花色苷脂肪酸脂酚衍生物工藝優(yōu)化及功能性脂肪酸分析

李珊，孫萬成，羅毅皓

(青海大學(xué) 農(nóng)牧學(xué)院，西寧 810016)

牦牛是我國(guó)的青藏高原地區(qū)最主要的家畜，從其牛奶中提取的脂肪稱為牦牛酥油，性狀類似黃油。牦牛酥油富含多種功能性脂肪酸[1]，且一些功能性脂肪酸含量較普通黃油差異明顯，譬如亞油酸是普通黃油的3倍，花生四烯酸和二十碳五烯酸(EPA)是普通奶油4倍和2倍，二十二碳六稀酸(DHA)含量也較普通奶油中的含量高[2]。

黑枸杞(LyciumruthenicumMurr.)為茄科枸杞屬多棘刺灌木，在我國(guó)主要分布于青海、寧夏、甘肅等西部地區(qū)，其果實(shí)味甜多汁，富含花青素和多糖等多種類活性成分，營(yíng)養(yǎng)豐富[3]。花青素作為一種植物色素，是單糖通過糖苷鍵連接形成的花色苷[4]，由于花色苷的糖基化B環(huán)結(jié)構(gòu)，使其具有較強(qiáng)的抗氧化活性，可以很好地清除自由基[5]?；ㄇ嗨貧w屬酚類化合物中的類黃酮類，其最大的特點(diǎn)是具有數(shù)量不等的酚羥基[6]。

功能性脂肪酸可以有效降低人體血脂、血糖水平，減少心血管疾病的發(fā)病率和死亡率，具有預(yù)防癌癥、糖尿病、嬰兒發(fā)育不良和神經(jīng)及精神類疾病的作用[7]，尤其對(duì)胃癌、乳腺癌、肝癌等惡性腫瘤具有很強(qiáng)的抑制作用，能使大腦功能和視覺功能最佳化[8]。研究最廣泛的是不飽和脂肪酸n-3系列和n-6系列[9]。不飽和脂肪酸作為多種代謝物(白細(xì)胞三烯、羥基脂肪酸和前列腺素)的前體，具有重要的生物活性[10]。由于哺乳動(dòng)物缺乏合成不飽和脂肪酸的能力，必須進(jìn)行膳食干預(yù)。然而，這種脂肪酸用于預(yù)防目的的實(shí)際用途是有限的，它們大部分易氧化，發(fā)生酸敗，產(chǎn)生不良風(fēng)味[11]。近年來，人們從一些天然脂酚中發(fā)現(xiàn)了兩種物質(zhì)的結(jié)構(gòu)關(guān)系，對(duì)具有強(qiáng)抗氧化性的抗氧化劑如多酚類物質(zhì)與易氧化的化合物進(jìn)行反應(yīng)結(jié)合生成脂酚衍生物產(chǎn)生了興趣，將天然抗氧化劑與功能性脂肪酸進(jìn)行反應(yīng)制備脂酚衍生物，終止脂肪酸氧化的同時(shí)提高多酚的脂溶性，可將衍生物復(fù)配添加至脂質(zhì)基質(zhì)中，將大大拓展多酚的應(yīng)用市場(chǎng)[12]。Young等[13]將白藜蘆醇與不同鏈長(zhǎng)的脂肪酸發(fā)生酯化反應(yīng)，對(duì)其進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾后發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇衍生物的脂溶性和抗氧化性都有所增強(qiáng)，拓展了其在調(diào)味品保鮮及親油性食品中的潛在應(yīng)用。本研究選擇黑枸杞中提取的花色苷作為抗氧化劑，以牦牛酥油中提取的游離脂肪酸作為?；w發(fā)生酶法酯化反應(yīng)制備衍生物，對(duì)其反應(yīng)進(jìn)行優(yōu)化，研究反應(yīng)后功能性脂肪酸是否進(jìn)行富集，制備功能性脂肪酸含量高的脂酚衍生物，為今后的研究奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

