生長素調(diào)控因子OsGRF4協(xié)同調(diào)控水稻粒形和稻瘟病抗性

曹煜東 肖湘誼 葉乃忠 丁曉雯 易曉璇 劉金靈 肖應(yīng)輝

生長素調(diào)控因子OsGRF4協(xié)同調(diào)控水稻粒形和稻瘟病抗性

曹煜東 肖湘誼 葉乃忠 丁曉雯 易曉璇 劉金靈*肖應(yīng)輝*

(湖南農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院/水稻油菜抗病育種湖南省重點實驗室, 長沙 410128;*通信聯(lián)系人, E-mail: liujinling@hunau.edu.cn, xiaoyh@hunau.edu.cn)

【】水稻粒形為多基因控制的復(fù)雜數(shù)量性狀，同時影響稻谷產(chǎn)量和稻米外觀及碾磨品質(zhì)，挖掘粒形相關(guān)基因并解析其遺傳機(jī)制，對于水稻高產(chǎn)和優(yōu)質(zhì)品種選育具有重要意義。以前期利用大粒秈稻品種特大秈(TDX)為供體親本、小粒粳稻品種日本晴(Nipponbare，NPB)為輪回親本獲得的一個大粒近等基因系，在水稻第2染色體上初定位粒形調(diào)控基因()的基礎(chǔ)上，對基因進(jìn)行了精細(xì)定位和候選功能基因的克隆鑒定。利用BC4F2群體中2887份極小粒單株及該群體中70份基因型雜合的大粒單株自交獲得的BC4F3群體，將基因精細(xì)定位在2M-7-1與2M-9之間的160.6 kb的區(qū)間內(nèi)。該區(qū)間編碼18個基因開放閱讀框(-)。測序發(fā)現(xiàn)基因在大粒近等基因系與小粒日本晴等位基因間存在5個SNP差異，編碼生長素調(diào)控因子蛋白OsGRF4。采用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)對大粒近等基因系中ORF18進(jìn)行敲除，發(fā)現(xiàn)敲除株系粒長變短，證實是的功能基因。進(jìn)一步對ORF18大粒近等基因系和基因編輯敲除株系進(jìn)行稻瘟菌室內(nèi)離體和病圃接種鑒定，發(fā)現(xiàn)ORF18大粒近等基因系稻瘟病抗性增強，而基因編輯敲除株系稻瘟病抗性減弱，表明ORF18正調(diào)控水稻稻瘟病抗性。本研究發(fā)現(xiàn)的生長素調(diào)控因子OsGRF4協(xié)同調(diào)控水稻粒形和稻瘟病抗性，為協(xié)調(diào)水稻高產(chǎn)和抗性育種提供了重要的基因資源。

水稻；粒形性狀；；；稻瘟病抗性

水稻產(chǎn)量由單位面積有效穗數(shù)、每穗實粒數(shù)以及粒重三個因素決定，其中粒重受粒形和充實度等因素影響。粒形屬于多基因控制的數(shù)量性狀，同時影響稻谷產(chǎn)量和稻米品質(zhì)[1]。目前已定位了600多個粒形相關(guān)的QTL，包含粒長QTL 136個，粒寬QTL 139個，長寬比QTL 220個，粒厚QTL 53個和粒重性狀QTL 220個[2]。在水稻第2、3和5染色體上粒形QTL分布較多，形成了多個粒形基因的熱點區(qū)域。目前至少已克隆了93個水稻粒形相關(guān)基因[4]，這些基因大體可以分為3類。第1類表型是籽粒變短，植株變矮和葉傾角變小，如、和等。第2類基因主要在穗部表達(dá)，如、、等。第3類基因主要分布于粳稻，如、、等[5]，往往表現(xiàn)為小而圓的粒形和植株變矮?，F(xiàn)有研究表明，水稻粒形的調(diào)控受植物激素、泛素-蛋白酶體、MAPK信號、G蛋白信號及表觀修飾等多個信號通路調(diào)控，但是這些信號通路之間的交互關(guān)系尚不明確[2-5]。

