魯西黑頭羊肌肉細(xì)胞體外培養(yǎng)及誘導(dǎo)分化研究

劉昭華，王可*，崔緒奎，靳青，朱榮生，王建英，孟憲鋒，張冬梅，譚秀文

（1.山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所/山東省畜禽疫病防治與繁育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 濟(jì)南 250100；

2.山東省鄒城市畜牧業(yè)發(fā)展中心，山東 鄒城 273500）

我國肉羊存欄量和羊肉產(chǎn)量均居世界首位，是名副其實(shí)的養(yǎng)羊大國。但是羊肉生產(chǎn)仍存在兩大問題：一是隨著我國國民經(jīng)濟(jì)和人民生活水平的不斷提高，羊肉需求量日益擴(kuò)大，羊肉產(chǎn)量很難滿足市場需求；二是我國肉羊飼養(yǎng)水平較低，市場供應(yīng)的羊肉品質(zhì)普遍不高，優(yōu)質(zhì)高檔肉甚少。眾所周知，肌肉組織的生長發(fā)育直接決定產(chǎn)肉量和肉質(zhì)。因此，對肉羊肌肉生長發(fā)育影響因素進(jìn)行研究，有利于提高肌肉沉積速度和肉質(zhì)等級，促進(jìn)我國肉羊產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。

細(xì)胞體外培養(yǎng)是研究肌肉生長發(fā)育最有利的工具。這是因?yàn)榕c動(dòng)物體內(nèi)試驗(yàn)相比，體外培養(yǎng)的肌肉細(xì)胞遺傳背景、培養(yǎng)條件和活性狀態(tài)等都一致，所獲得的試驗(yàn)結(jié)果更穩(wěn)定、組內(nèi)數(shù)據(jù)差異較小，更具有說服力和參考價(jià)值［1-3］。然而目前關(guān)于肉羊肌肉細(xì)胞體外培養(yǎng)的研究甚少，其生長規(guī)律并不清楚。不同于其他組織來源的體細(xì)胞，肌肉細(xì)胞只有分化后才能發(fā)揮生理功能，但目前關(guān)于肉羊肌肉細(xì)胞誘導(dǎo)分化的研究僅局限于驗(yàn)證其是否具有肌源性，而對支撐生理功能的超微結(jié)構(gòu)研究報(bào)道較少。因此，本研究建立魯西黑頭羊肌肉細(xì)胞體外培養(yǎng)體系，并對其生長規(guī)律、誘導(dǎo)分化以及超微結(jié)構(gòu)等進(jìn)行探討，旨在為肌肉細(xì)胞研究提供生長和分化特性等方面的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 主要試劑 0.25%胰酶、DMEM/F12培養(yǎng)液，購自美國Gibco公司；馬血清（HS）、胎牛血清（FBS）、磷酸鹽緩沖液（PBS）、三抗混合液（青霉素、鏈霉素和兩性霉素），購自以色列BI公司；生肌決定因子（MyoD1）抗體、成肌調(diào)節(jié)因子（Myf5）抗體，購自北京Bioss公司；山羊抗兔IgG/FITC抗體，購自美國Jackson ImmunoResearch公司。

1.1.2 主要儀器 CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱（美國Thermo公司），倒置相差顯微鏡及全自動(dòng)顯微攝像裝置（日本Nikon公司），Moxi Z微型自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)儀（美國ORFLO公司），流氏細(xì)胞儀（美國BD公司），掃描電子顯微鏡、透射電子顯微鏡（日本HITACHI公司）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 肌肉細(xì)胞培養(yǎng) 將剛出生的魯西黑頭羊羔羊從養(yǎng)殖場立即送到無菌室的準(zhǔn)備間，窒息處死羔羊后剪開后腿內(nèi)側(cè)皮膚，剪下3～4塊1～2 cm3的肌肉組織，置于裝有PBS液（含2%三抗）的50 mL離心管中并放至超凈工作臺(tái)內(nèi)。用眼科鑷子將肌肉組織放在無菌塑料平皿上，PBS液（含2%三抗）清洗3～5次，將外圍組織去除，剩余組織繼續(xù)用PBS液清洗2～3遍后放在干燥的平皿上，剪碎約至1 mm3大小，加入0.25%胰酶（含0.05%EDTA）放置4℃冰箱過夜。第2 d放置37℃培養(yǎng)箱內(nèi)消化1 h，加入含10%FBS的DMEM/F12培養(yǎng)液終止消化，用移液器輕輕吹打至組織塊基本消失，先過400目細(xì)胞篩，收集濾液再過200目細(xì)胞篩，之后收集濾液300×g離心5 min，收集細(xì)胞沉淀后再用細(xì)胞培養(yǎng)液離心洗滌1次，加入細(xì)胞培養(yǎng)液（DMEM/F12+10%FBS+1%三抗）重懸接種到培養(yǎng)瓶內(nèi)，于37℃、5%CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。