牦牛酥油：青海省祁連縣；新鮮黑枸杞:青海省格爾木市；三氟化硼甲醇：成都艾科達(dá)化學(xué)試劑有限公司；南極洲假絲酵母脂肪酶(CALB)：杭州創(chuàng)科生物科技有限公司；AB-8大孔吸附樹脂：東鴻試劑有限公司。分析純正己烷、無水乙醇、異丙醇、氯仿、乙酸乙酯、石油醚、丙酮、甲醇：北京捷聯(lián)特科技有限公司；分析純氫氧化鉀、磷酸二氫鉀、氫氧化鈉、濃鹽酸、95%乙醇、氯化鈉、無水硫酸鈉：蘇州清泉化工貿(mào)易有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

GC-MS-TQ8050 NX氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀 日本島津公司；電熱恒溫水浴鍋 上海比朗儀器有限公司；電熱鼓風(fēng)干燥箱、MVS-1旋渦混合器、THZ-A2恒溫振蕩器 常州國(guó)華電器有限公司；LC-04C高速4 ℃離心機(jī) 江蘇正基儀器有限公司；JM-13 3003電子天平 諸暨市超澤衡器設(shè)備有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 黑枸杞花色苷提取、分離及純化

參照文獻(xiàn)[14]并稍作改動(dòng)，稱取2 g黑果枸杞干粉于錐形瓶中，加入50 mL 80%乙醇(1%鹽酸酸化)，避光恒溫超聲輔助提取，保留濾液。將濾液減壓濃縮(50 ℃)，回收乙醇。將50 mL濃縮液置于錐形瓶中，加入5 g樹脂和100 mL蒸餾水，于30 ℃，150 r/min 的恒溫?fù)u床中進(jìn)行振蕩10 h，使其充分吸附至飽和。將吸附飽和的大孔樹脂充分過濾后，加入pH 3.0的80%酸性乙醇溶液20 mL，于30 ℃，150 r/min的恒溫?fù)u床中進(jìn)行振蕩處理，使其充分解吸，將解吸液在40 ℃條件下減壓蒸餾，再冷凍干燥，得到純度為85%的黑果枸杞花色苷粉末。

1.3.2 牦牛酥油尿素絡(luò)合純化游離脂肪酸

本研究采用皂化-酸化法粗提游離脂肪酸，再經(jīng)絡(luò)合結(jié)晶法純化游離脂肪酸。

1.3.3 酶法酯化反應(yīng)

將花色苷粉末、游離脂肪酸、有機(jī)溶劑、分子篩和磁力轉(zhuǎn)子依次加入到螺旋玻璃反應(yīng)管中。將反應(yīng)管放置于設(shè)有一定溫度的磁力攪拌器中溶解花色苷粉末。溶解完全后加入催化劑脂肪酶CALB，在一定溫度下反應(yīng)若干小時(shí)后取出。反應(yīng)完成后，用濾紙濾除酶和分子篩終止反應(yīng)。用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器回收乙醇，得到酶法酯化產(chǎn)物粗品。將上述酯化產(chǎn)物粗品用乙酸乙酯-水混合液萃取3次，收集乙酸乙酯層，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器濃縮干燥后得到酶法酯化產(chǎn)物。

1.3.4 酶法酯化產(chǎn)物轉(zhuǎn)化率的計(jì)算

1.3.5 單因素試驗(yàn)

本研究酯化反應(yīng)以反應(yīng)溶液、脂肪酶添加量、反應(yīng)溫度、反應(yīng)時(shí)間和純化后的花色苷與游離脂肪酸底物摩爾比作為單因素進(jìn)行試驗(yàn)，并計(jì)算酯化反應(yīng)的轉(zhuǎn)化率確定，最優(yōu)反應(yīng)發(fā)生的條件，單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)如下：

反應(yīng)溶劑：取0.50 g花色苷粉末和1.00 g游離脂肪酸加入2.0%(W/W)CALB，在反應(yīng)溫度為50 ℃、反應(yīng)時(shí)間為12 h的條件下，考察50 mL反應(yīng)溶劑(乙酸乙酯、甲醇、乙醇、丙酮、異丙醇)對(duì)酯化反應(yīng)的影響。

