微波超聲協(xié)同提取金盞菊皂苷工藝及其抗氧化性研究

只德賢，覃海波，李建穎

（天津商業(yè)大學(xué)生物技術(shù)與食品科學(xué)學(xué)院，天津市食品生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，國(guó)家級(jí)食品與藥品實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心，天津 300134）

金盞菊又名大金盞花、金盞花、山金菊等，為菊科植物金盞菊（Calendula officinalis L.）的干燥全草。其性寒、味苦，具有清熱解毒、涼血調(diào)經(jīng)的作用。金盞菊原產(chǎn)于歐洲南部和埃及，現(xiàn)在世界各地均有分布，資源極其豐富，在我國(guó)亦有大量栽培。金盞菊應(yīng)用廣泛，不僅可用于化學(xué)工業(yè)、化妝品行業(yè)，還可用于食品和醫(yī)藥行業(yè)。金盞菊早期用于治療靜脈曲張，外用治療褥瘡等皮膚病[1]。現(xiàn)代研究表明金盞菊不僅具有良好的抗氧化[2]、抗炎[3]、抗菌活性[4]，還具有降血糖[5]、保護(hù)腸黏膜[6]的作用。金盞菊提取物對(duì)皮膚有美白、保濕作用，能夠延緩皮膚老化[7]。MIGUEL等[8]研究顯示，金盞菊提取物對(duì)4種腫瘤細(xì)胞具有明顯的抑制作用；JADOON等[9]的研究表明含有金盞菊提取物的藥膏可減輕紫外線對(duì)皮膚造成的傷害；PREETHI等[10]研究顯示，金盞菊提取物對(duì)C57BL/6小鼠B16F-10黑色素瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移有抑制作用。對(duì)金盞菊化學(xué)成分的研究表明[11]，它富含黃酮類、揮發(fā)油、皂苷類、色素類等多種有效成分，同時(shí)還含有碳水化合物、脂類、蛋白質(zhì)、維生素、可溶性糖類等多種營(yíng)養(yǎng)成分。近年來對(duì)金盞菊化學(xué)成分的研究多集中在色素、揮發(fā)油和黃酮類成分[12-13]，對(duì)其皂苷類成分的提取方法研究較少，且對(duì)金盞菊活性的研究多集中在金盞菊提取物的活性研究，對(duì)金盞菊皂苷類成分的活性研究較少。

微波輔助提取法具有加速細(xì)胞破壁、提高提取效率、節(jié)約溶劑等優(yōu)點(diǎn)，且設(shè)備簡(jiǎn)易、選擇性高，目前廣泛應(yīng)用于黃酮類、多糖類、色素類等成分的提取[14-15]。超聲波輔助提取技術(shù)是利用超聲波的強(qiáng)振動(dòng)使細(xì)胞破壁并充分進(jìn)入到溶劑中，可以有效地縮短提取時(shí)間，提高提取效率，目前已廣泛應(yīng)用于大多數(shù)天然產(chǎn)物的活性成分的提取[16]。

本文采用響應(yīng)面法對(duì)微波超聲協(xié)同提取金盞菊皂苷的工藝進(jìn)行優(yōu)化，并對(duì)其體外抗氧化活性進(jìn)行初步研究，以期為更好地開發(fā)利用金盞菊資源提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

金盞菊：安國(guó)市旭芳中藥材經(jīng)營(yíng)有限公司；2，2-聯(lián)氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二銨鹽（ABTS）、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）：美國(guó)Sigma公司；2，4，6-三吡啶基三嗪 [2，4，6-Tris（2-pyridyl）-s-triazine，TPTZ]：上海阿拉丁生化科技股份有限公司；齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)品：上海源葉生物科技有限公司；香草醛：北京索萊寶科技有限公司；甲醇、乙醇、冰醋酸、濃硫酸（分析純）：天津鑫橋化工貿(mào)易有限公司。

XO-SM100超聲波微波協(xié)同反應(yīng)系統(tǒng)：南京先歐儀器制造有限公司；UV-2802S紫外可見分光光度計(jì)：上海尤尼柯公司；RV10旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：廣州IKA儀器設(shè)備有限公司；Quintix125D分析天平：北京賽多利斯科學(xué)儀器有限公司；Integral 10超純水系統(tǒng)：德國(guó)Merck公司；DFT-500中藥粉碎機(jī)：浙江榮浩工貿(mào)有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 金盞菊皂苷提取工藝

