龔柯 薛炮 溫小霞 廖飛飛 孫濱 彭澤群 程式華 曹立勇 張迎信 吳瑋勛 孫廉平,* 占小登,*

水稻特大粒種質(zhì)BG1和優(yōu)質(zhì)恢復(fù)系華占的粒形基因研究及相關(guān)功能標(biāo)記開發(fā)

龔柯1薛炮1溫小霞1廖飛飛1孫濱2彭澤群1程式華1曹立勇1張迎信1吳瑋勛1孫廉平1,*占小登1,*

（1中國水稻研究所/水稻生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/浙江省超級稻研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，杭州 311401；2上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院 作物育種栽培研究所，上海 201403;*通信聯(lián)系人, E-mail: sunlianping@caas.cn, zhanxiaodeng@caas.cn）

【】特異種質(zhì)資源的發(fā)掘與利用是水稻優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)育種的重要手段之一。明確特大籽粒種質(zhì)BG1（Big Grain 1）和育種上廣泛配組的優(yōu)質(zhì)恢復(fù)系華占攜帶的部分粒形基因等位變異類型，并開發(fā)相應(yīng)基因的功能標(biāo)記，有助于加快粒形基因的育種應(yīng)用，提高水稻粒形精準(zhǔn)改良的效率。對BG1和華占中的9個主效粒形基因（、、、、、、、、）的目的片段進(jìn)行測序分析。并根據(jù)、、、、和的測序結(jié)果，開發(fā)了鑒定其基因分型的功能標(biāo)記。與日本晴相比，特大粒種質(zhì)BG1在檢測的9個主效粒形基因中有5個表現(xiàn)為功能缺失型（、、、、），1個稀有等位變異（）和1個外顯子可變剪切型（）；與日本晴相比，華占在檢測的9個主效粒形基因中有3個（、、）存在差異。根據(jù)測序結(jié)果開發(fā)了、、、、、、和的功能標(biāo)記，并利用15個水稻種質(zhì)進(jìn)行檢測，檢測結(jié)果中除了的標(biāo)記TGW6-Del 僅可用于鑒定是否含有功能缺失型的等位變異外，另外7個標(biāo)記均為可準(zhǔn)確鑒定基因型。與日本晴相比，特大粒種質(zhì)BG1中調(diào)控粒長的基因、、、、和之間可能存在復(fù)雜的互作調(diào)控通路，而不是簡單的效應(yīng)累加，粒寬特征可能是、的累加效應(yīng)。優(yōu)質(zhì)恢復(fù)系華占的細(xì)長粒形可能是、和的互作效應(yīng)所致。本研究中開發(fā)的功能標(biāo)記可以用于水稻分子標(biāo)記輔助育種。

粒形; 粒長; 粒寬; 粒重; 功能標(biāo)記

水稻是世界上最重要的谷類作物之一，也是世界上約一半人口的主要糧食來源。水稻產(chǎn)量的穩(wěn)步提高對于我國乃至全球的糧食生產(chǎn)具有重要意義。水稻產(chǎn)量主要由三個因素決定：單株穗數(shù)、每穗粒數(shù)和粒重[1]。其中，粒形是影響水稻粒重的最重要因素之一，同時(shí)也影響著稻米品質(zhì)。粒形有關(guān)的三個主要性狀分別為粒長、粒寬和千粒重。這三個性狀均受多基因共同調(diào)控，且具有典型的數(shù)量性狀遺傳特點(diǎn)。