生長調(diào)節(jié)因子家族是植物特有的轉(zhuǎn)錄因子，參與植物葉片、根系、莖和花器的生長發(fā)育進(jìn)程，也參與植物對非生物脅迫以及生物脅迫的響應(yīng)與調(diào)節(jié)[6-7]。目前共發(fā)現(xiàn)12個基因，分別被命名為。有研究發(fā)現(xiàn)在擬南芥中miR396通過調(diào)控其靶基因，從而調(diào)控擬南芥的胚性反應(yīng)[8]，此外miR396通過調(diào)節(jié)/復(fù)合體調(diào)控擬南芥心皮數(shù)量和雌蕊發(fā)育[9]。被證明通過調(diào)節(jié)赤霉素促進(jìn)水稻莖的伸長[10]。Chandran等[11]研究表明過表達(dá)、、和的轉(zhuǎn)基因植株對稻瘟病菌的抗性增強，而miR396通過抑制多個負(fù)向調(diào)控水稻稻瘟病抗性。Dai等[12]發(fā)現(xiàn)過表達(dá)增強水稻對飛虱的抗性，揭示了---黃酮途徑介導(dǎo)的褐飛虱抗性新機(jī)制。研究揭示在正向調(diào)控水稻粒形和穗長中發(fā)揮重要作用[13-14]。Li等[14]發(fā)現(xiàn)受microRNA的調(diào)控，并通過調(diào)控下游生長素因子調(diào)節(jié)水稻籽粒大小。研究發(fā)現(xiàn)能夠與水稻生長抑制因子DELLA蛋白SLR互作拮抗，協(xié)同調(diào)控水稻氮和碳的吸收，-拮抗調(diào)節(jié)GA介導(dǎo)的細(xì)胞增殖，整合生長和碳氮代謝，促進(jìn)水稻氮素的高效利用[15]。此外，還參與了苗期耐冷性調(diào)控[16]，表明是一個水稻生長發(fā)育和耐逆調(diào)控的重要調(diào)控因子。

筆者前期利用粳稻品種日本晴為輪回親本、大粒秈稻品種為供體親本連續(xù)回交并自交獲得的一個BC3F4大粒近等基因系，再與日本晴回交并自交形成的BC4F2群體為材料，采用分離群體分組混合分析法在第2染色體上定位了控制水稻粒長的基因[17]()。本研究利用BC4F2群體將基因定位到160.6 kb的區(qū)間，基因注釋與測序分析獲得的候選基因，編碼生長素調(diào)節(jié)因子，功能互補鑒定確認(rèn)了就是的功能基因。通過稻瘟病抗性鑒定，發(fā)現(xiàn)顯著增加水稻在室內(nèi)和田間的抗病性，表明協(xié)同調(diào)控水稻產(chǎn)量性狀和抗病性。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

以大粒秈稻品種特大秈為供體親本，小粒粳稻日本晴為輪回親本，經(jīng)回交和自交獲得了BC4F2群體，其中部分重組單株加代形成BC4F3群體。BC4F2和BC4F3群體用于粒形基因定位。BC3F4自交形成的BC3F5大粒近等基因系用于粒形性狀鑒定。

1.2 DNA提取與PCR擴(kuò)增

對受體、供體親本及各組合的雜交、回交后代單株，各取約0.2 g 新鮮葉片置于2.0 μL 離心管中，液氮研磨，采用CTAB法[18]提取總DNA。

10 μL PCR體系包含10×緩沖液1.0 μL，2.5 mmol/L dNTPs 0.2 μL，2 pmol/μL引物1 μL，5 U/μL酶0.1 μL，DNA模板(10 ng/μL) 1.0 μL，ddH2O 6.7 μL。采用ABI PCR系統(tǒng)2700型PCR儀進(jìn)行DNA擴(kuò)增，具體程序如下：95℃下預(yù)變性5 min，95℃下變性30 s，55℃下退火1 min，72℃下延伸30 s，35次循環(huán)；72℃下延伸7 min；16℃下保存。