準(zhǔn)確稱取金盞菊粉末2.00 g，在一定的液料比下加入不同濃度的乙醇溶液，在一定的微波功率下處理2 min，固定提取溫度為50℃，提取一定的時(shí)間，抽濾，得到金盞菊皂苷提取液。

1.2.2 單因素試驗(yàn)

1.2.2.1 液料比對(duì)提取率的影響

固定乙醇濃度為60%，微波功率400 W，微波時(shí)間2 min，提取溫度50℃，超聲時(shí)間10 min，考察液料比為 5∶1、10∶1、15∶1、20∶1、25∶1（mL/g）對(duì)金盞菊皂苷提取率的影響。

1.2.2.2 乙醇濃度對(duì)提取率的影響

固定液料比為 20∶1（mL/g），微波功率 400 W，微波時(shí)間2 min，提取溫度50℃，超聲時(shí)間10 min，考察乙醇濃度為30%、40%、50%、60%和70%對(duì)金盞菊皂苷提取率的影響。

1.2.2.3 微波功率對(duì)提取率的影響

固定乙醇濃度為 60%，液料比為 20∶1（mL/g），微波時(shí)間2 min，提取溫度50℃，超聲時(shí)間10 min，考察微波功率為200、300、400、500 W和600 W對(duì)金盞菊皂苷提取率的影響。

1.2.2.4 超聲時(shí)間對(duì)提取率的影響

固定乙醇濃度為 60%，液料比為 20∶1（mL/g），微波功率400 W，微波時(shí)間2 min，提取溫度50℃，考察超聲時(shí)間為5、10、15、20 min和25 min對(duì)金盞菊皂苷提取率的影響。

1.2.3 響應(yīng)面試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，根據(jù)Box-Behnken的中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，利用Design-Expert.V8.0.6.1軟件以皂苷提取率為響應(yīng)值，選取液料比、乙醇濃度、微波功率、超聲時(shí)間為自變量，設(shè)計(jì)四因素三水平的響應(yīng)面試驗(yàn)，對(duì)金盞菊皂苷的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化。響應(yīng)面的因素水平見表1。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平Table 1 Factors and levels of response surface analysis

1.2.4 皂苷提取率的測(cè)定

準(zhǔn)確稱取齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)品10.00 mg，置于100 mL容量瓶中，甲醇溶解并定容，即得濃度為0.1 mg/mL的齊墩果酸儲(chǔ)備液。

準(zhǔn)確吸取齊墩果酸儲(chǔ)備液 0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mL，于60℃水浴揮干溶劑，分別加入5%的香草醛-冰醋酸0.2 mL和高氯酸0.8 mL，60℃水浴中加熱15 min，取出流水冷卻使其充分反應(yīng)，分別加入5 mL冰醋酸，搖勻，靜置30 min，在546 nm處測(cè)定吸光度，并設(shè)空白對(duì)照。

以吸光度為縱坐標(biāo)，齊墩果酸的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線[17]?；貧w方程為y=6.337 9x+0.022 6，R2=0.999 4，線性范圍0.02 mg/mL～0.12 mg/mL。金盞菊皂苷的計(jì)算公式（1）如下。

式中：W為皂苷提取率，mg/g；c為根據(jù)吸光度計(jì)算出的皂苷質(zhì)量濃度，mg/mL；D為溶液稀釋倍數(shù)；V為供試品溶液體積，mL；m為金盞菊取樣量，g。

1.2.5 金盞菊皂苷體外抗氧化作用評(píng)價(jià)

1.2.5.1 DPPH自由基清除率的測(cè)定

參照黃煦杰等[18]的方法，分別取2.0mL濃度為0.05、0.10、0.15、0.20、0.25、0.30、0.40、0.50 mg/mL 的金盞菊皂苷提取液和VC溶液，加入2.0 mL濃度為0.2 mmol/L的DPPH-乙醇溶液，置于暗處?kù)o置30 min，測(cè)定517 nm處的吸光度A，根據(jù)公式（2）計(jì)算DPPH自由基清除率。