目前關(guān)于水稻粒形基因的調(diào)控研究大多從單個基因出發(fā)，很少涉及到多個粒形基因的互作。調(diào)控粒形的主效基因中，基因編碼一個由232個氨基酸組成的跨膜蛋白，該蛋白含有OSR結(jié)構(gòu)域、一個跨膜區(qū)、TNFR/NGFR家族中富含半胱氨酸的同源區(qū)域和一個VWFC模塊，這四個結(jié)構(gòu)域均有調(diào)節(jié)籽粒大小的功能，在其外顯子序列的第165位堿基發(fā)生C→A的替換，導(dǎo)致本該編碼半胱氨酸的密碼子（TGC）變成了一個終止密碼子（TGA），使OSR結(jié)構(gòu)域功能缺失導(dǎo)致籽粒變長；TNFR/NGFR和VWFC 結(jié)構(gòu)域可以抑制OSR的功能，這兩個功能域功能缺失使籽粒變短；同時(shí)也是調(diào)控粒寬和粒厚的微效QTL[2-6]。/ qGL3編碼一個包含兩個Kelch功能域的蛋白磷酸酶PPKL家族的絲氨酸/蘇氨酸磷酸酶，可直接將細(xì)胞周期蛋白T1:3去磷酸化，同時(shí)也可以調(diào)控OsGSK3的磷酸化和穩(wěn)定性來抑制油菜素內(nèi)酯（Brassinolide, BR）信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，進(jìn)而調(diào)控粒長[7-8]；發(fā)生在其外顯子序列第1092處的單堿基替換（C→G），導(dǎo)致編碼的天冬氨酸的密碼子（GAC）變成了GAG（谷氨酸），使編碼蛋白的第二個Kelch功能域上保守的AVLDT區(qū)域發(fā)生變化，導(dǎo)致籽粒變長[9-10]。轉(zhuǎn)錄因子qLGY3作為G蛋白二聚體下游的關(guān)鍵效應(yīng)子，包含8個外顯子和7個內(nèi)含子，其最后一個外顯子的5′端與內(nèi)含子交界處發(fā)生插入/缺失突變，產(chǎn)生可變剪接蛋白OsMADS1lgy3，使得籽粒變細(xì)長，并可顯著改善稻米品質(zhì)；Gγ亞基蛋白GS3和DEP1可與LGY3的MADS角蛋白樣結(jié)構(gòu)域直接互作，輔助增強(qiáng)OsMADS1的轉(zhuǎn)錄活性，并協(xié)同激活其共同的靶基因，調(diào)控籽粒形狀和大小[11-12]。編碼一個RING型蛋白，該蛋白具有E3泛素連接酶活性，在泛素蛋白酶體通路降解蛋白中發(fā)揮功能，負(fù)調(diào)控籽粒的粒寬和粒重，在其外顯子第316位處發(fā)生單堿基（A）缺失，產(chǎn)生的移碼突變使其轉(zhuǎn)錄提前終止，功能缺失型的表現(xiàn)為籽粒的穎殼變大、灌漿速率加快、粒寬和粒重增加、產(chǎn)量提高等優(yōu)勢性狀[13,14]。鈣調(diào)素結(jié)合蛋白GW5GSE5可作為BR信號通路中的一種新型正調(diào)因子，與糖原合酶激酶GSK2互作并抑制其激酶活性，通過調(diào)節(jié)BR響應(yīng)基因的表達(dá)和生長響應(yīng)進(jìn)而對粒寬和粒重進(jìn)行調(diào)控[14]；還可與OsCaM1-1互作，其編碼序列上游5 kb左右區(qū)域發(fā)生的大片段（950 bp和1212 bp）缺失可導(dǎo)致水稻穎殼細(xì)胞數(shù)目增多、籽粒變寬[15]。編碼一個包含SBP結(jié)構(gòu)域的蛋白轉(zhuǎn)錄因子，可促進(jìn)細(xì)胞分裂和籽粒灌漿，正調(diào)控粒寬和粒重，該基因的5′ UTR區(qū)域中發(fā)生了10 bp的缺失，使其功能缺失從而導(dǎo)致籽粒變細(xì)長[16]。稻米粒長基因編碼一個轉(zhuǎn)錄激活因子，參與細(xì)胞分裂調(diào)控，在其第2外顯子的3′端發(fā)生7 kb插入使其功能缺失，從而導(dǎo)致籽粒變細(xì)長，而過表達(dá)會產(chǎn)生圓形籽粒；的功能獨(dú)立于其他已鑒定的粒形基因，導(dǎo)入的育種材料，在稻米的粒形和外觀上有顯著變化，在育種上具有較高的應(yīng)用價(jià)值[17]。/編碼一個SHAGGY類激酶基因，可使生長素轉(zhuǎn)錄抑制因子磷酸化，-的結(jié)合可負(fù)調(diào)控生長素信號，使水稻籽粒的粒長和粒重下降，在該基因第3個外顯子的3′端與內(nèi)含子交接處發(fā)生的單堿基替換（G→A）導(dǎo)致該內(nèi)含子變成編碼序列，該內(nèi)含子中存在的終止密碼子（TGA）使其轉(zhuǎn)錄提前終止，產(chǎn)生功能缺失型，從而使籽粒的粒長和粒重顯著增加[18-20]；編碼一個具有IAA-葡萄糖水解酶活性的基因，功能缺失型tgw6通過控制IAA供應(yīng)，來影響細(xì)胞生長，進(jìn)而限制了細(xì)胞數(shù)目，最終調(diào)控籽粒長度和粒重，該基因編碼序列第313位處發(fā)生的單堿基（G）缺失，產(chǎn)生的移碼突變導(dǎo)致其轉(zhuǎn)錄提前終止，產(chǎn)生功能缺失型，從而導(dǎo)致籽粒的粒長和粒重顯著增加[21]。

已有多項(xiàng)研究表明，粒形基因之間存在著明顯的互作效應(yīng)。GS3主要控制水稻粒重和粒長，同時(shí)也控制水稻粒寬和籽粒充實(shí)度，該基因可與多個粒形基因之間發(fā)生互作其中可與發(fā)生直接互作，共同調(diào)控水稻的籽粒大小和形狀[11]。與在遺傳上具有上位性效應(yīng)，二者的功能缺失組合能顯著增加水稻的粒長[19]。和的互作可以得到高品質(zhì)水稻，研究人員成功選育出優(yōu)質(zhì)品種華標(biāo)1號[15]。與的-組合可以顯著增加籽粒的粒長，具有累加效應(yīng)[22]。作為調(diào)控水稻粒寬的基因，可以直接與的啟動子結(jié)合，并抑制其表達(dá)，這二者之間的互作可以獲得高產(chǎn)和高品質(zhì)的水稻[23]。

特大籽粒水稻種質(zhì)BG1為本研究室在田間發(fā)現(xiàn)的一個秈稻品系，后經(jīng)人工選育保存至今；華占是中國水稻研究所選育的優(yōu)質(zhì)恢復(fù)系。本研究以BG1和華占作為試驗(yàn)材料，以日本晴的基因組及CDS序列作為對照，對9個重要粒形基因進(jìn)行了檢測、分析與鑒定，獲得這些基因在日本晴、BG1和華占中的基因分型；在此基礎(chǔ)上，對其中的5個主效粒形基因的功能位點(diǎn)開發(fā)相應(yīng)的功能標(biāo)記，并用15個品種進(jìn)行標(biāo)記鑒定。利用BG1與華占粒形差異的遺傳背景，為今后完善粒形基因之間的互作調(diào)控網(wǎng)絡(luò)研究提供參考，同時(shí)為下一步聚合BG1和華占中的優(yōu)勢粒形基因并應(yīng)用于水稻育種提供科學(xué)依據(jù)和功能標(biāo)記。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

特大粒形秈稻品種BG1、優(yōu)質(zhì)秈稻恢復(fù)系華占、對照品種日本晴及12個用于鑒定分子標(biāo)記準(zhǔn)確性的15個種質(zhì)（9311、中恢8015、中恢8015、長粒粳、IR56、中花11、02428、南京11、玉針香、IR24、IR26、IR64）均由中國水稻研究所超級稻育種課題組提供。日本晴參考序列來自Rice Genome Annotation Project數(shù)據(jù)庫（http://rice.plantbiology. m-su.edu/index.shtml）。