脂肪酶添加量：取0.50 g花色苷粉末和1.00 g游離脂肪酸加入到裝有50 mL乙醇的螺旋玻璃反應(yīng)管中，在反應(yīng)溫度為50 ℃、反應(yīng)時(shí)間為12 h的條件下，考察脂肪酶添加量(1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%)對(duì)酯化反應(yīng)的影響。

反應(yīng)溫度：取0.50 g花色苷粉末和1.00 g游離脂肪酸混合到裝有50 mL乙醇的螺旋玻璃反應(yīng)管中，加入2.0%(W/W)CALB，在反應(yīng)時(shí)間為12 h的條件下，考察反應(yīng)溫度(40，45，50，55，60 ℃)對(duì)酯化反應(yīng)的影響。

反應(yīng)時(shí)間：取0.50 g花色苷粉末和1.00 g游離脂肪酸加入2.0%(W/W)CALB，在反應(yīng)溫度為50 ℃的條件下，考察反應(yīng)時(shí)間(4，8，12，16，20 h)對(duì)酯化反應(yīng)的影響。

花色苷與游離脂肪酸底物摩爾比：取花色苷粉末和游離脂肪酸不同底物摩爾比加入2.0%(W/W)CALB，在反應(yīng)溫度為50 ℃、反應(yīng)時(shí)間為12 h的條件下，考察花色苷與游離脂肪酸不同摩爾比(1∶1、1∶1.5、1∶2、1∶2.5、1∶3)對(duì)酯化反應(yīng)的影響。

1.3.6 響應(yīng)面法優(yōu)化酯化反應(yīng)工藝條件

根據(jù)單因素試驗(yàn)確定的因素和水平，采用響應(yīng)面設(shè)計(jì)最佳反應(yīng)條件。根據(jù)Box-Benhnken的中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，研究脂肪酶添加量(A)、反應(yīng)溫度(B)、反應(yīng)時(shí)間(C)、底物摩爾比(D)對(duì)酯化反應(yīng)轉(zhuǎn)化率的影響。

1.3.7 脂肪酸組成分析

1.3.7.1 樣品甲酯化

取適量樣品，加入5 mL正己烷溶解，加入0.5 mol/L氫氧化鉀甲醇溶液，超聲10 min，定容至10 mL，靜置2 h，取上清液，加入無水硫酸鈉除水后待GC-MS分析使用。

1.3.7.2 GC-MS分析

GC-MS條件：進(jìn)樣量1 μL，汽化溫度：280 ℃，氣體流量：50 mL/min，載氣：氦氣。

升溫程序：150 ℃(5 min)，5 ℃/min→200 ℃(6 min)，2 ℃/min→230 ℃(25 min)。

質(zhì)譜條件：DB-5MS色譜柱(60 m×0.25 mm×0.25 μm)；離子源溫度：250 ℃；接口溫度：285 ℃。

1.3.8 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2007進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，結(jié)合 SPSS 數(shù)據(jù)處理軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)分析

2.1.1 反應(yīng)溶液對(duì)酶法酯化反應(yīng)的影響

5種不同的反應(yīng)溶劑作為發(fā)生反應(yīng)的介質(zhì)，對(duì)酯化反應(yīng)轉(zhuǎn)化率的影響見圖1。

圖1 反應(yīng)溶液對(duì)酶法酯化反應(yīng)轉(zhuǎn)化率的影響 Fig.1 Effect of reaction solution on conversion rate of enzymatic esterification

