細(xì)胞遺傳學(xué)技術(shù)在兒童急性白血病診斷中的應(yīng)用價(jià)值

孫恒娟， 杜成坎， 蔣 慧， 邵靜波， 李 紅， 張 泓

（1.上海市兒童醫(yī)院 上海交通大學(xué)附屬兒童醫(yī)院檢驗(yàn)科，上海 200040；2.上海市兒童醫(yī)院上海交通大學(xué)附屬兒童醫(yī)院血液科，上海 200040）

急性白血?。╝cute leukemia，AL）是造血干細(xì)胞惡性克隆性疾病，為發(fā)病率占首位的小兒臨床惡性血液腫瘤疾病。AL可以分為兩大類：急性淋巴細(xì)胞白血?。╝cute lymphoblastic leukemia，ALL）和急性髓細(xì)胞白血病（acute myeloid leukemia，AML）。主要臨床癥狀為貧血、出血、器官浸潤(rùn)和感染等，嚴(yán)重威脅患兒生命安全[1]。國(guó)際上一般通過(guò)MICM[綜合形態(tài)學(xué)（morphology）、免疫學(xué)（immunology）、細(xì)胞遺傳學(xué)（cytogenetics）、分子生物學(xué)（molecule biology）]分型對(duì)初診惡性血液病患者進(jìn)行準(zhǔn)確診斷與規(guī)范治療，以提高患者生存率[2-4]。因此，及時(shí)、有效的診斷對(duì)于AL患兒的預(yù)后和治療具有十分重要的意義。本研究采用常規(guī)染色體核型分析和熒光原位雜交技術(shù)對(duì)140例AL患兒進(jìn)行檢測(cè)，探討聯(lián)合檢測(cè)對(duì)提高白血病染色體異常檢出率的價(jià)值。

1 材料和方法

1.1 樣本收集

選取2017年1月—2018年12月上海市兒童醫(yī)院140例AL患兒，其中ALL患兒99例、AML患兒41例。診斷和分型均符合中華醫(yī)學(xué)會(huì)兒科學(xué)分會(huì)血液學(xué)組2014年制訂的《兒童急性淋巴細(xì)胞白血病診療建議（第四次修訂）》[5]。抽取患兒3～5 mL骨髓，進(jìn)行常規(guī)細(xì)胞遺傳學(xué)（染色體核型分析）和熒光原位雜交檢測(cè)。

1.2 試劑與儀器

Chang Medium MF/BMC細(xì)胞培養(yǎng)試劑（美國(guó)irvine scientific公司）、Sigma-Alorich Gs500染液（美國(guó)Sigma-Alorich 公司）、Vysis FISH探針（美國(guó)Abbott 公司）、CX41、BX51、BX61顯微鏡（日本Olympus公司）、CDS5細(xì)胞生成干燥箱（美國(guó) Thermotron 公司），Thermobrite雜交儀（美國(guó)Leica 公司）。

1.3 方法

1.3.1 染色體核型分析 采用直接法和24 h法制備染色體標(biāo)本，根據(jù)人類細(xì)胞基因組學(xué)國(guó)際命名體系2016分析二倍體核型20個(gè)中期分裂相。

1.3.2 熒光原位雜交檢測(cè) 探針?lè)謩e為ETV6/RUNX1、BCR/ABL1、MLL、PBX1/TCF3、PML/RARα、ETO/AML1、CBFβ、MYC、CCND1/IGH、IGH/BCL2，在熒光顯微鏡下通過(guò)DAPI、CY3.5、FITC 與三色融合濾光片觀察樣本的信號(hào)，計(jì)數(shù)300個(gè)細(xì)胞，如遇信號(hào)異常，則加數(shù)至500個(gè)或更多。