1.3 基因精細(xì)定位與候選基因預(yù)測

利用連鎖標(biāo)記RM6424、RM318、RM13893和RM13896，對BC4F2群體中2887個小粒單株中的115個重組子進(jìn)行基因型鑒定，對基因進(jìn)行精細(xì)定位。利用隱性群體分析法(RCA)進(jìn)行遺傳圖譜的構(gòu)建，標(biāo)記重組率計算公式為=(1+2/2)/，其中1為各標(biāo)記帶有大粒親本純合基因型的個體數(shù)，2為帶有雙親雜合基因型的個體數(shù)，為小粒群體的總株數(shù)。各標(biāo)記與基因間的遺傳距離按每1%的重組率折合1 cM的圖距計算。最后根據(jù)各標(biāo)記間的遺傳距離繪制基因的遺傳連鎖圖譜。

利用遺傳圖譜構(gòu)建中連鎖標(biāo)記信息，在水稻日本晴參考基因組IRGSP 1.0版本數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行BLAST比對，確定各連鎖標(biāo)記在參考基因組上的物理位置，然后根據(jù)各標(biāo)記的物理位置繪制的物理圖譜。并查找各標(biāo)記所在BAC克隆，構(gòu)建位點的BAC克隆重疊群。

以日本晴參考基因組IRGSP 1.0為基礎(chǔ)，對精細(xì)定位區(qū)間的基因進(jìn)行功能注釋，預(yù)測候選基因，對大粒近等基因系和日本晴中候選基因進(jìn)行測序，選取有序列差異的基因進(jìn)行轉(zhuǎn)基因功能互補驗證。

1.4 RNA提取與反轉(zhuǎn)錄

取水稻樣本新鮮葉片各0.5 g，液氮速凍，充分磨碎后，使用Promega公司的Eastep Super總RNA提取試劑盒提取總RNA，提取方法參照公司提供的操作程序。經(jīng)脫氧核糖核酸酶I消化DNA后，取1 μg提取的RNA使用Promega公司GoScript? Reverse Transcription System試劑盒逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，?20℃保存用于基因克隆和表達(dá)分析。

1.5 載體構(gòu)建與水稻遺傳轉(zhuǎn)化

基因編輯載體采用pYLCRISPR/Cas9-MTmono植物雙元表達(dá)載體為基本載體，載體構(gòu)建參照張會軍[19]方法。首先利用CRISPR-P 2.0在線工具(http://crispr.hzau.edu.cn/CRISPR2/)設(shè)計候選基因的CRISPR/Cas9基因編輯的gRNA靶點，然后根據(jù)靶點序列設(shè)計引物（表1）。將引物稀釋后等量混合，經(jīng)變性退火形成具有黏性末端接頭的雙鏈DNA靶點序列片段，利用T4連接酶Ⅰ切割線性化pYL-U6a-gRNA中間載體；經(jīng)兩輪PCR擴(kuò)增獲得含Ⅰ黏性末端的U6a-gRNA片段，最后利用T4連接酶將U6a-gRNA片段連進(jìn)Ⅰ酶切線性化pYLCRISPR/Cas9-MTmono植物雙元表達(dá)載體，經(jīng)重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α；提取陽性克隆質(zhì)粒，經(jīng)質(zhì)粒PCR和酶切鑒定后，將陽性質(zhì)粒送測序公司測序，確認(rèn)序列正確后，用于水稻遺傳轉(zhuǎn)化，構(gòu)建轉(zhuǎn)基因水稻。水稻遺傳轉(zhuǎn)化參照王文文等[20]方法，采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的愈傷侵染轉(zhuǎn)化法。