式中：A為樣品溶液的吸光度；A1為樣品溶液本底吸光度；A0為空白對(duì)照溶液吸光度。

1.2.5.2 ABTS+自由基清除率的測(cè)定

參照楊潔等[19]的方法，取2 mmol/L ABTS溶液50 mL和70 mmol/L過硫酸鉀溶液200 mL混勻后，低溫放置12 h，使用時(shí)用無水乙醇稀釋，使其在734 nm波長(zhǎng)處吸光度A0為0.70±0.02。分別取0.1 mL濃度為0.05、0.10、0.15、0.20、0.25、0.30、0.40、0.50 mg/mL 的金盞菊皂苷提取液和VC溶液，加入1.9 mL稀釋后的ABTS+溶液，靜置15 min，測(cè)定734 nm處的吸光度A，根據(jù)公式（3）計(jì)算ABTS+自由基清除率。

式中：A0為稀釋后的ABTS+溶液的吸光度；A為樣品溶液在734 nm處測(cè)定的吸光度；A空為用無水乙醇代替樣品在734 nm處測(cè)定的吸光度。

1.2.5.3 鐵離子還原能力（ferric reducing antioxidant power，F(xiàn)RAP）的測(cè)定

FRAP工作液：配制0.3 mol/L pH3.6的醋酸鈉緩沖液、10 mmol/L的TPTZ溶液和20 mmol/L的三氯化鐵溶液，按10∶1∶1的體積比混合即得FRAP工作液。

參照Xiong等[20]的方法，分別取0.1mL濃度為0.05、0.10、0.15、0.20、0.25、0.30、0.40、0.50 mg/mL 的金盞菊皂苷提取液和VC溶液，加入3 mL FRAP工作液，充分混合均勻后，在37℃水浴避光反應(yīng)10min，在593nm測(cè)定吸光度。按照上述方法，測(cè)定FeSO4系列標(biāo)準(zhǔn)溶液（濃度范圍0.1 mmol/L～1.0 mmol/L）的吸光度，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)回歸方程計(jì)算出對(duì)應(yīng)的FeSO4濃度，即為FRAP值，此值越大，表明其還原能力越強(qiáng)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

本試驗(yàn)操作均平行測(cè)定3次，取平均值。采用Design-Expert.V8.0.6.1軟件進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)，SPSS 20.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果與分析

2.1.1 液料比對(duì)金盞菊皂苷提取率的影響

液料比對(duì)金盞菊皂苷提取率的影響見圖1。

圖1 液料比對(duì)金盞菊皂苷提取率的影響Fig.1 The effect of material liquid ratio on extraction rate of Calendula officinalis saponins

如圖 1 所示，在液料比為 10∶1（mL/g）～20∶1（mL/g）時(shí)，隨著溶劑的增加，金盞菊皂苷提取率呈上升狀態(tài)，液料比為 20∶1（mL/g）時(shí)，皂苷提取率最高，達(dá)到 17.36mg/g，當(dāng)液料比超過20∶1（mL/g）時(shí)，金盞菊皂苷提取率呈下降趨勢(shì)。可能是溶劑太少不利于皂苷的溶出，溶劑太多導(dǎo)致非皂苷成分溶出增加，皂苷提取率下降。故選取液料比 15∶1、20∶1、25∶1（mL/g）進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)。

2.1.2 乙醇濃度對(duì)金盞菊皂苷提取率的影響

乙醇濃度對(duì)金盞菊皂苷提取率的影響見圖2。

圖2 乙醇濃度對(duì)金盞菊皂苷提取率的影響Fig.2 The effect of ethanol concentration on extraction rate of Calendula officinalis saponins

如圖2所示，當(dāng)乙醇濃度在30%～60%之間時(shí)，金盞菊皂苷提取率隨乙醇濃度的升高而增大，當(dāng)乙醇濃度為60%時(shí)，金盞菊皂苷提取率達(dá)到最大，為18.22 mg/g，之后隨著乙醇濃度的升高，金盞菊皂苷的提取率反而降低，可能是由于隨著乙醇濃度的增加，溶液的極性發(fā)生了變化，一些非皂苷成分的溶出增加，導(dǎo)致了提取率下降。因此選取乙醇濃度50%、60%、70%進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)。

2.1.3 微波功率對(duì)金盞菊皂苷提取率的影響

微波功率對(duì)金盞菊皂苷提取率的影響見圖3。

圖3 微波功率對(duì)金盞菊皂苷提取率的影響Fig.3 The effect of microwave power on extraction rate of Calendula officinalis saponins