1.2 粒形相關(guān)性狀考查

在水稻植株成熟后收取上述15個種質(zhì)植株主穗上的谷粒，37℃下烘干48 h。隨機(jī)挑選成熟飽滿的谷粒10顆，使用掃描儀（中晶ScanMaker i800 Plus, MRS-9600TFU2L）分析粒長和粒寬（精度均為0.01 mm）；以“谷粒長/谷粒寬”計(jì)算平均值作為谷粒長寬比。挑選2000粒飽滿谷粒，稱取質(zhì)量，除以2換算成千粒重，重復(fù)3次，取平均值作為粒重[24]。

1.3 DNA和RNA提取

1.3.1 DNA提取

在苗期取植株幼嫩葉片進(jìn)行基因組DNA的提取，提取方法為改良的CTAB方法[25]。

1.3.2 RNA提取

在抽穗期，選取BG1和華占的幼穗，使用天根生化科技有限公司的植物總RNA提取試劑盒（RNAprep pure Plant Kit）進(jìn)行RNA的提取。

1.4 RNA反轉(zhuǎn)錄cDNA

使用東洋紡（TOYOBO）公司的First Strand cDNA Synthesis Kit（Rever Tra Ace -α-）試劑盒對提取的植物材料總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄得到水稻總cDNA。

1.5 測序引物設(shè)計(jì)

利用NCBI的Primar Design在線設(shè)計(jì)功能(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/ index. cgi?LINK_LOC=BlastHome），根據(jù)已報(bào)道的粒形調(diào)控基因的功能變異位點(diǎn)，對基因組序列和cDNA序列進(jìn)行擴(kuò)增引物設(shè)計(jì)（表1），對擴(kuò)增之后的測序結(jié)果使用SnapGene 3.2.1軟件進(jìn)行序列比對分析?；蛞蚱鋯幼訁^(qū)存在大片段缺失，故通過設(shè)計(jì)插入/缺失（Insert/Delete）引物進(jìn)行目的片段的擴(kuò)增、測序與鑒定，2%的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測。

1.6 標(biāo)記引物設(shè)計(jì)與檢測

利用dCAPS Finder 2.0在線設(shè)計(jì)工具[26]（http://helix.wustl.edu/dcaps/dcaps.html）對、、、和的SNP位點(diǎn)進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，然后根據(jù)提供的正反向引物序列來設(shè)計(jì)相應(yīng)的互補(bǔ)引物（表1）。使用對應(yīng)的限制性內(nèi)切酶對dCAPS引物擴(kuò)增后的產(chǎn)物進(jìn)行酶切后，再利用8%的聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行檢測、觀察并拍照。

基于在5′UTR區(qū)域存在10 bp的缺失，故為其設(shè)計(jì)一對InDel引物進(jìn)行檢測鑒定（表1）。

表1 本研究所用的測序引物

表2 日本晴、BG1和華占的粒形性狀

2 結(jié)果與分析

2.1 日本晴、BG1和華占的粒形考查

如圖1和表2所示，與短圓粒日本晴相比，特大粒種質(zhì)BG1的籽粒形狀表現(xiàn)為寬長粒；優(yōu)質(zhì)恢復(fù)系華占的籽粒形狀表現(xiàn)為細(xì)長粒。

2.2 粒長調(diào)控基因GS3、qGL3和qLGY3的檢測

利用設(shè)計(jì)的三對引物（表1）-seq和-seq對BG1和華占的兩個粒長基因和的功能位點(diǎn)進(jìn)行擴(kuò)增，并對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測序分析?；虻臋z測結(jié)果（圖2-A）表明，BG1和華占在cDNA序列的第165位點(diǎn)（第2個外顯子）處存在1個SNP，原本編碼半胱氨酸的密碼子UGC變成了一個終止密碼子UGA，導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄過程提前終止，屬于功能缺失型，與文獻(xiàn)報(bào)道一致[2-6]；在基因中（圖2-B），與日本晴相比，BG1 cDNA序列1092位點(diǎn)發(fā)生C→A的點(diǎn)突變，致使其氨基酸序列第364位天冬氨酸突變?yōu)楣劝彼幔c已報(bào)道稀有等位突變氨基酸改變方式相同[9]，華占在該位點(diǎn)未發(fā)生突變。利用設(shè)計(jì)的引物-cds-1和-YZ分別對BG1和華占的cDNA序列和基因組序列進(jìn)行擴(kuò)增和測序，測序結(jié)果（圖2-C～D）表明，特大粒種質(zhì)BG1中的基因第8外顯子的5＇端發(fā)生了一段插入/缺失突變（插入ATGATATATACT，缺失TCCTTGGT GAAGGTA），造成的移碼突變導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄提前終止，屬于基因的外顯子可變剪切型，該剪切方式與武運(yùn)粳7-一致[11]，正調(diào)控籽粒的粒長和改善稻米品質(zhì)，而華占在該位點(diǎn)與日本晴參考序列一致，為型。

圖1 日本晴、BG1和華占的粒形比較

Fig. 1. Grain shape of Nipponbare, Huazhan and BG1.