1.6 轉(zhuǎn)基因水稻基因型鑒定

跨gRNA靶點序列前后200 bp設(shè)計引物，以轉(zhuǎn)基因水稻葉片基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物測序后與參考序列進(jìn)行比對，確定其編輯序列突變類型。過表達(dá)轉(zhuǎn)基因水稻基因型鑒定采用實時熒光定量PCR法，分析過表達(dá)轉(zhuǎn)基因株系目的基因的表達(dá)量，表達(dá)量上升的為過表達(dá)轉(zhuǎn)基因株系。

1.7 水稻籽粒形態(tài)和農(nóng)藝性狀測定

將成熟期的水稻材料全株取回室內(nèi)調(diào)查農(nóng)藝性狀。株高為地面到最長穗的長度。穗長為穗頸節(jié)至穗尖的長度。分蘗數(shù)取全株分蘗總數(shù)。每株取5穗進(jìn)行總粒數(shù)、實粒數(shù)以及結(jié)實率的調(diào)查。T1代植株每個株系取3株陽性植株進(jìn)行農(nóng)藝性狀調(diào)查。收獲成熟期水稻籽粒，經(jīng)自然晾干后，每株取30粒，用電子游標(biāo)卡尺測量粒長、粒寬、粒厚，取平均值。

結(jié)果如圖5所示，Rh2-S誘導(dǎo)K562和KG1a細(xì)胞24 h后，與對照組比較，HDAC6和HSP90蛋白表達(dá)水平顯著降低（P＜0.05），α-tubulin蛋白表達(dá)水平?jīng)]有變化，但是Ac-α-tubulin蛋白表達(dá)水平顯著升高（P＜0.05）。

1.8 稻瘟菌接種與菌絲生物量分析

稻瘟菌接種分別采用室內(nèi)離體接種和田間病圃接種。離體接種先將浸種催芽后的種子播種于含營養(yǎng)土的營養(yǎng)缽中，置于光照培養(yǎng)箱生長。生長條件設(shè)置為溫度28℃，光照強度20 000 Lx，12 h光照/12 h黑暗，相對濕度70%。當(dāng)水稻幼苗長至3～4葉期時，剪取水稻苗第3葉，平鋪于墊有濕潤濾紙的方形培養(yǎng)皿中，用手動壓環(huán)器，輕輕在葉片上壓取傷環(huán)，傷環(huán)間隔2 cm。同時，將培養(yǎng)好的稻瘟菌菌株RO1-1的孢子用0.02%的吐溫水溶液配制濃度約1×105個/mL的單個稻瘟菌分生孢子懸浮液，從中取5 μL菌液滴于水稻葉片傷環(huán)處。將培養(yǎng)皿蓋好保濕，放于26℃生長箱黑暗處理24 h，而后置于溫度26 ℃、光照和黑暗各12 h、相對濕度80%的條件下培養(yǎng)，7 d后調(diào)查病斑大小和面積。病斑面積測定參照崔華威等[21]的方法，將拍攝接種葉片照片導(dǎo)入Photoshop圖像處理軟件中，利用套索工具套取病斑大小，在直方圖中提取單個病斑所包含的像素數(shù)，在圖像欄的圖像大小中可獲取照片分辨率，計算病斑相對面積=/2，取平均值為各品種接種病斑面積測定值。

田間病圃稻瘟病抗性鑒定在湖南大圍山病圃（東經(jīng)114°5′、北緯28°30′、海拔400 m）進(jìn)行，于2019年5月15日將鑒定品種（日本晴和大粒近等基因系）和誘發(fā)品種CO39催芽后播種于病圃育苗，正常水肥管理。6月19日進(jìn)行田間發(fā)病調(diào)查，參照國際水稻研究所標(biāo)準(zhǔn)[22]調(diào)查發(fā)病情況，每個品種隨機(jī)調(diào)查10株，統(tǒng)計葉瘟發(fā)病等級。

