納米氧化鋅對(duì)水稻種子發(fā)芽和幼苗生長的影響

殷小冬 　諸俊　顧大路　楊文飛　杜小鳳　文廷剛　孫愛俠　錢新民　施洪泉　賈艷艷

摘要：采用室內(nèi)水培法研究不同粒徑、不同質(zhì)量濃度納米氧化鋅（ZnO NPs）對(duì)水稻種子發(fā)芽和幼苗生物量的影響。結(jié)果表明，在500 mg/L質(zhì)量濃度下，Zn2+和不同粒徑ZnO NPs處理的水稻種子發(fā)芽率均在93%以上，與空白對(duì)照之間無顯著差異;水稻幼苗的生物量生長受到抑制，地上部鮮質(zhì)量減少幅度為14.29%～33.48%，根鮮質(zhì)量減少幅度為35.81%～57.29%，根鮮質(zhì)量均顯著低于空白對(duì)照，Zn2+處理的地上部鮮質(zhì)量、根鮮質(zhì)量較低。由此可見，Zn2+比ZnO NPs對(duì)水稻幼苗生長具有更強(qiáng)的毒性。在不同質(zhì)量濃度下，10 mg/L ZnO NPs處理的水稻苗長、根長分別提高了10.56%、32.26%，在100～500 mg/L ZnO NPs處理下，水稻根長、苗長分別下降了10.73%～16.83%、27.89%～4592%，且質(zhì)量濃度越高，抑制作用越強(qiáng)。ZnO NPs對(duì)水稻根部的抑制作用大于苗部，ZnO NPs的粒徑和質(zhì)量濃度對(duì)水稻種子發(fā)芽無顯著影響，低質(zhì)量濃度能促進(jìn)水稻幼苗的生長，而高質(zhì)量濃度則會(huì)產(chǎn)生抑制作用。

關(guān)鍵詞：納米氧化鋅;粒徑;水稻;種子發(fā)芽;幼苗生長

中圖分類號(hào)：S511.01文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A文章編號(hào)：1002-1302（2021）19-0101-06

金屬納米顆粒（metal nanoparticles，MNPs）是一類極其重要的納米材料，兼具金屬材料和納米材料的雙重屬性[1]。作為占居全球產(chǎn)量前5名（TOP5）的MNPs代表之一，氧化鋅納米顆粒（ZnO NPs）被廣泛應(yīng)用于橡膠、化妝品、紡織、抗菌劑和涂料等行業(yè)[2]。僅在個(gè)人護(hù)理用品方面，全球市場(chǎng)上含有ZnO NPs的皮膚護(hù)理產(chǎn)品產(chǎn)量約為1萬t/年，其中25%的此類納米顆粒將直接被釋放到環(huán)境中[3]。

近年來，納米顆粒在農(nóng)業(yè)中的應(yīng)用越來越多。研究顯示，部分MNPs具有為生物提供可利用的必需金屬元素的潛力，可作為肥料用作化肥，也可作為農(nóng)藥使用。例如，葉面噴施ZnO NPs可以顯著提高小麥籽粒中鋅元素的含量[4];在小麥幼苗期施用CuO NPs、ZnO NPs能夠刺激小麥根毛增殖和側(cè)根形成，增加根系對(duì)氮、磷等養(yǎng)分的吸收[5];在干旱脅迫條件下，ZnO NPs通過增加小麥葉綠素含量，減輕干旱對(duì)小麥的負(fù)面影響[6];CuO NPs的應(yīng)用則顯著促進(jìn)了玉米的生長和籽粒的產(chǎn)量[7]。綠豆在施用TiO2 NPs后，根系土壤磷酸酶、植酸酶活性顯著增加，綠豆的葉蛋白、葉綠素含量等物候?qū)W指標(biāo)也得以改善[8]。MNPs對(duì)作物的環(huán)境毒性效應(yīng)也有較多報(bào)道。室內(nèi)研究發(fā)現(xiàn)，ZnO NPs能夠產(chǎn)生活性氧（ROS），從而誘發(fā)氧化應(yīng)激反應(yīng)，使得蕎麥幼苗的根系表皮細(xì)胞受損，生物量顯著下降[9]。Yang等研究發(fā)現(xiàn)，ZnO NPs、CuO NPs的植物毒性作用為濃度依賴性，在2 000 mg/L質(zhì)量濃度下顯著抑制了玉米、水稻根系的伸長[10]。2 000 mg/L CeO2 NPs處理能夠降低小麥葉綠素含量，將開花延遲1周，并減小胚乳中淀粉粒的大小和胚泡數(shù)量[11]。由此可見，MNPs對(duì)作物的影響并不統(tǒng)一。MNP的生物效應(yīng)需要結(jié)合納米顆粒的種類、濃度、粒徑與植物種類、栽培條件，以明確不同納米顆粒在不同環(huán)境下對(duì)植物種子萌發(fā)和植株生長產(chǎn)生的影響。