2.3 粒寬基因GW2、GW8、GW5及GS9的檢測

利用引物-cds-1（表1）對BG1和華占的基因進(jìn)行擴(kuò)增，并對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測序分析。如圖3-A所示，與日本晴相比，特大種質(zhì)BG1的CDS序列的第316位堿基發(fā)生了一個A堿基缺失，導(dǎo)致其翻譯過程發(fā)生移碼并提前終止，這與報(bào)道的功能缺失型一致[13]，華占在此位點(diǎn)與日本晴相同，為型。通過設(shè)計(jì)的擴(kuò)增引物-indel-3（表1）對日本晴、華占和BG1的基因上游5 kp左右的區(qū)域進(jìn)行擴(kuò)增，經(jīng)2%的瓊脂糖電泳進(jìn)行觀察并測序，發(fā)現(xiàn)BG1與日本晴的擴(kuò)增產(chǎn)物片段長度相同（圖3-B），屬于1212 bp缺失型，華占為無缺失型，BG1與已有的參考文獻(xiàn)報(bào)道的在日本晴中存在1212 bp缺失一致[14]。針對基因的啟動子區(qū)變異，設(shè)計(jì)引物-indel-2（表1）對其啟動子區(qū)的10 bp功能缺失位點(diǎn)進(jìn)行擴(kuò)增并測序。與日本晴相比（圖3-C），BG1和華占在啟動子區(qū)均發(fā)現(xiàn)10 bp的插入，且插入的序列相同，與引起水稻粒形改變的啟動子區(qū)突變方式一致，均為的功能缺失型[16]。通過-seq（表1）引物對BG1和華占的基因進(jìn)行擴(kuò)增并測序，發(fā)現(xiàn)包括日本晴在內(nèi)的上述幾個種質(zhì)均不存在第2外顯子和第2內(nèi)含子之間的7 kb插入，但在第1外顯子處的3 bp插入/缺失處，BG1與日本晴一致，為堿基缺失型，其他幾處的SNP差異也與日本晴完全一致；而華占則為插入型，SNP位點(diǎn)也與報(bào)道的完全一致，但該等位變異對粒形無顯著影響[17]。

A?GS3的測序結(jié)果；B?qGL3的測序結(jié)果；C?qLGY3的測序結(jié)果；D?BG1中qLGY3的外顯子結(jié)構(gòu)。Nip-seq?日本晴的基因組序列；Nip-cds?日本晴的CDS序列；BG1-seq?BG1的基因組序列；BG1-cds?BG1的CDS序列；HZ-seq?華占的基因組序列；HZ-cds?華占的CDS序列。Nip?日本晴；BG1?大粒1；HZ?華占。

Fig. 2. Detection results of genes for grain length.

A?GW2的測序結(jié)果；B?GW5瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果；C?GW8的測序結(jié)果；D?GS9的測序結(jié)果；Nip-seq?日本晴的基因組序列；Nip-cds?日本晴的CDS序列; BG1-seq?BG1的基因組序列；BG1-cds?BG1的CDS序列；HZ-seq?華占的基因組序列；HZ-cds?華占的CDS序列；Nip?日本晴；HZ?華占；BG1?大粒1。

Fig. 3. Detection results of genes for grain width.

2.4 千粒重調(diào)控基因TGW3與TGW6的檢測

利用引物-cds-1（表1）分別對BG1和華占中的CDS序列進(jìn)行擴(kuò)增并測序，發(fā)現(xiàn)在BG1中（圖4-A～B），基因在第3外顯子的3＇端與內(nèi)含子交接處發(fā)生了一個單堿基替換（G→A），其后的內(nèi)含子區(qū)變?yōu)橥怙@子，該內(nèi)含子區(qū)域（1642?1722 bp）包含一個TGA終止子，致使翻譯過程提前終止，與文獻(xiàn)報(bào)道的功能缺失型一致[18-20]。華占的CDS中存在多個SNP位點(diǎn)，但均為無義突變，屬于型。利用引物-cds-1對BG1和華占的進(jìn)行CDS檢測，結(jié)果表明（圖4-C）BG1在第313位點(diǎn)發(fā)生一個G堿基的缺失，造成的移碼突變致使翻譯過程提前終止，與文獻(xiàn)報(bào)道一致[21]。

A?TGW3的CDS測序結(jié)果；B?TGW3的外顯子結(jié)構(gòu)圖；C?TGW6的CDS測序結(jié)果；Nip-seq?日本晴的基因組序列；Nip-cds?日本晴的CDS序列；BG1-cds?BG1的CDS序列；HZ-cds?華占的CDS序列；Nip?日本晴；BG1?大粒1。

Fig. 4. Detection results of genes for 1000-grain weight.

2.5 粒形相關(guān)基因的基因型

根據(jù)以上9個重要粒形基因的測序分析結(jié)果，對日本晴、BG1和華占進(jìn)行比對（表3）。與日本晴相比，9個主效粒形基因（、、、、、、、、）在特大粒種質(zhì)BG1中，除了和的基因型外均存在差異；優(yōu)質(zhì)恢復(fù)系華占中，僅、和的基因型存在差異。

2.6 GW2、GS3、qGL3、TGW3和TGW6的分子標(biāo)記開發(fā)

根據(jù)上述序列分析結(jié)果，分別設(shè)計(jì)[27]、、、、和的dCAPS標(biāo)記引物；針對的啟動子區(qū)存在10 bp的缺失，開發(fā)相應(yīng)的分子標(biāo)記-InDel，用PAGE凝膠電泳檢測；上游存在1212 bp的大片段缺失，故為其設(shè)計(jì)分子標(biāo)記-InDel3，并用2%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳鑒定（表4）。其中，-SNP引物擴(kuò)增后的酶切產(chǎn)物表現(xiàn)為225 bp和203 bp兩種帶型，后者為功能缺失型；-SNP引物擴(kuò)增后的酶切產(chǎn)物表現(xiàn)為212 bp、192 bp和170 bp三種帶型，具有212 bp和192 bp兩種帶型的為稀有等位變異型；-InDel引物擴(kuò)增后的酶切產(chǎn)物表現(xiàn)為133 bp和99 bp兩種帶型，后者為功能缺失型；-SNP引物擴(kuò)增后的酶切產(chǎn)物表現(xiàn)為207 bp和185 bp兩種帶型，前者為功能缺失型；-InDel引物擴(kuò)增后的酶切產(chǎn)物表現(xiàn)為221 bp和196 bp兩種帶型，同時(shí)具有兩種帶型的是含有功能缺失型等位基因座；-InDel引物擴(kuò)增后的酶切產(chǎn)物表現(xiàn)為162 bp、85 bp和77 bp，可變剪切型不會被Ⅰ內(nèi)切酶切開，只產(chǎn)生162bp帶型，而非可變剪切型的則會被酶切并產(chǎn)生85 bp和77 bp兩種帶型；-InDel引物擴(kuò)增后的產(chǎn)物會產(chǎn)生89 bp和79 bp兩種帶型，其中89 bp的為啟動子插入型，79 bp的為啟動子缺失型；-InDel3引物會產(chǎn)生938 bp和2150 bp兩種條帶，938 bp的條帶為1212 bp缺失型，2150 bp的帶型為1212 bp插入型，出現(xiàn)兩種帶型則為雜合型/。利用上述8個標(biāo)記對本研究所用的15個種質(zhì)（日本晴、9311、中恢9308、中恢8015、長粒粳、BG1、IR56、華占、中花11、02428、南京11、玉針香、IR24、IR26和IR64）進(jìn)行檢測，以鑒定功能標(biāo)記的準(zhǔn)確性（圖5）。

表3 日本晴、BG1與華占粒形相關(guān)的基因型

- —與表頭所示的基因型一致。

- , Consistent with the genotype shown in the header.

