15）

圖12 各方案大米查酒醅發(fā)酵酒精度變化圖

圖13 各方案二米查酒醅發(fā)酵酒精度變化圖

圖14 各方案三米查酒醅發(fā)酵酒精度變化圖

圖15 各方案四米查酒醅發(fā)酵酒精度變化圖

由圖12—圖15 可知，酒精含量在窖內(nèi)整體呈上升趨勢(shì)，符合發(fā)酵規(guī)律，僅有個(gè)別窖池的酒精度變化不穩(wěn)定，但是后期降低的趨勢(shì)在大米查和三米查中不是很明顯，這和溫度在窖內(nèi)的變化是一致的。發(fā)酵中酸度前期上升快，后期平緩，前2 d 酵母處于生長(zhǎng)繁殖階段，酒精生成較少，酵母菌達(dá)到足夠數(shù)量后進(jìn)入酒精發(fā)酵階段，在6～8 d后酒精度很快上升到最高值，然后在小范圍內(nèi)波動(dòng)。發(fā)酵后期進(jìn)入酯化期，消耗一部分酒精，酒精度會(huì)有所降低，但圖12—圖15 可看出，酒精度降低趨勢(shì)不明顯，即酯化階段不理想。發(fā)酵酒醅中酒精成分含量的高低決定了所產(chǎn)原酒酒精度的高低及產(chǎn)量，方案一二米查中11 排8 號(hào)窖酒精度比較高，因?yàn)檫@窖入窖溫度略高，窖池升溫快，酒精度偏高，隨著發(fā)酵天數(shù)的延長(zhǎng)呈下降趨勢(shì)。各方案四米查中酒精度的變化趨勢(shì)非常不穩(wěn)定，方案一較符合發(fā)酵規(guī)律。高溫高酸的環(huán)境不適于酵母的生長(zhǎng)繁殖，淀粉利用率比較低，產(chǎn)酒精量就低。

2.3 原酒產(chǎn)量結(jié)果與分析（圖16—圖17）

圖16 各方案原酒不同米查次原酒產(chǎn)量

圖17 各方案原酒總產(chǎn)量

從圖16 不同米查次原酒產(chǎn)量和原酒總產(chǎn)量圖17可看出：添加釀酒酵母菌液的方案一和方案二原酒產(chǎn)量高于對(duì)照方案三，對(duì)應(yīng)的出酒率提高了2.77%～4.17%，方案一7 kg/窖酵母菌液的實(shí)驗(yàn)結(jié)果達(dá)到預(yù)期效果，而方案二10 kg/窖菌液的窖池出酒產(chǎn)量較低，可能是酵母菌液加入過(guò)量的原因，酵母數(shù)量過(guò)多，繁殖快、利用營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)多，會(huì)影響出酒率，并不利于提高酒的產(chǎn)量和品質(zhì)，所以釀造時(shí)加入7 kg/窖酵母菌液更有利于提高原酒出酒率及品質(zhì)。

2.4 原酒斤酒耗糧、出酒率、優(yōu)級(jí)率結(jié)果

從斤酒耗糧、出酒率、優(yōu)級(jí)率分析表2 可以看出：方案三的斤酒耗糧最高，比方案一高0.21 斤；方案三的出酒率最低，而方案一出酒率比方案三高4.17 %，方案二出酒率比方案三高2.77 %；方案三的優(yōu)級(jí)率也最高，方案三比方案一高2.6%，比方案二高2.86%。

表2 原酒斤酒耗糧、出酒率、優(yōu)級(jí)率結(jié)果

2.5 原酒理化指標(biāo)分析（圖18—圖22）

圖18 大米查原酒理化指標(biāo)平均值比較圖

從以上分析圖看出：在圖18 大米查原酒中方案三的總酸、總酯、乙酸乙酯均高于方案一和方案二，方案一的乙酸乙酯含量高于方案二，方案二的乳酸乙酯和丁酸乙酯含量最高。在圖19 二米查原酒中方案三的總酸、總酯、乳酸乙酯均最高，而方案一的總酸、乙酸乙酯、乳酸乙酯又高于方案二，方案一的乙酸乙酯含量最高，方案二的丁酸乙酯含量最高。在圖20 三米查原酒中方案二的總酸、乳酸乙酯均較高，而方案一的總酸、總酯、乙酸乙酯、乳酸乙酯都略低，方案二的乳酸乙酯和方案二的丁酸乙酯含量最高。在圖21 四米查原酒中方案二的總酸、總酯、乙酸乙酯、乳酸乙酯含量均較高，方案一總酯、乙酸乙酯、乳酸乙酯、丁酸乙酯含量最高。

圖19 二米查原酒理化指標(biāo)平均值比較圖

圖20 三米查原酒理化指標(biāo)平均值比較圖

圖21 四米查原酒理化指標(biāo)平均值比較圖

圖22 各米查原酒丁酸乙酯含量平均值比較圖

綜合結(jié)果：方案一的乙酸乙酯含量最高，方案二的乳酸乙酯和丁酸乙酯含量最高，方案三中各理化指標(biāo)含量不明顯。

2.6 原酒感官品評(píng)結(jié)果

通過(guò)原酒感官品評(píng)，添加酵母菌液方案一和方案二香氣清雅純正、口感綿柔、酒體回甜較佳，整體優(yōu)于對(duì)照組。見表3。

表3 原酒品評(píng)結(jié)果

3 結(jié)論

通過(guò)QK6 釀酒酵母擴(kuò)大培養(yǎng)，釀酒酵母擴(kuò)培后電子顯微鏡觀察數(shù)量非常穩(wěn)定，平均能夠達(dá)到2×104CFU/mL。QK6 酵母在釀造車間投入生產(chǎn)應(yīng)用后，酒醅發(fā)酵過(guò)程各理化參數(shù)穩(wěn)定，符合正常的發(fā)酵規(guī)律。酒醅經(jīng)發(fā)酵蒸餾后對(duì)原酒產(chǎn)量進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，其原酒產(chǎn)量比傳統(tǒng)對(duì)照發(fā)酵提高了2.77 %～4.17%，斤酒耗糧降低了0.21%。原酒通過(guò)感官品評(píng)，添加酵母菌液方案的原酒香氣清雅純正、口感綿柔、酒體回甜較佳，對(duì)原酒的理化指標(biāo)分析后發(fā)現(xiàn)乙酸乙酯、乳酸乙酯、丁酸乙酯都有所提升。QK6 酵母菌種的擴(kuò)培和應(yīng)用不僅提高了青稞酒產(chǎn)原酒的產(chǎn)量，節(jié)約了原料成本，而且對(duì)青稞酒產(chǎn)品品質(zhì)有很大提升，QK6釀酒酵母的成功應(yīng)用也為今后青稞酒多功能菌種的生產(chǎn)研究應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。