熱結(jié)合乙醇對(duì)芽孢的殺滅效果及內(nèi)膜通透性的影響

郭家俊，申 瑾，陳 翔，陳 樂(lè)，尚彬玲，章 中

（寧夏大學(xué) 食品與葡萄酒學(xué)院，寧夏 銀川 750021）

芽孢是某些細(xì)菌在不利于生長(zhǎng)繁殖的條件下形成的休眠體，具有極端抗逆性。在食品殺菌過(guò)程中，芽孢是最難被殺滅的對(duì)象，由于殺菌強(qiáng)度不夠，芽孢導(dǎo)致的食品腐敗和食物中毒事件時(shí)有發(fā)生[1-4]。常溫常壓下芽孢內(nèi)膜具有極端不通透性，水分子都難以自由通過(guò)，這種通透屏障是芽孢難以被殺滅的原因之一。研究表明，芽孢內(nèi)膜受損，水分子穿透芽孢內(nèi)膜屏障并進(jìn)入芽孢內(nèi)核是殺滅芽孢的重要原因之一[5-8]。水分子跨膜運(yùn)輸?shù)闹饕绞綖樽杂蓴U(kuò)散，芽孢內(nèi)膜對(duì)水分子的通透性與內(nèi)膜流動(dòng)性直接相關(guān)，因此研究芽孢內(nèi)膜流動(dòng)性十分重要[9]。

熱能夠提高磷脂分子的側(cè)向熱運(yùn)動(dòng)，改變細(xì)胞膜磷脂間氫鍵作用的強(qiáng)弱及膜磷脂的相態(tài)，宏觀表現(xiàn)為芽孢內(nèi)膜流動(dòng)性的增強(qiáng)，因此熱是影響芽孢內(nèi)膜流動(dòng)性的重要原因之一[10-11]。乙醇具有一定的殺菌效果，乙醇分子也會(huì)對(duì)芽孢內(nèi)膜產(chǎn)生影響。將熱與乙醇結(jié)合，預(yù)期能夠提高殺滅芽孢的效果，在食品工業(yè)中具有一定的應(yīng)用價(jià)值。

作者采用平板計(jì)數(shù)法、熒光偏振法、分光光度法和流式細(xì)胞術(shù)，通過(guò)對(duì)芽孢存活率、熒光偏振度、OD600值及芽孢內(nèi)膜通透性的測(cè)定，研究了熱結(jié)合乙醇對(duì)枯草桿菌芽孢內(nèi)膜通透性和芽孢殺滅效果的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）：中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心（CGMCC），編號(hào)As 1.433；營(yíng)養(yǎng)瓊脂：天津市大茂化學(xué)試劑廠；硫酸錳：分析純，天津市大茂化學(xué)試劑廠；DPH：上海阿拉丁生化科技股份有限公司；無(wú)水乙醇：分析純，天津市天力化學(xué)試劑有限公司；碘化丙啶（PI）：北京索萊寶科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

DSX-280B型高壓滅菌鍋：上海申安醫(yī)療器械廠；722型可見(jiàn)分光光度計(jì)：上海馳唐電子有限公司；TGL-10B型離心機(jī)：上海安亭科學(xué)儀器廠；電子恒溫不銹鋼水浴鍋：上海宜昌儀器紗篩廠；F-7000熒光分光光度計(jì)：日立 （日本）有限公司；CyFlow Cube 8流式細(xì)胞儀：日本SYSMEX（希森美康）株式會(huì)社。

1.3 方法

1.3.1 枯草桿菌芽孢菌懸液的制備 枯草芽孢桿菌（As 1.433）菌種在營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基活化后，劃線接種到試管斜面促芽孢生長(zhǎng)培養(yǎng)基上，在37℃培養(yǎng)7 d，洗滌離心3次后，菌懸液濃度大約調(diào)整在1.5×109CFU/mL 左右，4 ℃保存[12]。

1.3.2 DPH的配制 將DPH溶液的濃度配制為2×10-3mol/L（以四氫呋喃為溶劑），在4℃下棕色瓶中密閉保存，使用前用0.02 mol/L PBS緩沖液（pH 6.8）將儲(chǔ)備液稀釋至所需要的濃度[12]。

1.3.3 DPH標(biāo)記芽孢內(nèi)膜 DPH標(biāo)記芽孢內(nèi)膜參照錢(qián)靜亞[13]等的方法并進(jìn)行了優(yōu)化。取8 mL芽孢懸浮液，離心，用PBS緩沖液洗滌1次后離心棄上清液，加入8 mL濃度為3×10-6mol/L的DPH溶液，在50℃下水浴30 min，再用PBS緩沖液洗滌2次，離心后將芽孢在PBS緩沖液中的濃度調(diào)整為1×106～1×107CFU/mL。

1.3.4 熱結(jié)合乙醇處理芽孢懸浮液 取標(biāo)記后的芽孢懸浮液，離心棄上清液，分別加入體積分?jǐn)?shù)30%、75%的乙醇溶液，在60、80℃下處理20 min。