2 結(jié)果

2.1 染色體核型分析結(jié)果

99例ALL患兒中，20.2%（20/99）染色體核型正常；45.5%（45/99）核型異常，所有核型異常中，單純數(shù)目異常占15.6%（7/45），結(jié)構(gòu)異常占53.3%（24/45），數(shù)目及結(jié)構(gòu)均異常占31.1%（14/45）；不完全計(jì)數(shù)占24.2%（24/99），未見分裂相占10.1%（10/99）。

19.5%（8/41）的AML患兒核型正常，核型異常占75.6%（31/41）；結(jié)構(gòu)異常占64.5%（20/41），數(shù)目與結(jié)構(gòu)均異常占35.5%（11/41），不完全計(jì)數(shù)4.9%（2/41）。

ALL患兒染色體特異性異常包括der（19）t（1：19）12.5%（3/24）、t（9：22）16.3%（4/24）、t（8：14）8.3%（2/24）、t/del（11）（q23）20.8%（5/24）；高超二倍體占35.6%（16/45），中位染色體數(shù)為56（正常為52～67），主要是獲得三倍體，其中100%獲得X染色體，以下依次為獲得21號(hào)（93.8%）、18號(hào)（68.8%）、6號(hào)（62.5%）、14和4號(hào)（各56.3%）、8號(hào)和10號(hào)（各31.3%）、17號(hào)（31.3%）。AML患兒染色體特異性異常包括t（15：17）及17號(hào)染色體數(shù)目異常占25.8%（8/31）。產(chǎn)生ETO-AML1融合蛋白的t（8：21）占16.1%（5/31）（高于文獻(xiàn)[6]中12.0%～15.0%的發(fā)生率）、t/del（11）（q23）占22.6%（7/31）、inv（16）占9.7%（3/31）。此外，數(shù)目與結(jié)構(gòu)均異常占35.5%（11/31），累及染色體X、8、7、21。

2.2 熒光原位雜交檢測(cè)結(jié)果

ALL患兒熒光原位雜交檢測(cè)異常率為80.7%（113/140）（1例患兒多種探針異常只計(jì)數(shù)1次）。28例染色體核型正常患兒中，熒光原位雜交檢測(cè)異常11例（39.3%）；76例核型異?；純褐?，熒光原位雜交檢測(cè)結(jié)果正常11例（14.5%）。ALL患兒中出現(xiàn)幾種探針同時(shí)異常的現(xiàn)象，AML患兒則未發(fā)現(xiàn)這一現(xiàn)象。熒光原位雜交檢測(cè)共檢出異常信號(hào)151例次，其中ALL 124例次，AML 27例次。

2.2.1 ALL患兒熒光原位雜交檢測(cè)異常特征 ALL患兒熒光原位雜交檢測(cè)異常率為86.9%（86/99）。異常信號(hào)共124次，ETV6/RUNX11異常信號(hào)占50.0%（62/124），PBX1/TCF3異常信號(hào)占23.4%（29/124），BCR/ABL1異常信號(hào)占14.5%（18/124），MLL檢測(cè)t/del（11）（q23）占9.7%（12/124），MYC/IGH占1.6%（2/124），MYC占0.8%（1/124）。

2.2.2 AML患兒熒光原位雜交檢測(cè)異常特征 AML患兒熒光原位雜交檢測(cè)異常率為65.9%（27/41），低于ALL患兒，其中ETO/AML1占29.6%（8/27）、PML/RARα占29.6%（8/27）、CBFβ/inv（16）占22.2%（6/27），MLL探針檢測(cè)t/del（11）（q23）占18.5%（5/27）。