表4 主效粒形基因的功能標(biāo)記信息

下劃線堿基為dCAPs標(biāo)記的引入酶切位點(diǎn)。

The undelined base is the introduced restriction site for dCAPs marker.

表5 15個水稻種質(zhì)的粒型考查與基因分型

TGW—千粒重；GL/GW—長寬比；GL—粒長；GW—粒寬。

TGW, 1000-grain weight; GL/GW, Ratio of grain length to grain width; GL, Grain length; GW, Grain width.

1～15分別為日本晴、9311、中恢9308、中恢8015、長粒粳、BG1、IR56、華占、中花11、02428、南京11、玉針香、IR24、IR26、IR64。

Fig. 5. Typing of eight grain shape genes detected by dCAPS functional marker.

3 討論

水稻育種的內(nèi)涵是利用或創(chuàng)造優(yōu)良的等位基因和對現(xiàn)有優(yōu)良基因的優(yōu)化組合進(jìn)行遺傳改良[28]。新粒形基因的挖掘和探索可為水稻育種奠定遺傳基礎(chǔ)，對應(yīng)功能標(biāo)記的開發(fā)已成為加快育種進(jìn)度、有目的地培育優(yōu)異水稻品系的一種高效手段。裔傳燈等[29]利用水稻粒形基因的功能標(biāo)記，鑒定江蘇省近年來審定的65份粳稻品種，發(fā)現(xiàn)有兩種是單倍型，另外63個品種都為單倍型。劉李鑫哲等[30]通過設(shè)計(jì)的和功能標(biāo)記，對58份水稻新品系和品種進(jìn)行鑒定，發(fā)現(xiàn)隨著和基因片段的缺失，籽粒呈現(xiàn)出粒寬增大的趨勢，并驗(yàn)證了可通過聚合粒寬基因數(shù)目和調(diào)控粒寬基因組合方式來實(shí)現(xiàn)粒形的定向改良。陳深廣等[31]通過和基因雙功能標(biāo)記成功鑒定并獲得大量株系內(nèi)性狀基本穩(wěn)定、純合程度較高、株形好、品質(zhì)優(yōu)、保持能力強(qiáng)的高世代保持系，顯著提高育種進(jìn)度并降低育種成本。李揚(yáng)等[32]通過設(shè)計(jì)的功能標(biāo)記SF28進(jìn)行回交導(dǎo)入結(jié)合農(nóng)藝性狀選擇，從BC2F2代分離群體中直接篩選出粒長表型且農(nóng)藝性狀表現(xiàn)優(yōu)良的單株。本研究根據(jù)8個主效粒形基因（、、、、、）的測序結(jié)果，設(shè)計(jì)了相應(yīng)的功能標(biāo)記，利用15個水稻種質(zhì)進(jìn)行標(biāo)記鑒定，結(jié)合粒形考查，除了外，均可準(zhǔn)確篩選出對應(yīng)的基因型，其中由于存在大片段的缺失，使用2%的瓊脂糖檢測，發(fā)現(xiàn)條帶并不保持在統(tǒng)一水平線上，測序結(jié)果表明這些條帶的長度并無序列長短的差異，因此瓊脂糖檢測結(jié)果的差異可能是由于瓊脂糖膠的密度不均勻?qū)е碌?；同時(shí)，分子標(biāo)記的檢測結(jié)果表明在上述的15個親本中并非是以純合形式存在的，其中9311、長粒粳、IR56、玉針香、IR24、IR26和IR64屬于雜合型，這幾個種質(zhì)的長寬比均大于3.5，屬于典型的細(xì)長粒，同時(shí)這幾個種質(zhì)均含有導(dǎo)致細(xì)長粒型的，這些種質(zhì)的細(xì)長粒表型可能是和/的累加導(dǎo)致的，具體的互作機(jī)理仍有待進(jìn)一步研究。利用的dCAPs標(biāo)記對15個種質(zhì)進(jìn)行檢測后，發(fā)現(xiàn)BG1、中恢8015和南京11三個種質(zhì)表現(xiàn)出雜合帶型，但BG1的測序結(jié)果表明BG1的基因?yàn)榧兒闲?，這可能是由于本實(shí)驗(yàn)所設(shè)計(jì)的dCAPs標(biāo)記特異性有待進(jìn)一步優(yōu)化。