表1 CRISPR/Cas9載體構(gòu)建和基因敲除植株鑒定所用引物

從各品種3片發(fā)病葉片中提取等質(zhì)量葉片提取DNA，以水稻(LOC4332169)作為內(nèi)參基因(UBQQ-F: CGCAAGAAGAAGTGTGGTCA；UBQQ-R: GGGAGATAACAACGGAAGCA)。利用稻瘟菌轉(zhuǎn)座子Pot2的定量引物（MoPot2-F：ACGA CCCGTCTTTACTTATTTGG；MoPot2-R：AAG TAGCGTTGGTTTTGTTGGAT）進(jìn)行實時熒光定量PCR檢測，以水稻基因作為內(nèi)參，采用相對定量法，計算各品種侵染稻瘟菌菌絲相對含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 GS2.2的精細(xì)定位與候選基因鑒定

利用連鎖標(biāo)記RM6424、RM318、RM13893和RM13896，對BC4F2群體中2887份極小粒單株進(jìn)行基因型分析，檢測到最近連鎖標(biāo)記的重組子115株。在此基礎(chǔ)上，利用已測序全基因組的水稻品種9311和日本晴之間的InDel差異，在定位區(qū)間內(nèi)設(shè)計了46對InDel標(biāo)記引物，篩選到29對在親本間表現(xiàn)出多態(tài)性的標(biāo)記。利用InDel標(biāo)記分析上述115份重組子的基因型，結(jié)果顯示標(biāo)記2M-9出現(xiàn)的重組子為2個，往染色體末端方向的標(biāo)記2M-24、2M-10、2M-11、2M-12、2M-15重組子分別為2、8、17、31、83個，往著絲粒方向的標(biāo)記2M-22、2M-21-2、2M-21、2M-20、2M-6、2M-5、2M-4、2M-3、2M-2、2M-1均未發(fā)現(xiàn)重組單株（圖1-A）。進(jìn)而又設(shè)計了2M-001～2M-015共15對引物，發(fā)現(xiàn)2M-001、2M-002、2M-005、2M-006、2M-008、2M-012、2M-015鑒定到重組子分別為1、1、2、2、2、2個。由此，將目標(biāo)基因界定在標(biāo)記2M-001～2M-9之間。

該染色體區(qū)間的物理距離約為952.7 kb，為了進(jìn)一步縮小定位區(qū)間，選擇了BC4F3群體中的70份大粒表型的植株（L1-L70）和70份小粒表型植株(S1-S70)作為定位材料，運用迭代法來推測基因所在區(qū)間。結(jié)果表明，在S1-S70小粒群體中發(fā)生交換的植株即重組子，在標(biāo)記2M-3、2M-1、2M-001、2M-006、2M-008處重組子數(shù)目分別為3、4、4、4、6。通過小粒植株S11和S9，大粒植株L12、L22、L37的基因型迭代法分析，將基因定位在2M-7-1與2M-9之間160.6 kb區(qū)間內(nèi)（圖1-B～C）。

A?GS2.2精細(xì)定位遺傳圖譜；B?GS2.2位點BAC克隆重疊群和物理圖譜；C?重組株系迭代法確定GS2.2物理區(qū)間，其中NIL為大粒近等基因系，NPB為日本晴，“L+數(shù)字”代表表型為大粒的重組株系，“S+數(shù)字”代表表型為小粒的重組株系，右側(cè)為對應(yīng)株系粒長和粒寬。

Fig. 1. Construction of genetic map and physical map of.