如圖3所示，隨著微波功率的升高金盞菊皂苷提取率增大，是因?yàn)榻鸨K菊中各個(gè)成分吸收的能量使分子的無規(guī)則熱運(yùn)動(dòng)加強(qiáng)導(dǎo)致擴(kuò)散速率增加，當(dāng)微波功率為400 W時(shí)，金盞菊皂苷提取率為18.46 mg/g，達(dá)到最大，之后隨著微波功率升高，金盞菊皂苷的提取率不升反而呈現(xiàn)小幅度下降，可能是因?yàn)楦邚?qiáng)度的微波作用產(chǎn)生過高的溫度，導(dǎo)致了皂苷的降解。因此選取微波功率300、400、500 W進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)。

2.1.4 超聲時(shí)間對(duì)金盞菊皂苷提取率的影響

超聲時(shí)間對(duì)金盞菊皂苷提取率的影響見圖4。

圖4 超聲時(shí)間對(duì)金盞菊皂苷提取率的影響Fig.4 The effect of ultrasonic time on extraction rate of Calendula officinalis saponins

由圖4可知，超聲時(shí)間在5 min～10 min內(nèi)，隨著超聲時(shí)間的延長(zhǎng)，皂苷提取率增加，超聲時(shí)間為10 min時(shí)其提取率最高，達(dá)到18.23 mg/g。之后隨著超聲時(shí)間的延長(zhǎng)，金盞菊皂苷的提取率變化不大，說明微波超聲協(xié)同作用下能夠提高提取率，超聲10 min時(shí)皂苷成分基本全部溶出，隨著超聲時(shí)間的延長(zhǎng)，溶出不再增加。因此選取5、10、15 min進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)。

2.2 響應(yīng)面法優(yōu)化結(jié)果與分析

2.2.1 模型建立及方差分析

利用Design-Expert.V8.0.6.1軟件對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行響應(yīng)面分析，響應(yīng)面設(shè)計(jì)結(jié)果見表2。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果Table 2 Program and results of response surface method

續(xù)表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果Continue table 2 Program and results of response surface method

經(jīng)回歸擬合后，得出模型的二次多項(xiàng)回歸方程為Y=21.110 4-0.372 5A-0.517 7B+0.221 0C-0.223 2D-0.082 50AB+0.312 0AC-0.431 5AD+0.372 0BC+0.403 5 BD-0.7320CD-0.6753A2-0.6783B2-0.7128C2-1.2273D2。

對(duì)上述回歸模型的方差及顯著性分析結(jié)果見表3。

表3 模型回歸方差分析結(jié)果Table 3 Variance analysis results of regression equation

由表3可知，模型的p<0.000 1，達(dá)到極顯著性，失擬項(xiàng)的p值為0.432 5，不顯著，表明該模型的擬合度良好，R2=0.960 7，表明有96.07%的試驗(yàn)數(shù)據(jù)可以運(yùn)用該模型進(jìn)行分析，試驗(yàn)誤差小，模型的可靠性較高。因此，可用該模型分析和預(yù)測(cè)金盞菊皂苷的提取率。

由表3還可看出，模型中一次項(xiàng)A和B，二次項(xiàng)A2、B2、C2和 D2，交互項(xiàng) AD、BD 和 CD 對(duì)金盞菊皂苷提取率影響極顯著（p<0.01）；一次項(xiàng)C和D，交互項(xiàng)AC和BC對(duì)金盞菊皂苷提取率影響顯著（p<0.05），根據(jù)F值大小可以判斷出各因素對(duì)金盞菊皂苷提取率的影響大小依次為B（乙醇濃度）>A（液料比）>D（超聲時(shí)間）>C（微波功率）。

2.2.2 因素間交互作用分析

通過Design-Expert.v8.0.6.1軟件繪制的響應(yīng)面立體曲面圖進(jìn)一步分析和評(píng)價(jià)兩個(gè)因素之間的交互作用，其曲面越陡峭，說明兩個(gè)因素的交互作用越顯著，各因素交互作用響應(yīng)面圖見圖5。由圖5可以看出，AD、BD和CD的交互作用對(duì)金盞菊皂苷提取率的影響極顯著，這與表3的方差分析結(jié)果相一致。