本研究根據(jù)對特大粒種質(zhì)BG1和恢復(fù)系華占的9個主效粒形基因進(jìn)行檢測，結(jié)合已有的相關(guān)文獻(xiàn)，對上述粒形基因在三個種質(zhì)中進(jìn)行了基因分型匯總（表 3）。與日本晴相比，特大籽粒BG1中6個基因（、、、、、、）存在差異，BG1在粒長、粒寬及千粒重均顯著大于日本晴，這些基因中、、、和均可正調(diào)控粒長，并且與、與和與的三個基因組合可以顯著增加粒長。高秀英等[22]發(fā)現(xiàn)與的組合在9311近等基因系NIL-/品種的平均粒長達(dá)到12.2 mm，與對照9311比增加了3.7 mm。劉倩等[11]發(fā)現(xiàn)與的組合在RD-23--和PA64S/9311--株系中，粒長和千粒重均比對照組RD23--和PA64S/9311--株系顯著增加，其中RD23--比RD23--的粒長增幅超過2 mm，還可以顯著改善米質(zhì)。夏朵等[20]通過構(gòu)建珍汕97與南洋占（NYZ）的重組自交系（RIL），發(fā)現(xiàn)基因分型為-的株系籽粒長度和千粒重顯著大于-型，平均粒長相差大于2 mm，并通過互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)，證明與之間存在上位互作效應(yīng)。與組合也可以顯著改善粒形，王少奎等[16]通過構(gòu)建153個以細(xì)長的Basmati385為供體親本，短圓粒HJX74為輪回親本的單段替換系（SSSLs），在HJX74近等基因系（NIL）中，-型株系的粒形與-型存在顯著性差異，前者粒長、粒寬和千粒重均顯著大于后者。Ishimaru等[21]通過構(gòu)建Kasalath與日本晴的近等基因系，發(fā)現(xiàn)來自Kasalath的對粒長和千粒重有正調(diào)控作用，對粒寬和稻米品質(zhì)無顯著影響。宋俊賢等[13]發(fā)現(xiàn)的功能缺失型可以顯著增加粒寬和千粒重，同時(shí)粒長略有增加。BG1雖然聚集了多個正調(diào)控粒長的基因（、、、、），但實(shí)際粒長為12.18 mm，表明在BG1的背景下，這些基因之間對粒長的效應(yīng)可能并不是簡單的累加，而是存在復(fù)雜的互作關(guān)系，這其中的分子機(jī)制，仍有待進(jìn)一步研究；在粒寬方面，和正調(diào)控粒寬，實(shí)際粒寬到了4.27 mm，這可能是和的累加效應(yīng)導(dǎo)致的。與日本晴相比，優(yōu)質(zhì)恢復(fù)系華占的粒形更細(xì)長，結(jié)合基因分型差異（、、），其粒形特征可能是這三個基因的互作效應(yīng)導(dǎo)致的，但其遺傳機(jī)理仍有待進(jìn)一步探索。結(jié)合粒形性狀考查，發(fā)現(xiàn)聚合了多個優(yōu)勢粒形基因的特大種質(zhì)BG1雖然粒長、粒寬及千粒重均顯著大于日本晴，但是粒長卻并未達(dá)到預(yù)期值，且結(jié)實(shí)率極低、稻米品質(zhì)較差，僅可作為個別粒形基因的供體親本，用于水稻品系的定向篩選與遺傳改良；而僅聚合了三個優(yōu)勢粒形基因（、、）的華占，其結(jié)實(shí)率和稻米品質(zhì)均較優(yōu)，更符合當(dāng)前市場需求。這可能與其遺傳背景和其他結(jié)實(shí)率或米質(zhì)等性狀的相關(guān)基因分布之間存在關(guān)系，該相關(guān)性狀尚有待進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

本研究通過對特異種質(zhì)BG1和優(yōu)質(zhì)恢復(fù)系華占的9個主效粒形調(diào)控基因進(jìn)行檢測和基因分型，并在測序的基礎(chǔ)上開發(fā)了8個基因的功能標(biāo)記，除僅能鑒定出目標(biāo)品種是否含有功能缺失型基因座外，其余7個標(biāo)記均可在15個種質(zhì)中準(zhǔn)確鑒定出對應(yīng)基因座的基因型。這8個主效粒型基因的功能標(biāo)記的開發(fā)，可為分子標(biāo)記輔助選擇育種提供高效手段。同時(shí)發(fā)現(xiàn)聚合了多個優(yōu)勢基因的BG1在粒長、粒寬和千粒重上均顯著大于日本晴和華占，但由于結(jié)實(shí)率低和較差的稻米品質(zhì)，在育種工作中僅可作為一些粒形優(yōu)勢基因的供體親本；而華占跟日本晴相比，前者雖然聚合了、和三個優(yōu)勢基因，在粒寬和千粒重不如日本晴，但具有更好的外觀品質(zhì)和稻米品質(zhì)，從而具有更大的市場。綜上所述，實(shí)現(xiàn)水稻新品種選育的優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)目標(biāo)，并非多個優(yōu)勢基因的簡單聚合，更應(yīng)該是多種性狀的綜合考查和優(yōu)勢基因的合理搭配。

[1] Li N, Xu R, Duan P G, Li Y H. Control of grain size in rice[J]., 2018, 31(3): 237-251.

[2] Mao H L, Sun S Y, Yao J L, Yu S B, Xu C G, Li X H, Zhang Q F. Linking differential domain functions of theprotein to natural variation of grain size in rice[J]., 2010, 107(45): 19579-19584.

[3] Fan C C, Xing Y Z, Mao H L, Lu T T, Han B, Xu C G, Li X H, Zhang Q F., a major QTL for grain length and weight and minor QTL for grain width and thickness in rice, encodes a putative transmembrane protein[J]., 2006, 112(6): 1164-1171.

[4] Fan C C, Yu S B, Wang C R, Xing Y Z. A causal C-A mutation in the second exon ofhighly associated with rice grain length and validated as a functional marker[J]., 2009, 118(3): 465-472.

[5] Takano-Kai N, Jiang H, Kubo T, Sweeney M, Matsumoto T, Kanamori H, Padhukasahasram B, Bustaamante C, Yoshimura A, Kazuyuki. Evolutionary history of, a gene conferring grain length in rice[J]., 2009, 182(4):1323-1334.

[6] Wang C R, Chen S, Yu S B. Functional markers developed from multiple loci infor fine marker-assisted selection of grain length in rice[J]., 2011, 122(5): 905-913.

[7] Qi P, Lin Y S, Song X J, Shen J B, Huang W, Shan J X, Zhu M Z, Jiang L W, Gao J P, Lin H X. The novel quantitative trait locuscontrols rice grain size and yield by regulating Cyclin-T1;3[J]., 2012, 22(12): 1666-1680.