利用RGP在線基因預(yù)測軟件RiceGAAS (http://ricegaas.dna.affrc.go.jp/)，結(jié)合在線數(shù)據(jù)GRAMENE、TIGR、NCBI的基因注釋，對精細(xì)定位160.6 kb區(qū)間進(jìn)行基因預(yù)測得到18個ORF，其中ORF18是已經(jīng)被克隆的粒形基因，其編碼生長調(diào)控因子，正調(diào)控粒長，推斷可能是或其等位基因（表2）。

表2 GS2.2候選基因預(yù)測分析

進(jìn)一步對日本晴和大粒近等基因系中的等位基因進(jìn)行測序分析，發(fā)現(xiàn)大粒近等基因系中等位基因與日本晴中小粒等位基因在編碼區(qū)存在5個SNP的變異，分別位于第1、2和3外顯子，其中第1外顯子存在1個SNP變異，沒有導(dǎo)致氨基酸變異；第2、3外顯子各存在2個SNP變異，均導(dǎo)致了氨基酸的變異（圖2）。

2.2 基因編輯轉(zhuǎn)基因水稻基因型鑒定

圖2 NIL和日本晴等位基因的OsGRF4基因結(jié)構(gòu)和自然變異

Fig. 2.structure and natural variation in alleles from NIL and NPB.

A―OsGRF4基因編輯靶點序列；B―OsGRF4基因編輯株系敲除系靶點突變基因型。

Fig. 3. Sequence of target site for OsGRF4 CRISPR / Cas9 gene editing and genotype of OsGRF4 CRISPR / Cas9 gene editing lines in NIL background.

表3 OsGRF4 CRISPR/Cas9基因編輯敲除突變類型

2.3 轉(zhuǎn)基因水稻粒形和農(nóng)藝性狀表型分析

與轉(zhuǎn)化受體-NIL相比，CR-NIL-20、CR-NIL-23突變體(圖中分別簡寫為CR20、CR23)的T1代純合株系的籽粒長度、厚度和千粒重極顯著減?。▓D4-A～B），粒長分別減小16.57%和23.27%(圖4-C)，粒厚分別減小2.94%和7.14%（圖4-E），千粒重分別下降30.39%和32.82%（圖4-F）。CR-NIL-20的粒長、粒寬、粒厚與日本晴相比差異均不顯著（圖4-C～E）；而CR-NIL-23的粒長和粒厚均較日本晴顯著變小，分別減小5.72%和5.15%（圖4-A、C、E）。兩個編輯株系相比日本晴千粒重降低了16.94%～19.83%，均達(dá)到極顯著差異(圖4-F)。結(jié)果表明，就是的功能基因。

對其他農(nóng)藝性狀調(diào)查結(jié)果表明，與-NIL相比，基因編輯株系的株高、穗長極顯著降低（圖5-A～C），而每穗粒數(shù)極顯著增加（圖5-E），但是分蘗數(shù)無顯著差異(圖5-D)。日本晴和基因編輯株系CR-NIL-23的每穗實粒數(shù)和結(jié)實率顯著高于-NIL，但基因編輯株系CR-NIL-20則顯著降低（圖5-F、G）。結(jié)果顯示，對水稻株高、穗長和穗粒數(shù)也有重要調(diào)控作用。

2.4 稻瘟病抗性表型鑒定

田間病圃的稻瘟菌抗性鑒定結(jié)果顯示感病對照品種CO39的發(fā)病等級為8.7級，日本晴的發(fā)病等級為6.1級，而-NIL的發(fā)病等級為3.6級，表明-NIL株系在田間的抗性顯著強于日本晴（圖6-A～B）。

A和B―GS2.2-NIL背景下OsGRF4基因編輯轉(zhuǎn)基因株系粒長和粒寬；C～F―GS2.2-NIL背景下OsGRF4基因編輯轉(zhuǎn)基因株系粒長、粒寬、粒厚和千粒重統(tǒng)計。*P<0.05; **P<0.01(t測驗)。誤差線表示SD (n=30)。NIL―GS2.2-NIL; CR20?CR-NIL-20; CR23?CR-NIL-23.

Fig. 4. Grain shape of gene editing lines in-NIL background.

A―NIL背景下基因編輯株系株型；B～G, NIL背景下基因編輯株系株高、穗長、分蘗數(shù)、每穗總粒數(shù)、每穗實粒數(shù)和結(jié)實率。顯著性分析采用測驗，圖中誤差值以表示（=3）。NIL―-NIL; CR20?CR-NIL-20; CR23?CR-NIL-23.