1.3.5 芽孢懸浮液熒光偏振度的測(cè)定 標(biāo)記后的芽孢懸浮液在360 nm激發(fā)波長(zhǎng)和430 nm發(fā)射波長(zhǎng)下，采用激發(fā)與發(fā)射縫寬10 nm，測(cè)定垂直熒光強(qiáng)度和水平熒光強(qiáng)度，計(jì)算熒光偏振度P，計(jì)算公式為：

式中：IVV為起偏器和檢偏器光軸同為垂直方向時(shí)測(cè)得的熒光強(qiáng)度；IVH為起偏器光軸為垂直方向和檢偏器光軸為水平方向時(shí)測(cè)得的熒光強(qiáng)度；G為光柵校正因子；IHV為起偏器光軸為水平方向和檢偏器光軸為垂直方向時(shí)測(cè)得的熒光強(qiáng)度；IHH為起偏器和檢偏器光軸同為水平方向時(shí)測(cè)得的熒光強(qiáng)度。

熒光偏振度P值越小，流動(dòng)性越大，反之則相反。

1.3.6 枯草芽孢桿菌的平板計(jì)數(shù) 將處理前后的芽孢懸浮液梯度稀釋，吸取1 mL稀釋液加入平板中，再倒入15～20 mL培養(yǎng)基混勻，待凝固后在 37℃下倒置培養(yǎng)24～48 h，計(jì)算菌落總數(shù)對(duì)數(shù)值。

1.3.7 芽孢懸浮液OD600值的測(cè)定 取處理后的枯草桿菌芽孢懸浮液，測(cè)定600 nm處的吸光值，根據(jù)吸光值變化檢驗(yàn)芽孢萌發(fā)情況。

1.3.8 流式細(xì)胞儀檢測(cè)枯草桿菌芽孢內(nèi)膜通透性取處理前后的枯草桿菌芽孢懸浮液，將菌液濃度稀釋到 106～107CFU/mL。 用 PI（Propidium iodide，碘化丙啶）染色后，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)前向散射光（FSC）、側(cè)向散射光（SSC）、熒光通道 FL2 和 FL3[14]。數(shù)據(jù)采集后用FSC Express Version 3.0軟件（De Novo software，Canada）分析。

1.3.9 統(tǒng)計(jì)分析 所有的實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，數(shù)據(jù)通過(guò)SPSS 17.0進(jìn)行分析，采用Origin 2018軟件作圖，以不同字母標(biāo)注顯著差異（P＜0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1 熱結(jié)合乙醇處理對(duì)枯草桿菌芽孢的殺滅作用

如圖1所示，與對(duì)照相比，80、60℃結(jié)合體積分?jǐn)?shù)30%乙醇處理后，芽孢存活率下降約0.12個(gè)對(duì)數(shù)。60℃結(jié)合75%乙醇與80℃結(jié)合75%乙醇處理，都使芽孢存活率下降0.23個(gè)對(duì)數(shù)?？梢钥闯?，80℃結(jié)合75%乙醇處理對(duì)芽孢有最好的殺滅效果，芽孢存活率下降了1個(gè)對(duì)數(shù)。熱結(jié)合乙醇對(duì)芽孢有顯著的殺滅效果。為解釋這一實(shí)驗(yàn)結(jié)果，對(duì)熱結(jié)合乙醇處理后芽孢懸浮液的熒光偏振度、OD600值及芽孢內(nèi)膜通透性進(jìn)行研究。

圖1 熱結(jié)合乙醇處理后枯草桿菌芽孢存活濃度的變化Fig.1 Change of survival concentration of Bacillus subtilis spores after heat treatment combined with ethanol

2.2 熱結(jié)合乙醇處理對(duì)枯草桿菌芽孢懸浮液熒光偏振度的影響

DPH是一種較為敏感的熒光探針，能夠插入到磷脂雙分子層中，在不同條件下，磷脂的活動(dòng)的變化會(huì)導(dǎo)致熒光偏振度的改變，宏觀表現(xiàn)為膜流動(dòng)性的變化[15-17]。熱結(jié)合乙醇處理后，芽孢懸浮液熒光偏振度見(jiàn)圖2。與對(duì)照相比，80、60℃結(jié)合體積分?jǐn)?shù)30%乙醇和80℃結(jié)合30%乙醇處理后，熒光偏振度顯著下降，芽孢內(nèi)膜流動(dòng)性顯著上升（P＜0.05），但3種處理之間沒(méi)有顯著差異（P＞0.05）。60、80℃結(jié)合75%乙醇處理后，芽孢懸浮液熒光偏振度下降更為顯著。從結(jié)果可以看出，熱結(jié)合乙醇處理時(shí)，乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)芽孢內(nèi)膜流動(dòng)性的改變至關(guān)重要。熱能夠提高磷脂分子的側(cè)向熱運(yùn)動(dòng)，改變膜脂的相態(tài)，宏觀表現(xiàn)為芽孢內(nèi)膜流動(dòng)性的增強(qiáng)[9-10]，這在文獻(xiàn)[14]的研究中也有過(guò)報(bào)道。磷脂的醇溶性質(zhì)也會(huì)對(duì)芽孢內(nèi)膜流動(dòng)性產(chǎn)生重要影響，內(nèi)膜流動(dòng)性的增強(qiáng)使其通透性提高，水分子更易進(jìn)入到芽孢內(nèi)部，從而殺滅芽孢。