[8] Gao X Y, Zhang J Q, Zhang X J, Zhou J, Jiang Z S, Huang P, Tang Z B, Bao Y M, Cheng J P, Tang H J, Zhang W H, Zhang H H, Huang J. Rice/functions with the/-like kinaseto modulate brassinosteroid signaling[J]., 2019, 31(5): 1077-1093.

[9] Zhang X J, Wang J F, Huang J, Lan H X, Wang C L, Yin C F, Wu Y Y, Tang H J, Qian Q, Li J Y, Zhang H S. Rare allele of OsPPKL1 associated with grain length causes extra-large grain and a significant yield increase in rice[J]., 2012, 109(52): 21534-21539.

[10] Hu Z J, He H H, Zhang S Y, Sun F, Xin X Y, Wang W X, Qian X, Yang J S, Luo X J. A Kelch motif-containing serine/threonine protein phosphatase determines the large grain QTL trait in rice., 2012, 54(12): 979-990.

[11] Liu Q, Han R X, Wu K, Zhang J Q, Ye Y F, Wang S S, Chen J F, Pan Y J, Li Q, Xu X P, Zhou J W , Tao D Y, Wu Y J, Fu X D. G-protein βγ subunits determine grain size through interaction with MADS-domain transcription factors in rice[J]., 2018, 9(1): 852.

[12] Wang C S, Tang S C, Zhan Q L, Hou Q Q, Zhao Y, Zhao Q, Feng Q, Zhou C C, Lyu D F, Cui L L, Li Y, Miao J S, Zhu C R, Lu Y Q, Wang Y C, Wang Z Q, Zhu J J, Shangguan Y Y, Gong J Y, Yang S H, Wang W Q, Zhang J F, Xie H A, Huang X H, Han B. Dissecting a heterotic gene through GradedPool-Seq mapping informs a rice-improvement strategy[J]., 2019, 10(1): 2982.

[13] Song X J, Huang W, Shi M, Zhu M Z, Lin H X. A QTL for rice grain width and weight encodes a previously unknown RING-type E3 ubiquitin ligase., 2007, 39(5): 623-630.

[14] Liu J F, Chen J, Zheng X M, Wu F Q, Lin Q B, Heng Y Q, Tian P, Cheng Z J, Yu X W, Zhou K N, Zhang X, Guo X P, Wang J L, Wang H Y, Wan J M.acts in the brassinosteroid signaling pathway to regulate grain width and weight in rice[J]., 2017, 10(4): 17043.

[15] Duan P G, Xu J G, Zeng D L, Zhang B L, Geng M F, Zhang G Z, Huang K, Huang L J, Xu R, Ge S, Qian Q, Li Y H. Natural variation in the promoter ofcontributes to grain size diversity in rice[J]., 2017, 10(5): 685-694.

[16] Wang S K, Wu K, Yuan Q B, Liu X Y, Liu Z B, Lin X Y, Zeng R Z, Zhu H T, Dong G J, Qian Q, Zhang G Q, Fu X D. Control of grain size, shape and quality byin rice[J]., 2012, 44(8): 950-954.

[17] Zhao D S, Li Q F, Zhang C Q, Zhang C, Yang Q Q, Pan L X, Ren X Y, Lu J, Gu M H, Liu Q Q.acts as a transcriptional activator to regulate rice grain shape and appearance quality., 2018, 9(1): 1240.

[18] Hu Z J, Lu S J, Wang M J, He H H, Sun L, Wang H R, Liu X H, Jiang L, Sun J L, Xin X Y, Kong W, Chu C C, Xue H W, Yang J S, Luo X J, Liu J X. A novel QTLencodes the GSK3/SHAGGY-like kinase OsGSK5/OsSK41 that interacts with OsARF4 to negatively regulate grain size and weight in rice[J]., 2018, 11(5): 736-749.

[19] Ying J Z, Ma M, Bai C, Huang X H, Liu J L, Fan Y Y, Song X J., a major QTL that negatively modulates grain length and weight in rice[J]., 2018, 11(5): 750-753.

[20] Xia D, Zhou H, Liu R J, Dan W H, Li P B, Wu B, Chen J X, Wang L Q, Gao G J, Zhang Q L, He Y Q., a novel QTL encoding a GSK3/SHAGGY-like kinase, epistatically interacts withto produce extra-long grains in rice[J]., 2018, 11(5): 754-756.

[21] Ishimaru K, Hirotsu N, Madoka Y, Murakami N, Hara N, Onodera H, Kashiwagi T, Ujiie K, Shimizu B I, Onishi A, Miyagawa H, Katoh E. Loss of function of the IAA-glucose hydrolase geneenhances rice grain weight and increases yield[J]., 2013, 45(6): 707-711.

[22] Gao X Y, Zhang X J, Lan H X, Huang J, Wang J F, Zhang H S. The additive effects ofandon rice grain length regulation revealed by genetic and transcriptome comparisons[J]., 2015, 15:156.

[23] Wang S K, Li S, Liu Q, Wu K, Zhang J Q, Wang S S, Wang Y, Chen X B, Zhang Y, Gao C X, Wang F, Huang H X, Fu X D. The-regulatory module determines grain shape and simultaneously improves rice yield and grain quality[J]., 2015, 47(8): 949-954.

[24] 陳杰, 朱業(yè)寶, 孫新立, 翁群清, 張國杰, 梁康逕. 一個特大粒水稻種質(zhì)粒形相關(guān)基因的檢測[J]. 分子植物育種, 2017, 15(2): 576-581.

Chen J, Zhu Y B, Sun X L, Weng Q Q, Zhang G J, Liang K J. Detection of grain shape related genes in a large grain rice germplasm[J]., 2017, 15(2): 576-581.

[25] Rogers S O, Bendich A J. Extraction of DNA from milligram amounts of fresh, herbarium and mummified plant tissues[J]., 1985, 5(2): 69-76.

[26] Neff M M, Turk E, Kalishman M. Web-based primer design for single nucleotide polymorphism analysis[J]., 2002, 18(12): 613-615.