圖5 各因素交互作用對(duì)金盞菊皂苷提取率的影響Fig.5 Response surface plot and contour plot of the effects of each factor on the extraction rate of Calendula officinalis saponins

2.2.3 驗(yàn)證試驗(yàn)

由回歸方程得到的金盞菊皂苷最佳提取工藝條件為液料比 19.08∶1（mL/g），乙醇濃度 56.10%，微波功率408.99 W，超聲時(shí)間9.25 min。在此工藝條件下金盞菊皂苷提取率的預(yù)測(cè)值為21.272 mg/g?？紤]到實(shí)際操作的可行性，將上述最佳工藝條件修正為液料比19∶1（mL/g），乙醇濃度 56%，微波功率 410 W，超聲時(shí)間9.2 min，進(jìn)行3次平行試驗(yàn)，得到金盞菊皂苷提取率平均值為21.298 mg/g，與理論預(yù)測(cè)值相差2.6%，說明由該模型優(yōu)化的最佳提取工藝條件穩(wěn)定可靠，具有實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。

2.3 金盞菊皂苷體外抗氧化活性測(cè)定結(jié)果

2.3.1 DPPH自由基清除能力

不同濃度的金盞菊皂苷對(duì)DPPH自由基的清除作用見圖6。

圖6 不同濃度的金盞菊皂苷對(duì)DPPH自由基的清除作用Fig.6 Scavenging ability of different concentration of Calendula officinalis saponins on DPPH

由圖6可知，金盞菊皂苷和VC溶液對(duì)DPPH自由基的清除率隨濃度的增加而逐漸增強(qiáng)，呈現(xiàn)明顯的正相關(guān)性。金盞菊皂苷濃度為0.50 mg/mL時(shí)，其對(duì)DPPH自由基清除率達(dá)到61.36%，IC50為0.282 mg/mL，但弱于VC（IC50為0.028 mg/mL），表明金盞菊皂苷對(duì)DPPH自由基具有一定的清除能力及抗氧化活性。

2.3.2 ABTS+自由基清除能力

不同濃度的金盞菊皂苷對(duì)ABTS+自由基的清除作用見圖7。

圖7 不同濃度的金盞菊皂苷對(duì)ABTS+自由基的清除作用Fig 7 Scavenging ability of different concentration of Calendula officinalis saponins on ABTS+

由圖7可知，金盞菊皂苷和VC溶液對(duì)ABTS+自由基的清除率隨濃度的增加而逐漸增強(qiáng)。金盞菊皂苷濃度為0.50 mg/mL時(shí)，其對(duì)ABTS+自由基的清除率達(dá)到60.38%，IC50為0.337 mg/mL，但弱于VC（IC50為0.063 mg/mL），表明金盞菊皂苷對(duì)ABTS+自由基具有一定清除能力及抗氧化活性。

2.3.3 鐵離子還原能力測(cè)定結(jié)果

FRAP法測(cè)定金盞菊皂苷還原能力如圖8所示。

圖8 不同濃度金盞菊皂苷的鐵離子還原能力Fig 8 Reducing power of different concentration of Calendula officinalis saponins

由圖8可知，F(xiàn)RAP法測(cè)定抗氧化活性有劑量依賴關(guān)系，在測(cè)定的濃度范圍內(nèi)，隨著濃度的增加，金盞菊皂苷和VC的FRAP值增大，且呈一定的正相關(guān)，表明金盞菊皂苷具有一定的還原能力。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)采用微波超聲協(xié)同提取金盞菊皂苷，通過單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面優(yōu)化得到的最佳提取工藝條件為液料比 19∶1（mL/g），乙醇濃度 56%，微波功率 410 W，超聲時(shí)間9.2 min。在該條件下，金盞菊皂苷提取率為21.298 mg/g?？寡趸囼?yàn)結(jié)果表明金盞菊皂苷對(duì)ABTS+自由基和DPPH自由基均具有良好的清除能力，且具有良好的還原能力和抗氧化活性。結(jié)果表明，微波超聲聯(lián)合提取金盞菊皂苷具有顯著的協(xié)同作用，能夠明顯地縮短提取時(shí)間，提高提取效率。金盞菊資源豐富，具有多種有效成分，基于以上研究，金盞菊皂苷具有良好的清除自由基能力和抗氧化活性，為金盞菊的進(jìn)一步開發(fā)和利用提供一定的理論依據(jù)。