1.2.2 肌源性鑒定 待細(xì)胞貼壁至80%～90%時(shí)棄掉培養(yǎng)液，加入0.25%胰酶（含0.05%EDTA），置于37℃培養(yǎng)箱消化處理3～5 min，待細(xì)胞徹底消化下來后加入培養(yǎng)液中和，300×g、5 min離心收集細(xì)胞，加入固定液室溫處理30 min，離心后棄上清液。加入含0.1%Trinton X-100的PBS液處理10 min，離心棄上清液，加入含3%BSA的PBS液處理2 h，之后加入一抗（MyoD1或Myf5）或?qū)φ誌gG，4℃孵育過夜。離心去除一抗，加入FITC連接的山羊抗兔IgG二抗，室溫避光孵育1 h。離心去上清液，將細(xì)胞重懸于200μL PBS液中，利用流式細(xì)胞儀進(jìn)行MyoD1或Myf5表達(dá)檢測。

1.2.3 生長曲線繪制 將細(xì)胞按1×104個(gè)/mL接種到6孔培養(yǎng)板中，接種當(dāng)日記為0 d，接種第2日記為1 d。每天盲選1個(gè)培養(yǎng)板，棄掉培養(yǎng)液，每孔加入1 mL 0.25%胰酶（含0.05%EDTA），放置于37℃培養(yǎng)箱消化處理3～5 min，待細(xì)胞徹底消化下來后加入2 mL培養(yǎng)液中和，用移液器充分混勻后吸取75μL，加入到芯片進(jìn)液口處，Moxi Z微型自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)儀立即讀數(shù)。剩余未處理的細(xì)胞隔天換液，直到試驗(yàn)結(jié)束。

1.2.4 成肌誘導(dǎo) 將細(xì)胞按1×104個(gè)/mL接種到T25培養(yǎng)瓶中，待細(xì)胞貼滿培養(yǎng)瓶底壁時(shí)棄掉培養(yǎng)液，加入5 mL成肌誘導(dǎo)培養(yǎng)液（DMEM/F12+2%HS+1%三抗），放置于37℃、5%CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，隔天換液。

1.2.5 樣品處理及電鏡觀察 將細(xì)胞按1×104個(gè)/mL接種到T75培養(yǎng)瓶中，待細(xì)胞貼壁90%～100%時(shí)，用塑料細(xì)胞刮將細(xì)胞輕輕刮下來，300×g、5 min離心收集細(xì)胞，加入電鏡固定液放置4℃冰箱保存。誘導(dǎo)分化肌肉細(xì)胞樣品的制備按成肌誘導(dǎo)處理，待形成肌管時(shí)收集細(xì)胞、固定保存。