[27] Zhang L, Ma B, Bian Z, Li X Y, Zhang C Q, Liu J Y, Li Q, Liu Q Q, He Z H. Grain size selection using novel functional markers targeting 14 genes in rice[J]., 2020, 13(1): 63.

[28] 肖國櫻, 肖友倫, 李錦江, 鄧力華, 翁綠水, 孟秋成, 于江輝. 高效是當(dāng)前水稻育種的主導(dǎo)目標(biāo)[J].中國水稻科學(xué), 2019, 33(4): 287-292.

Xiao G Y, Xiao Y L, Li J J, Deng L H, Weng L S, Meng Q C, Yu J H. High efficiency is the leading goal of rice breeding at present[J]., 2019, 33(4): 287-292. (in Chinese with English abstract)

[29] 裔傳燈, 王德榮, 蔣偉, 李瑋, 成曉俊, 王穎, 周勇, 梁國華, 顧銘洪.水稻粒形基因的功能標(biāo)記開發(fā)和單體型鑒定[J]. 作物學(xué)報(bào), 2016, 42(9): 1291-1297.

Yi C D, Wang D R, Jiang W, Li W, Cheng X J, Wang Y, Zhou Y, Liang G H, Gu M H. Development of functional markers and haplotype identification of rice grain shape gene[J]., 2016, 42(9): 1291-1297. (in Chinese with English abstract)

[30] 劉李鑫哲, 何宇涵, 炎會敏, 李俊周, 趙全志. 水稻粒寬基因和功能標(biāo)記的開發(fā)與多重PCR檢測[J]. 分子植物育種, 2019, 17(13):4280-4288.

LiuLi X Z, He Y H, Yan H M, Li J Z, Zhao Q Z. Development of functional markers of rice grain width genesandand detection of multiple PCR[J].2019, 17(13): 4280-4288.

[31] 陳深廣, 周屹峰, 趙霏, 金亮, 沈圣泉. 利用和基因雙功能性標(biāo)記高效選育優(yōu)質(zhì)水稻保持系[J]. 中國水稻科學(xué), 2011, 25(1): 31-36.

Chen S G, Zhou Y F, Zhao F, Jin L, Shen S Q. High quality rice maintainer lines were selected by using bifunctional markers ofandgenes[J]., 2011, 25(1): 31-36. (in Chinese with English abstract)

[32] 李揚(yáng), 徐小艷, 嚴(yán)明, 馮芳君, 馬孝松, 梅捍衛(wèi). 利用基因功能性分子標(biāo)記改良水稻粒型的研究[J]. 上海農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào), 2016, 32(1): 1-5.

Li Y, Xu X Y, Yan M, Feng F J, Ma X S, Mei H W. Study on the improvement of rice grain shape by functional molecular markers ofgene[J]., 2016, 32(1):1-5. (in Chinese with English abstract)

Distribution of Grain Shape Related Genes in Rice Big Grain Germplasm BG1 and Elite Restorer Line Huazhan and Development of Relevant Functional Markers

GONG Ke1, XUE Pao1, WEN Xiaoxia1, LIAO Feifei1, SUN Bin2, PENG Zequn1, CHENG Shihua1, CAO Liyong1, ZHANG Yingxin1, WU Weixun1, SUN Lianping1,*, ZHAN Xiaodeng1,*

(1China National Rice Research Institute/ State Key Laboratory of Rice Biology/ Key Laboratory for Zhejiang Super Rice Research, Hangzhou 311401, China;2Crop Breeding and Cultivation Research Institute, Shanghai 201403, China;*Corresponding author, E-mail: sunlianping@caas.cn, zhanxiaodeng@caas.cn)

【】The exploration and utilization of specific germplasm resources are one of the important means of rice breeding with high quality and high yield. Identifying the allelic variation types of some grain shape genes carried by Big Grain 1 (BG1) and Huazhan, a high quality restorer line widely used in rice breeding, and developing functional markers of corresponding genes are helpful to speed up the application of grain shape genes in rice breeding and improve the efficiency of accurate improvement of grain shape in rice.【】The target fragments of nine major grain shape genes (,,,,,,,,) in BG1 and Huazhan were sequenced and analyzed. According to the sequencing results of,,,,,,and, a functional marker for genotyping was developed.【】Compared with Nipponbare, 5 of the 9 major grain shape genes detected in BG1 showed functional deletion (,,,,), 1 rare allele variation () and 1 exon variable shear (); Compared with Nipponbare, Huazhan had differences in 3 of the 9 major grain shape genes (,and). According to the sequencing results, the functional markers of,,,,,,andwere developed and 15 rice germplasm were used for detection. In the detection results, in addition to the marker-del of, which can only be used to identify whether there is allelic variationof functional deletion type, the other 7 markers can accurately identify genotype. There was sequence variation ofamong the tested materials, which did not affect the change of grain shape. According to the above sequencing results, the functional markers of,,,,,,andwere developed and detected by 15 rice germplasms. Except for the marker-Del for, which can only be used to identify the allelic variant, a functional deletion type, the other seven markers can be genotyped accurately.【】Compared with Nipponbare, the genes,,,,andthat regulate grain length in extra-large grain germplasm BG1 may have complex interaction pathways rather than simple effect accumulation, and the grain width may be the cumulative effect ofand. The slender grain shape of high quality restorer line Huazhan may be caused by the interaction effect of,and. The functional markers developed can be used in rice molecular marker-assisted breeding.

grain shape; grain length; grain width; grain weight; functional marker

10.16819/j.1001-7216.2021.201211

2020-12-15；

2021-02-09。

國家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃資助項(xiàng)目（2018YFD0100806）；浙江省基礎(chǔ)公益研究計(jì)劃資助項(xiàng)目（LY18C130008; LY21C130003）；國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（31961143016; 31801440）；中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院科技創(chuàng)新工程資助項(xiàng)目（CAAS-ASTIP-2013-CNRRI）。