本試驗(yàn)選用ZnO NPs這一典型MNP材料作為研究對(duì)象，以水稻作為試驗(yàn)植物，通過室內(nèi)培養(yǎng)皿培養(yǎng)和水培方法研究不同質(zhì)量濃度、不同粒徑ZnO NPs對(duì)水稻種子發(fā)芽和幼苗生長的影響，以探究ZnO NPs對(duì)農(nóng)田作物的毒性效應(yīng)，研究結(jié)果將為MNPs的合理農(nóng)用及其環(huán)境健康風(fēng)險(xiǎn)的科學(xué)評(píng)估提供科學(xué)依據(jù)。

1材料與方法

1.1供試材料

試驗(yàn)所用ZnO NPs購自阿拉丁試劑（上海）有限公司（含量≥99.5%），pH值為6～8;ZnSO4純度≥99.8%，購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。所用水稻品種為南粳9108，由江蘇天豐種業(yè)有限公司提供。

1.2試驗(yàn)設(shè)計(jì)與方法

室內(nèi)試驗(yàn)于2020年11月2日在江蘇徐淮地區(qū)淮陰農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所中心實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。試驗(yàn)共設(shè)置粒徑、濃度2個(gè)因素。在粒徑試驗(yàn)中，ZnO NPs共設(shè)置30、90、200 nm 3種粒徑水平，以不添加納米顆粒作為空白對(duì)照，以ZnSO4溶液作為鋅離子對(duì)照，所有處理的質(zhì)量濃度均為500 mg/L，共設(shè)5個(gè)處理，分別為無納米顆粒對(duì)照處理（CK）、30 nm粒徑ZnO NPs處理（30-500）、90 nm粒徑ZnO NPs處理（90-500）、200 nm粒徑ZnO NPs處理（200-500）及鋅離子對(duì)照處理（Zn2+）。在濃度試驗(yàn)中，選取粒徑為30 nm的ZnO NPs，設(shè)置10、100、500 mg/L 3個(gè)濃度水平（分別標(biāo)記為30-10、30-100、30-500），以不添加納米顆粒作為空白對(duì)照，共設(shè)4個(gè)處理，分別為無納米顆粒對(duì)照處理（0）、10 mg/L ZnO NPs處理（30-10）、100 mg/L ZnO NPs處理（30-100）以及500 mg/L ZnO NPs處理（30-500）。所有處理均設(shè)置3次重復(fù)。

試驗(yàn)挑選顆粒飽滿、品相良好的水稻種子，用30%過氧化氫溶液消毒8 min后用超純水浸泡并沖洗5次。選取100粒種子，均勻分布在直徑為 100 mm、高15 mm、墊有濾紙的培養(yǎng)皿中。在培養(yǎng)皿中分別添加上述各處理分散液。納米顆粒溶液使用前經(jīng)超聲波振蕩30 min以保證顆粒充分分散開。在每個(gè)培養(yǎng)皿中加入4 mL處理液，每種處理方法重復(fù)3次，將各個(gè)培養(yǎng)皿放入光照恒溫培養(yǎng)箱中于25 ℃進(jìn)行培養(yǎng)。試驗(yàn)開始后每24 h觀察1次并記錄種子萌發(fā)數(shù)，以胚根突破種皮 2 mm作為種子發(fā)芽的標(biāo)志，連續(xù)7 d沒有新的種子發(fā)芽視為試驗(yàn)結(jié)束。按照國家標(biāo)準(zhǔn)計(jì)算種子的發(fā)芽率和發(fā)芽指數(shù)。

種子萌發(fā)7 d后，從各處理培養(yǎng)皿中挑選健壯、長勢(shì)一致的幼苗移栽至相應(yīng)水培箱中，在溫室中繼續(xù)培養(yǎng)14 d，培養(yǎng)期間每3 d更換1次營養(yǎng)液。取樣，測(cè)定水稻幼苗根長、苗長、鮮質(zhì)量，計(jì)算根冠鮮質(zhì)量比、苗長和根長抑制率。

1.3測(cè)定項(xiàng)目與方法

水稻種子發(fā)芽率、發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽指數(shù)及活力指數(shù)的計(jì)算公式如下：

發(fā)芽率（GR）=發(fā)芽種子數(shù)/供試種子數(shù) ×100%;