透射電鏡樣品處理主要包括：（1）瓊脂預(yù)包埋：將固定處理的細(xì)胞離心，棄上清加入PBS，混勻漂洗3 min后再離心，重復(fù)洗滌3次。提前加熱溶解制備1%瓊脂糖溶液，稍冷卻后加入1.5 mL離心管內(nèi)，在瓊脂糖凝固之前將沉淀用鑷子挑起懸浮包裹于瓊脂糖內(nèi)。（2）后固定：PBS配制的1%鋨酸避光室溫固定2 h，PBS漂洗3次，每次15 min。（3）室溫脫水：樣品依次入30%、50%、70%、80%、95%、100%、100%酒精上行脫水，每次20 min，100%丙酮兩次，每次15 min。（4）滲透包埋：丙酮∶812包埋劑=1∶1于37℃處理2～4 h，丙酮∶812包埋劑=1∶2于37℃滲透過夜，純812包埋劑于37℃處理5～8 h。將純812包埋劑倒入包埋板，將樣品插入包埋板后37℃烤箱過夜。（5）聚合：包埋板放于60℃烤箱聚合48 h，取出樹脂塊備用。（6）超薄切片：樹脂塊于超薄切片機(jī)60～80 nm超薄切片，150目方華膜銅網(wǎng)撈片。（7）染色：銅網(wǎng)于2%醋酸鈾飽和酒精溶液避光染色8 min；70%酒精清洗3次；超純水清洗3次；2.6%枸櫞酸鉛溶液避二氧化碳染色8 min；超純水清洗3次，濾紙稍吸干。銅網(wǎng)切片放入銅網(wǎng)盒內(nèi)室溫干燥過夜。（8）透射電子顯微鏡下觀察，采集圖像分析。

掃描電鏡樣品處理主要包括：（1）后固定：固定好的樣品經(jīng)PBS漂洗3次，每次15 min。PBS配制1%鋨酸室溫避光固定1～2 h。PBS漂洗3次，每次15 min。（2）脫水：樣品依次入30%、50%、70%、80%、90%、95%、100%、100%酒精各15 min，乙酸異戊酯15 min。（3）干燥：將樣品放入臨界點(diǎn)干燥儀內(nèi)進(jìn)行干燥。（4）樣品導(dǎo)電處理：將樣品緊貼于導(dǎo)電碳膜雙面膠上放入離子濺射儀樣品臺(tái)上進(jìn)行噴金30 s左右。（5）掃描電子顯微鏡下觀察，采集圖像分析。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 肌肉細(xì)胞生長情況

肌肉細(xì)胞接種培養(yǎng)后，經(jīng)過短暫的懸浮狀態(tài)然后貼壁擴(kuò)增，其形態(tài)隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長而發(fā)生改變（圖1）。第1 d（接種當(dāng)日記為0 d），細(xì)胞散在貼壁生長，呈不規(guī)則多角形；隨著細(xì)胞不斷分裂擴(kuò)增，生長空間逐漸減少，第3 d細(xì)胞呈長條形；第6 d開始零星出現(xiàn)分化的肌管，隨培養(yǎng)時(shí)間的延長，肌管越來越多；直到20 d左右，肌肉細(xì)胞全部分化為肌管；之后肌管開始聚集、隆起，最后形成團(tuán)狀類似肉糜的顆粒。

圖1 不同培養(yǎng)天數(shù)肌肉細(xì)胞生長形態(tài)（100×）

肌肉細(xì)胞在最初的1～2 d內(nèi)處于緩慢生長的潛伏期；從第3 d開始直到第6 d，細(xì)胞進(jìn)入快速生長的指數(shù)增長期；從第7 d開始直到第20 d左右，細(xì)胞生長達(dá)到飽和密度進(jìn)入平臺(tái)期；從第21 d開始，細(xì)胞數(shù)量逐漸降低，進(jìn)入衰退期（圖2）。

圖2 肌肉細(xì)胞生長曲線

2.2 肌源性鑒定

利用流式細(xì)胞儀檢測肌肉細(xì)胞表達(dá)MyoD1和Myf5陽性率，結(jié)果（圖3）發(fā)現(xiàn)，MyoD1和Myf5表達(dá)陽性率均在95%以上，說明培養(yǎng)的肌肉細(xì)胞純度較高。

圖3 肌肉細(xì)胞MyoD1和Myf5陽性率

2.3 誘導(dǎo)分化

細(xì)胞接種培養(yǎng)后，于第3 d完全貼滿培養(yǎng)瓶底壁，這時(shí)更換誘導(dǎo)分化液或正常換液（即為分化處理的第1 d），結(jié)果（表1、圖4）發(fā)現(xiàn)，正常換液組出現(xiàn)肌管時(shí)間為分化處理的第4 d，肌管聚集時(shí)間為第19 d；誘導(dǎo)分化組出現(xiàn)肌管時(shí)間為分化處理的第2 d，肌管聚集時(shí)間為第5 d。說明自然狀態(tài)下肌肉細(xì)胞也能分化成肌管，但分化進(jìn)程較誘導(dǎo)分化慢。