由圖1可知，反應(yīng)溶劑為乙醇時(shí)，酯化反應(yīng)的轉(zhuǎn)化率最高，這可能與有機(jī)溶劑的油水分配系數(shù)(log p)值有關(guān)。Laane等[15]研究發(fā)現(xiàn)反應(yīng)酶活與有機(jī)溶劑的log p值有關(guān)，有機(jī)溶劑的log p值越低，反應(yīng)轉(zhuǎn)化率越高。本研究選用5種不同的有機(jī)溶劑，乙酸乙酯(log p=0.68)、甲醇(log p=-0.76)、乙醇(log p=-0.24)、丙酮(log p=-0.23)、異丙醇(log p=0.28)。作為反應(yīng)溶劑，酶法酯化反應(yīng)轉(zhuǎn)化率依次為乙醇>丙酮>甲醇>異丙醇>乙酸乙酯。因此，試驗(yàn)選擇乙醇為反應(yīng)溶劑。

2.1.2 脂肪酶添加量對(duì)酶法酯化反應(yīng)的影響

反應(yīng)中添加不同量的脂肪酶對(duì)酯化反應(yīng)轉(zhuǎn)化率的影響見圖2。

圖2 脂肪酶添加量對(duì)酶法酯化反應(yīng)轉(zhuǎn)化率的影響Fig.2 Effect of lipase additive amount on conversion rate of enzymatic esterification

脂肪酶作為催化劑會(huì)直接影響反應(yīng)速率及達(dá)到平衡的時(shí)間，是影響酯化反應(yīng)的一個(gè)重要因素。由圖2可知，選用的CALB對(duì)酯化反應(yīng)的催化效果明顯。添加1.0%的脂肪酶時(shí)，酯化反應(yīng)的轉(zhuǎn)化率為65.67%。當(dāng)脂肪酶添加量為2.0%時(shí)，酶法酯化反應(yīng)的轉(zhuǎn)化率最高，可達(dá)88.20%。當(dāng)脂肪酶添加量超過2.0%后，反應(yīng)轉(zhuǎn)化率呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，這可能是因?yàn)檫m量的酶作為催化劑可以加速反應(yīng)的進(jìn)行，但過量會(huì)導(dǎo)致酶與底物的接觸面積減少，從而降低酶與底物的活性位點(diǎn)的接觸，最終影響反應(yīng)的進(jìn)行[16]。因此，確定脂肪酶添加量為2.0%。

2.1.3 反應(yīng)溫度對(duì)酶法酯化反應(yīng)的影響

反應(yīng)溫度對(duì)酶法酯化反應(yīng)的影響見圖3。

圖3 反應(yīng)溫度對(duì)酶法酯化反應(yīng)轉(zhuǎn)化率的影響Fig.3 Effect of reaction temperature on conversion rate of enzymatic esterification

由圖3可知，酶法酯化反應(yīng)的轉(zhuǎn)化率隨著溫度的升高而增加，當(dāng)溫度達(dá)到50 ℃時(shí)，反應(yīng)的轉(zhuǎn)化率最高，達(dá)86.20%。對(duì)于酯化反應(yīng)而言，提高溫度可以促進(jìn)底物分子之間的碰撞，從而加快反應(yīng)速率，當(dāng)溫度達(dá)到酶的最適溫度時(shí)，酶的活性最高[17]。繼續(xù)提高溫度，轉(zhuǎn)化率有下降的趨勢(shì)。由于酯化反應(yīng)是吸熱的可逆反應(yīng)，當(dāng)溫度過高時(shí)會(huì)發(fā)生水解反應(yīng)，導(dǎo)致轉(zhuǎn)化率下降[18]。且超過酶最適溫度的高溫會(huì)使酶活性及選擇性喪失，也會(huì)導(dǎo)致轉(zhuǎn)化率降低。因此，選擇50 ℃為酶法酯化反應(yīng)的最佳溫度。

2.1.4 反應(yīng)時(shí)間對(duì)酶法酯化反應(yīng)的影響

反應(yīng)時(shí)間對(duì)酶法酯化反應(yīng)的影響見圖4。

圖4 反應(yīng)時(shí)間對(duì)酶法酯化反應(yīng)轉(zhuǎn)化率的影響Fig.4 Effect of reaction time on conversion rate of enzymatic esterification