A, Plant architecture for gene editing lines. B-G, Plant height, panicle length, tiller number, total grains per panicle, number of full grains per panicle and seed setting rate for gene editing lines. The-test was used for significance analysis. Error bar indicated thevalue (=3).**<0.01.

NIL,-NIL; CR20, CR-NIL-20; CR23, CR-NIL-23.

圖5 NIL背景下基因編輯株系農(nóng)藝性狀表型

Fig. 5. Phenotype of agronomic traits ofgene editing lines in NIL background.

A―葉片病圃發(fā)病癥狀；B―葉片病圃發(fā)病級別統(tǒng)計。顯著性分析采用t測驗，圖中誤差值以SD表示(n=10)。**P<0.01(t測驗)。

Fig. 6. Symptoms of-NIL and Nipponbare(NPB) after infected by rice blast fungal in natural disease nurse.

進(jìn)一步對-NIL和日本晴進(jìn)行稻瘟菌室內(nèi)離體接種鑒定(圖7-A)，發(fā)現(xiàn)-NIL的稻瘟菌侵染病斑面積和菌絲相對生物量均顯著低于日本晴(圖7-B～C)，表明-NIL近等基因系的稻瘟病抗性顯著增強。

進(jìn)一步對基因編輯株系進(jìn)行室內(nèi)離體接種，發(fā)現(xiàn)其病斑面積、菌絲相對生物量比-NIL均顯著增加（圖8），表明功能缺失導(dǎo)致水稻植株稻瘟菌抗性降低。綜上表明，可正向調(diào)控水稻對稻瘟菌的抗性，且具有著的增強田間抗性作用，具有重要的育種利用價值。

A―病斑癥狀；B―病斑相對菌絲量生物量；C―病斑相對面積。顯著性分析采用t測驗，圖中誤差值示SD(n=3)。**P<0.01(t測驗)。

Fig. 7. Symptoms of-NIL and Nipponbare(NPB) afterinoculation withrice blast fungus.

3 討論

挖掘水稻粒形調(diào)控基因，解析粒形的分子遺傳基礎(chǔ)，對利用分子育種技術(shù)精準(zhǔn)培育優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)的水稻品種有著重要的理論意義。目前國內(nèi)外已有近100個水稻粒形的基因被克隆[3]，極大地豐富了對水稻籽粒形態(tài)形成的遺傳基礎(chǔ)的認(rèn)知。本研究通過圖位克隆，從秈稻品種中鑒定到了一個控制水稻粒形的基因，基因克隆與驗證表明，基因編碼生長調(diào)控因子。已有研究表明，水稻生長調(diào)控因子基因家族基因?qū)λ旧L發(fā)育、產(chǎn)量形成和氮素利用起著重要調(diào)控作用。最近，幾個研究小組通過利用不同材料的研究也證明了參與水稻粒形的調(diào)控[13-14]。此外，最近報道表明，還能夠促進(jìn)NH4+的吸收從而促進(jìn)水稻植株生長，敲除株系由于NH4+吸收降低導(dǎo)致株高變矮，而氮肥可以通過影響葉綠素的合成從而間接影響植物的光合作用和產(chǎn)量[23-24]。本研究中也發(fā)現(xiàn)敲除顯性基因同時導(dǎo)致水稻粒形顯著變小，株高和穗長顯著降低（圖4、5），表明是一因多效的粒形和株型調(diào)控因子。

家族基因?qū)λ究共⌒哉{(diào)控也起著重要的作用，過表達(dá)、、和的轉(zhuǎn)基因植株對稻瘟病菌的抗性增強，miR396通過抑制多個來負(fù)向調(diào)控水稻抗稻瘟病[11]。本研究發(fā)現(xiàn)顯著增強了水稻對稻瘟菌的抗性，且在室內(nèi)接種和室外病圃鑒定均表現(xiàn)出較強的抗性，具有重要的育種利用價值。

A―病斑表型；B―病斑面積；C―病斑相對菌絲量生物量。顯著性分析采用t測驗, 圖中誤差線示SD（n=3）。*P<0.05; **P<0.01. NIL-15, CR-NIL-15.