表1 肌肉細(xì)胞在自然或誘導(dǎo)下的分化進(jìn)程 （d）

圖4 肌肉細(xì)胞在自然或誘導(dǎo)下的分化形態(tài)（100×）

2.4 超微結(jié)構(gòu)

肌肉細(xì)胞經(jīng)誘導(dǎo)分化后，其超微結(jié)構(gòu)如圖5、圖6所示。細(xì)胞呈扁平、不規(guī)則長條形，簇?fù)懑B壓在一起；細(xì)胞表面伸出絲足，質(zhì)膜分布有很多空隙孔。線粒體十分豐富，為橢圓形，內(nèi)嵴發(fā)達(dá)、致密；核膜完整，核內(nèi)有電子致密的核仁；核膜外側(cè)有數(shù)量較多的糙面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，表面核糖體清晰可見；脂滴的電子密度均勻，大量糖原散在細(xì)胞質(zhì)中；肌原纖維束致密、排列規(guī)則；細(xì)胞間緊密連接明顯。

圖5 肌肉細(xì)胞膜表面超微結(jié)構(gòu)

3 討論與結(jié)論

魯西黑頭羊是山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院培育的綿羊新品種，因其具有早熟、多胎、生長發(fā)育快、肉質(zhì)好等優(yōu)良特性，目前已成為山東省肉羊養(yǎng)殖的主推品種，也被新疆、黑龍江、青海、內(nèi)蒙古、河南等?。▍^(qū)）引種推廣，取得了良好的經(jīng)濟(jì)效益。為了更好地研究和利用魯西黑頭羊優(yōu)良的肉質(zhì)特性，本研究構(gòu)建科學(xué)、高效的魯西黑頭羊肌肉細(xì)胞培養(yǎng)體系，為后續(xù)進(jìn)行肉質(zhì)和生長速度研究提供有利工具。

目前肌肉細(xì)胞培養(yǎng)主要采取兩種方法，即組織塊培養(yǎng)法［4］和酶消化法［5］。組織塊培養(yǎng)法直接在培養(yǎng)瓶/培養(yǎng)皿內(nèi)接種剪碎的肌肉組織小塊，10～15 d后細(xì)胞從組織塊周圍游離生長出來，細(xì)胞密度不均勻，生長狀態(tài)不一致；酶消化法將剪碎的肌肉組織小塊進(jìn)一步加入蛋白酶消化處理成單個(gè)游離的細(xì)胞，加入培養(yǎng)液后培養(yǎng)，第2 d有細(xì)胞散在貼壁生長，細(xì)胞分布均勻，生長狀態(tài)一致。因此，本研究利用0.25%胰酶（含0.05%EDTA）消化處理肌肉組織，放置4℃冰箱過夜；為獲得更好的消化效果，第2 d于37℃繼續(xù)消化1 h，這樣既讓胰酶充分浸入組織，又不會(huì)造成消化過度，提高細(xì)胞活性，利于貼壁生長。