由圖4可知，當(dāng)反應(yīng)時(shí)間由4 h增加到12 h時(shí)，發(fā)現(xiàn)酶法酯化反應(yīng)的轉(zhuǎn)化率顯著增加。當(dāng)反應(yīng)時(shí)間為12 h時(shí)，轉(zhuǎn)化率高達(dá)86.10%。當(dāng)反應(yīng)時(shí)間超過12 h后，反應(yīng)轉(zhuǎn)化率無明顯差異，表明反應(yīng)趨于平穩(wěn)，考慮試驗(yàn)條件及效率，選擇12 h為酶法酯化反應(yīng)的最佳反應(yīng)時(shí)間。

2.1.5 花色苷與游離脂肪酸底物摩爾比對(duì)酶法酯化反應(yīng)的影響[19]

花色苷與游離脂肪酸底物摩爾比對(duì)酶法酯化反應(yīng)的影響見圖5。

圖5 底物摩爾比對(duì)酶法酯化反應(yīng)轉(zhuǎn)化率的影響Fig.5 Effect of substrate molar ratio on conversion rate of enzymatic esterification

酯化反應(yīng)作為一個(gè)可逆反應(yīng)，底物的用量是影響轉(zhuǎn)化率的一個(gè)重要因素。由圖5可知，將花色苷粉末與脂肪酸質(zhì)量比從1∶1增加到1∶2時(shí)，反應(yīng)的轉(zhuǎn)化率明顯提高，最高達(dá)86.5%。當(dāng)?shù)孜镔|(zhì)量比超過1∶2時(shí)，反應(yīng)的轉(zhuǎn)化率開始降低，這是因?yàn)楫?dāng)脂肪酸含量較多時(shí)會(huì)稀釋脂肪酶的濃度，影響酶的催化作用，從而降低轉(zhuǎn)化率。

2.2 響應(yīng)面法優(yōu)化酯化反應(yīng)工藝條件

根據(jù)單因素試驗(yàn)確定的因素和水平，采用響應(yīng)面設(shè)計(jì)確定最佳工藝條件。根據(jù)Box-Benhnken的中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，研究了脂肪酶添加量(A)、反應(yīng)溫度(B)、反應(yīng)時(shí)間(C)、底物摩爾比(D)對(duì)酶法酯化反應(yīng)轉(zhuǎn)化率的影響。響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平和響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表1和表2。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平Table 1 Response surface experimental factors and levels

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 2 Response surface experimental design and results

2.2.1 轉(zhuǎn)化率的響應(yīng)面模型的建立與方差分析

各因素經(jīng)回歸擬合得到轉(zhuǎn)化率與脂肪酶添加量、反應(yīng)時(shí)間、反應(yīng)溫度和底物摩爾比的二次多項(xiàng)式回歸模型:Y=+86.80+8.67A+7.02B+0.53C+12.73D-0.88AB-0.32AC-9.95AD+3.03BC+8.80BD-1.35CD-0.65A2-10.65B2-3.43 C2-9.45D2。

該模型的方差分析見表3。

表3 轉(zhuǎn)化率方差分析Table 3 Analysis of variance of conversion rate

續(xù) 表

由表3可知，該模型的P<0.01，差異顯著。失擬項(xiàng)的P=0.5320>0.05，不顯著，說明模型可以很好地預(yù)測(cè)酶法酯化反應(yīng)的轉(zhuǎn)化率，具有實(shí)際應(yīng)用意義。脂肪酶添加量(A)、反應(yīng)溫度(B)、反應(yīng)時(shí)間(C)、底物摩爾比(D)對(duì)轉(zhuǎn)化率的影響均顯著；影響反應(yīng)轉(zhuǎn)化率的順序依次是A>B>C>D。