2.3 2種方法聯(lián)合檢測(cè)結(jié)果

染色體核型分析、熒光原位雜交和聯(lián)合檢測(cè)結(jié)果見表1、表2。

表1 ALL患兒染色體核型分析、熒光原位雜交和聯(lián)合檢測(cè)結(jié)果 例

表2 AML患兒染色體核型分析、熒光原位雜交、聯(lián)合檢測(cè)結(jié)果 例

3 討論

本研究140例AL患兒中，ALL占70.7%，與文獻(xiàn)報(bào)道的兒童AL主要以ALL為主的結(jié)論一致[7]。染色體核型分析結(jié)果顯示，核型異常占54.3%（76/140），其中不完全計(jì)數(shù)占18.6%（26/140），未見分裂相占7.1%（10/140）；結(jié)構(gòu)異常多見。熒光原位雜交檢出80.7%（113/140）的AL患兒信號(hào)異常，高于染色體核型分析的異常檢出率。2種技術(shù)聯(lián)合檢測(cè)異常率為88.6%（124/140）。根據(jù)染色體異常的出現(xiàn)頻率，發(fā)現(xiàn)ALL主要涉及21 、1、6、X、14號(hào)染色體，AML主要涉及17、8、6、9、11號(hào)染色體，兩者并無(wú)相關(guān)性。

ALL-B患兒中常見t（12：21）（p13：q22）易位形成ETV6/RUNX1基因改變，因片段小，染色體異常核型分析難以檢測(cè)到該異常。本研究在染色體核型正常的20例患兒中發(fā)現(xiàn)信號(hào)異常16例（80%）；染色體不完全計(jì)數(shù)的22例患兒中，異常19例（83.4%）；9例染色體無(wú)分裂相患兒中，異常5例（55.6%），高于文獻(xiàn)[8-10]中20%～25%的檢出率。

染色體亞二倍體是白血病預(yù)后不良的標(biāo)志之一，而高超二倍體則提示預(yù)后較好。本研究ALL患兒中有2例存在染色體亞二倍體，16例存在高超二倍體；AML患兒中有5例存在亞二倍體，未發(fā)現(xiàn)高超二倍體。高超二倍體的染色體檢查顯帶常不理想，因此需要通過(guò)分子檢測(cè)才可以獲得更準(zhǔn)確的結(jié)果[11]。

染色體結(jié)構(gòu)畸變與特定的FAB亞型及預(yù)后密切相關(guān)的異常被定義為特異性異常。有80%～90%的AML患兒有特異性的染色體畸變，所以染色體特異性異常具有診斷意義[12]。本研究有8例作為AML-M3特異性標(biāo)志的t（15：17）和PML/RARa融合基因異常，提示預(yù)后良好，對(duì)此類患兒采用全反式維A酸治療有效。本研究中，患兒特異性BCR/ABL1融合基因異常信號(hào)占14.5%（18/124），高于文獻(xiàn)中ALL患兒2%～5%的檢出率[13]。

染色體核型分析和熒光原位雜交對(duì)AL的診斷、鑒別診斷和分型、預(yù)后、治療方案的選擇有著重要作用。雖然染色體核型分析在AL診斷中最為常用，但患兒骨髓取樣困難，或有骨髓干抽，細(xì)胞培養(yǎng)后中期分裂相少或制片質(zhì)量差等情況，易導(dǎo)致核型分析失敗。熒光原位雜交僅用少量骨髓樣本即可培養(yǎng)中期細(xì)胞，或無(wú)需培養(yǎng)的間期細(xì)胞，2～3 d即可報(bào)告結(jié)果。染色體核型分析對(duì)復(fù)雜核型的檢出率高于熒光原位雜交，熒光原位雜交雖對(duì)探針?lè)N類具有依賴性，且覆蓋區(qū)域受限，但探針特異性高、假陽(yáng)性少，能提高畸變類型診斷的準(zhǔn)確率[14]。

本研究染色體核型分析異常率為54.3%，熒光原位雜交異常率為80.7%，2種方法聯(lián)用異常率為88.6%。

綜上所述，細(xì)胞遺傳學(xué)檢測(cè)技術(shù)已成為白血病的分子檢測(cè)方法之一，兩者聯(lián)合可以提高異常檢出率，提供必不可少的診斷依據(jù)，在指導(dǎo)臨床治療與預(yù)后判斷中具有重要作用。