圖2 熱結(jié)合乙醇處理對(duì)枯草桿菌芽孢懸浮液熒光偏振度的影響Fig.2 Effect of heat treatment combined with ethanol on fluorescence polarization of suspension of Bacillus subtilis spores

2.3 熱結(jié)合乙醇處理對(duì)枯草桿菌芽孢懸浮液OD600值的影響

芽孢內(nèi)膜通透性的改變，會(huì)使芽孢內(nèi)的物質(zhì)更容易釋放出來(lái)，芽孢懸浮液的OD600值可以用來(lái)估計(jì)芽孢內(nèi)容物的釋放情況。當(dāng)芽孢內(nèi)容物釋放后，芽孢懸浮液的折光性會(huì)發(fā)生變化，OD600值降低[18-19]。熱結(jié)合乙醇處理后，芽孢懸浮液OD600值變化見(jiàn)圖3。80、60℃結(jié)合30%乙醇和80℃結(jié)合30%乙醇處理后，芽孢懸浮液 OD600值顯著下降（P＜0.05），但 3 種條件下的OD600值之間差異不明顯（P＞0.05）。熱結(jié)合75%乙醇處理后的OD600值顯著低于熱結(jié)合30%乙醇處理 （P＜0.05），80℃結(jié)合75%乙醇處理后的OD600值下降最多。熱結(jié)合乙醇處理下，溫度越高、乙醇體積分?jǐn)?shù)越高，芽孢內(nèi)膜通透性變化越大，OD600值下降程度越大，內(nèi)容物釋放程度越高。

圖3 熱結(jié)合乙醇處理對(duì)枯草桿菌芽孢懸浮液OD600值的影響Fig.3 Effect of heat treatment combined with ethanol on OD600value of suspension of Bacillus subtilis spores

2.4 熱結(jié)合乙醇處理后枯草桿菌芽孢內(nèi)膜通透性的變化

進(jìn)一步采用流式細(xì)胞術(shù)對(duì)芽孢內(nèi)膜通透性進(jìn)行研究。PI可以透過(guò)受損細(xì)胞膜與內(nèi)部DNA結(jié)合后發(fā)出強(qiáng)烈紅色熒光。將熱結(jié)合乙醇處理后的芽孢用PI進(jìn)行染色，流式細(xì)胞儀檢測(cè)后的結(jié)果見(jiàn)圖4。與對(duì)照相比，80℃處理后芽孢內(nèi)膜通透性發(fā)生了改變，陽(yáng)性區(qū)域變化為34.78%；60℃結(jié)合30%、75%乙醇處理后，陽(yáng)性區(qū)域變化分別為68.50%和78.73%；80℃結(jié)合30%、75%乙醇處理后，陽(yáng)性區(qū)域變化為71.44%和93.69%。熱結(jié)合乙醇處理后，芽孢內(nèi)膜通透性顯著提高，80℃結(jié)合75%乙醇處理后，芽孢內(nèi)膜通透性變化最大，表明熱結(jié)合乙醇處理的過(guò)程中，溫度及乙醇體積分?jǐn)?shù)越高，芽孢內(nèi)膜通透性越強(qiáng)。

圖4 熱結(jié)合乙醇處理對(duì)枯草桿菌芽孢內(nèi)膜通透性的影響Fig.4 Effect of heat treatment combined with ethanol on the permeability of spore inner membrane

熱結(jié)合乙醇處理后，芽孢內(nèi)膜流動(dòng)性、芽孢懸浮液OD600值及芽孢流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果是一致的，均表明熱結(jié)合乙醇處理?xiàng)l件下芽孢死亡和芽孢內(nèi)膜通透性的變化相關(guān)。

3 結(jié) 語(yǔ)

熱結(jié)合高體積分?jǐn)?shù)乙醇處理能夠?qū)ρ挎弋a(chǎn)生殺滅效果，在食品工業(yè)中具有一定的應(yīng)用價(jià)值。80℃結(jié)合75%乙醇處理后，芽孢存活率下降了約1個(gè)對(duì)數(shù)值。熱結(jié)合乙醇能夠使芽孢內(nèi)膜流動(dòng)性增強(qiáng)，60、80℃結(jié)合75%乙醇處理使芽孢內(nèi)膜流動(dòng)性大幅增加。熱結(jié)合乙醇處理后，芽孢懸浮液OD600值都呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，說(shuō)明芽孢內(nèi)膜通透性提高，芽孢內(nèi)容物更容易釋放出來(lái)，80℃結(jié)合75%乙醇處理后，OD600值下降程度最大。流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，80℃結(jié)合75%乙醇處理后，芽孢內(nèi)膜通透性變化最大，陽(yáng)性區(qū)域變化為93.69%。結(jié)果表明，熱結(jié)合乙醇處理對(duì)芽孢的殺滅效果與芽孢內(nèi)膜通透性的變化密切相關(guān)，芽孢內(nèi)膜通透性的增大是芽孢死亡的重要原因之一。