生長曲線是反映細(xì)胞增殖速度的重要指標(biāo)，包括潛伏期、指數(shù)增長期、平臺(tái)期和衰退期四個(gè)階段。細(xì)胞接種后經(jīng)過短暫的懸浮狀態(tài)，然后貼壁生長，不斷擴(kuò)增。在培養(yǎng)的最初幾天，肌肉細(xì)胞增殖速度相對較慢，處于潛伏期。潛伏期時(shí)間長短不定，1.5 d［6］、3 d［7］都有報(bào)道，本研究中潛伏期為2 d，這可能與接種的密度、提供的營養(yǎng)物質(zhì)、培養(yǎng)環(huán)境不同有關(guān)。之后細(xì)胞進(jìn)入指數(shù)增殖期，這一時(shí)期細(xì)胞分裂速度最快，大量擴(kuò)增并擠壓生長空間，細(xì)胞由最初的不規(guī)則多角形變?yōu)殚L條形。指數(shù)增殖期維持4 d左右，與Wu等［7］報(bào)道的基本一致。由于細(xì)胞存在生長接觸抑制，在生長空間消耗殆盡的情況下，細(xì)胞不再增殖，這時(shí)處于平臺(tái)期。本研究中肌肉細(xì)胞平臺(tái)期持續(xù)13 d左右，與其他組織來源的細(xì)胞相比［8-10］，處于平臺(tái)期的時(shí)間較長。這可能因?yàn)檫@一時(shí)期肌肉細(xì)胞雖然不再增殖，但在營養(yǎng)物質(zhì)充足的情況下，細(xì)胞開始分化，與出現(xiàn)肌管的時(shí)間點(diǎn)一致。

體外培養(yǎng)的肌肉細(xì)胞在分化階段發(fā)揮其生理功能。細(xì)胞出現(xiàn)接觸抑制后不再增殖，但在營養(yǎng)物質(zhì)充足的情況下能自發(fā)分化成肌管，但分化速度較慢。采用含有特定物質(zhì)的培養(yǎng)液對肌肉細(xì)胞進(jìn)行誘導(dǎo)分化能夠提高分化速度和效率。已有報(bào)道表明，不同物種的肌肉細(xì)胞進(jìn)行成肌誘導(dǎo)采用在培養(yǎng)液中添加2%馬血清［11，12］，也有報(bào)道采用10%馬血清［13］。本研究采用在DMEM/F12培養(yǎng)液中添加2%馬血清進(jìn)行成肌誘導(dǎo)，取得了很好的分化效果。但試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)必須在肌肉細(xì)胞出現(xiàn)接觸抑制后進(jìn)行誘導(dǎo)分化，如果提前換入誘導(dǎo)分化液，2%馬血清不能滿足細(xì)胞繼續(xù)增殖的營養(yǎng)需要，就不會(huì)出現(xiàn)生長接觸抑制，也就不能進(jìn)行分化，這一結(jié)果與Wu等［7］的結(jié)果不一致。

超微結(jié)構(gòu)是細(xì)胞發(fā)揮生理功能的物質(zhì)基礎(chǔ)。本研究利用掃描電鏡觀察到分化的肌肉細(xì)胞呈長條形，簇?fù)頂D壓在一起，與光鏡觀察到的結(jié)果一致。肌肉細(xì)胞在增殖階段由于存在生長接觸抑制，所以細(xì)胞都是單層擴(kuò)增直至貼滿；誘導(dǎo)分化后則突破這一限制，細(xì)胞聚集、隆起，最后形成團(tuán)狀結(jié)構(gòu)，這與小鼠肌肉細(xì)胞［13］、牛肌肉細(xì)胞［14］誘導(dǎo)分化結(jié)果一致。肌肉細(xì)胞由于自身的運(yùn)動(dòng)屬性，肌原纖維非常發(fā)達(dá)。本研究發(fā)現(xiàn)，大量肌原纖維成束存在，有的存在于質(zhì)膜附近，有的在胞漿里面。胞漿內(nèi)含有大量的糖原和脂肪滴，線粒體十分豐富，內(nèi)嵴致密、發(fā)達(dá)，可為肌肉細(xì)胞活動(dòng)提供能量。糙面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)發(fā)達(dá)，表面核糖體清晰可見，可進(jìn)行合成蛋白的轉(zhuǎn)運(yùn)。這些細(xì)胞器正常、有序的運(yùn)行，能夠?yàn)榧∪饧?xì)胞生長和發(fā)揮功能提供有利保障。

本研究利用酶消化法成功構(gòu)建魯西黑頭羊肌肉細(xì)胞培養(yǎng)體系，首次報(bào)道肌肉細(xì)胞不同于其他組織來源細(xì)胞的生長規(guī)律，以及誘導(dǎo)分化后符合自身運(yùn)動(dòng)屬性特征的超微結(jié)構(gòu)。