2.2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化最佳條件及模型的驗(yàn)證

利用Design Expert軟件進(jìn)行嶺脊分析，得到模型最佳點(diǎn)為：脂肪酶添加量1.90%、反應(yīng)溫度53.90 ℃、底物摩爾比1∶2.03、反應(yīng)時(shí)間11.36 h。在此條件下轉(zhuǎn)化率預(yù)測(cè)值為92.60%。結(jié)合實(shí)際條件，選擇脂肪酶添加量2.0%、反應(yīng)溫度50 ℃、底物摩爾比1∶2、反應(yīng)時(shí)間12 h進(jìn)行驗(yàn)證，得到反應(yīng)轉(zhuǎn)化率為91.55%。試驗(yàn)值與預(yù)測(cè)值相近，表示響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化得到的方案可靠。

2.3 游離脂肪酸與酶法酯化產(chǎn)物的脂肪酸組成分析

對(duì)游離脂肪酸和脂酚產(chǎn)物進(jìn)行甲酯化處理，用GC-MS檢測(cè)分析兩者的脂肪酸組成成分，圖譜見圖6和圖7，脂肪酸成分見表4。

圖6 反應(yīng)前脂肪酸GC-MS譜圖Fig.6 GC-MS spectra of fatty acid before reaction

圖7 反應(yīng)后脂肪酸GC-MS譜圖Fig.7 GC-MS spectra of fatty acid after reaction

表4 酯化反應(yīng)前后脂肪酸含量變化(平均值±標(biāo)準(zhǔn)差)Table 4 Changes in fatty acid content before and after esterification %

由表4可知，反應(yīng)前提取的游離脂肪含有1.12%的支鏈脂肪酸，酯化反應(yīng)得到的產(chǎn)物支鏈脂肪酸含量增加了25.62%，是反應(yīng)前的23倍。支鏈脂肪酸作為一種具有特殊結(jié)構(gòu)的脂肪酸，與直鏈脂肪酸相比氧化穩(wěn)定性更好，具有降脂、抗炎、抗癌等生理活性。飽和脂肪酸含量從 56.18%下降至27.64%。人體攝入過量的飽和脂肪酸會(huì)導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣硬化等疾病，本試驗(yàn)中飽和脂肪酸含量的降低可能是因?yàn)椴糠种舅嵩诿复僮饔孟罗D(zhuǎn)化成了不飽和脂肪酸。多不飽和脂肪酸含量增加了4.38%，尤其是DHA增加了3.24%。本研究富集的脂肪酸主要是n-6多不飽和脂肪酸，其中亞油酸7.71%，DHA 3.24%，γ-亞麻酸的代謝物PGE1 33.55%。PGE1是γ-亞麻酸的環(huán)氧合酶代謝物，在體內(nèi)可以轉(zhuǎn)變成具有擴(kuò)張血管作用的前列腺環(huán)素(PGI2)，保持與血管收縮素的平衡，防止血栓的形成。

3 結(jié)論

將花色苷粉末與游離脂肪酸在脂肪酶CALB的催化下發(fā)生酯化反應(yīng)合成脂酚產(chǎn)物，通過單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面法優(yōu)化試驗(yàn)條件獲得脂肪酸轉(zhuǎn)化率最高的工藝條件為：脂肪酶添加量為2%，反應(yīng)溫度為50 ℃，反應(yīng)時(shí)間為12 h，底物摩爾比為1∶2，該條件下酯化反應(yīng)的轉(zhuǎn)化率最高可達(dá)，91.55%。將經(jīng)過甲酯化處理的游離脂肪酸和脂酚產(chǎn)物進(jìn)行GC-MS檢測(cè)，分析比較兩者的脂肪酸組成成分。結(jié)果表明酯化產(chǎn)物脂酚衍生物功能性脂肪酸明顯富集，支鏈脂肪酸和多不飽和脂肪酸都顯著增加，飽和脂肪酸含量降低。

本研究為今后多酚與脂肪酸結(jié)合研究提供了思路與參考。將親水性的多酚提高脂溶性的同時(shí)添加脂質(zhì)基質(zhì)，使功能性脂肪酸有所富集，不僅可以拓寬花色苷等多酚物質(zhì)作為天然抗氧化物在食品中的應(yīng)用，而且可憑借富集的功能性脂肪酸應(yīng)用于功能性食品中。