Fig. 8. Symptoms of-NIL, Nipponbare(NPB) and CRISPR/Cas9 editing lines afterinoculationwithrice blast fungus.

高產(chǎn)和抗病性是水稻育種的兩個重要目標(biāo)，一般認(rèn)為抗性增強往往會導(dǎo)致水稻產(chǎn)量受損。但一些報道表明部分稻瘟病抗性基因?qū)Ξa(chǎn)量影響很小甚至沒有影響，[25]和[26]使稻瘟病抗性和產(chǎn)量之間達(dá)到一種平衡，而沒有顯著減產(chǎn)。而水稻株型和產(chǎn)量調(diào)控因子IPA1能通過維持生長和免疫之間的平衡來提高產(chǎn)量和抗病性[27]。本研究發(fā)現(xiàn)也能協(xié)同調(diào)控水稻產(chǎn)量構(gòu)成因子粒形與稻瘟病抗性，為水稻高產(chǎn)和抗病育種提供新基因和新思路。但是，協(xié)同調(diào)控水稻粒形和抗病性的分子機(jī)制尚不清楚，有待進(jìn)一步深入研究。

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Auxin Regulator OsGRF4 Simultaneously Regulates Rice Grain Shape and Blast Resistance

CAO Yudong, XIAO Xiangyi, YE Naizhong, DING Xiaowen, YI Xiaoxuan, LIU Jinling*, XIAO Yinghui*

(Agronomy College, Hunan Provincial Key Laboratory of Rice and Rapeseed Breeding for Disease Resistance, Hunan Agricultural University, Changsha 410128, China;*Corresponding author, E-mail: liujinling@hunau.edu.cn , xiaoyh@hunau.edu.cn)

【】Rice grain shape is a complex quantitative trait controlled by multiple genes, which affects rice yield, rice appearance and milling quality simultaneously. It is of great significance to explore the genes related to grain shape and elucidate its genetic basis. Previously, a gene, namely, which controls rice grain size, was mapped on the chromosome 2, by using a set of near isogenic lines derived from the small-grainrice variety Nipponbare (NPB) as the recurrent parent, and anrice variety Tedaxian(TDX) as the donor parent.】In this study, fine mapping ofand identification of candidate functional genes were carried out.【】was fine mapped to the 160.6 kb interval between the makers of 2M-7-1 and 2M-9, by using a BC4F2population with 2887 small grain size plants and a BC4F3population with 70 large grain size plants. Bioinformatics analysis showed that the 160.6 kb chromosome interval encodes 18 open reading frames (termed as ORF1-18, respectively). Sequence analysis showed that there were five SNP differences in ORF18 between the large grain near isogenic line and Nipponbare. ORF18 encoded an auxin regulatory factor protein OsGRF4. The grain length of ORF18 knockout lines, whose ORF18 was knocked out in large grain near isogenic lines by using CRISPR/CAS9 gene editing technology, became smaller. The above results confirmed thatwas a functional gene of. Further identification of ORF18 near isogenic lines (ORF18-NIL) and gene editing knockout lines byinoculation and disease nursery inoculation showed that the rice blast resistance of ORF18-NIL increased, while that of gene editing knockout lines decreased, indicating that ORF18 also positively regulates rice blast resistance. 【】The auxin regulatorfound in this study simultaneously regulates rice grain shape and blast resistance, which provides an important gene for breeding rice variety with high yield in coordination with enhanced resistance.

rice; grain shape;;; rice blast disease resistance

10.16819/j.1001-7216.2021.210206

2021-02-19;

2021-03-16。

國家重點研發(fā)計劃資助項目(2016YFD0101100)。