發(fā)芽勢(shì)（GV）=達(dá)到發(fā)芽高峰期的種子數(shù)/供試種子數(shù)×100%;

發(fā)芽指數(shù)（GI）=∑（Gt/Dt）。式中：Gt為時(shí)間t內(nèi)的發(fā)芽種子數(shù)（個(gè)）;Dt為相應(yīng)的發(fā)芽時(shí)間（d）。

活力指數(shù)（VI）=S×GI。式中：S為幼苗根長（cm），GI為發(fā)芽指數(shù)。

抑制率（IR）=（A-B）/A×100%。式中：A為空白對(duì)照的苗長或根長;B為其他處理的苗長或根長。

水稻幼苗的根長、苗長使用卷尺測(cè)定，地上生物量及地下生物量用稱質(zhì)量法測(cè)定。所用溶液和化學(xué)試劑均為國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司生產(chǎn)的分析純產(chǎn)品。

1.4數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，在0.05水平下Tukeys HSD檢驗(yàn)各處理平均值之間的差異顯著性。

2結(jié)果與分析

2.1不同粒徑ZnO NPs處理對(duì)水稻種子萌發(fā)的影響

2.1.1不同粒徑ZnO NPs處理對(duì)水稻種子發(fā)芽的影響發(fā)芽勢(shì)可以反映種子的發(fā)芽速率和整齊度，發(fā)芽指數(shù)也是反映種子發(fā)芽速度的重要指標(biāo)[12]。從表1可以看出，與對(duì)照相比，ZnO NPs處理的發(fā)芽勢(shì)、活力指數(shù)均低于對(duì)照，對(duì)水稻種子的發(fā)芽速度具有一定的抑制作用，當(dāng)粒徑達(dá)到90 nm時(shí)，抑制作用明顯。Zn2+處理可以提高種子發(fā)芽勢(shì)，并且其發(fā)芽勢(shì)高于對(duì)照處理，顯著高于ZnO NPs處理。所有處理的種子發(fā)芽率間無顯著差異，均在93%以上，其中200-500處理的發(fā)芽率最高，為96.00%?；盍χ笖?shù)是種子發(fā)芽速率和生長量的綜合反映。ZnO NPs、Zn2+處理的活力指數(shù)均顯著低于CK，可見種子胚根長度發(fā)育受到了明顯抑制。

2.1.2不同粒徑ZnO NPs處理對(duì)水稻幼苗生物量的影響生物量能夠直觀表現(xiàn)出ZnO NPs對(duì)水稻的影響， 由表2可知， ZnO NPs、 Zn2+處理對(duì)水稻地上部鮮質(zhì)量、根鮮質(zhì)量的影響均呈現(xiàn)不同程度的抑制作用。ZnO NPs、Zn2+處理的地上部鮮質(zhì)量、根鮮質(zhì)量均低于對(duì)照，地上部鮮質(zhì)量的減少幅度為1429%～33.48%，但與對(duì)照相比無顯著差異;根鮮質(zhì)量的減少幅度為35.81%～57.29%，根鮮質(zhì)量均顯著低于對(duì)照，Zn2+處理的地上部鮮質(zhì)量、根鮮質(zhì)量較低。ZnO NPs、Zn2+處理的根冠鮮質(zhì)量比明顯低于CK，說明兩者顯著影響了根系的發(fā)育。總體來看，ZnO NPs、Zn2+處理均抑制了水稻幼苗生長，且對(duì)地下部的影響高于地上部，而Zn2+處理的毒性更強(qiáng)。

2.1.3不同粒徑ZnO NPs處理對(duì)水稻苗長、根長的影響由圖1可以看出，不同粒徑的ZnO NPs、Zn2+均對(duì)水稻幼苗的苗長、根長產(chǎn)生了一定的抑制作用，從而對(duì)水稻幼苗產(chǎn)生毒性，影響顯著。隨著ZnO NPs粒徑的增大，苗長逐漸減小，不同處理之間無顯著差異。Zn2+處理的苗長、根長較低，比ZnO NPs處理的毒性作用更強(qiáng)。ZnO NPs、ZnSO4處理對(duì)水稻苗長、根長表現(xiàn)出明顯的抑制作用，對(duì)苗長的抑制率為16.83%～20.96%，對(duì)根長的抑制率為4175%～53.32%，而對(duì)根長的脅迫作用遠(yuǎn)大于對(duì)苗長的脅迫作用，這與對(duì)生物量的影響表現(xiàn)出相同的趨勢(shì)。

2.2不同質(zhì)量濃度ZnO NPs處理對(duì)水稻種子萌發(fā)的影響

2.2.1不同質(zhì)量濃度ZnO NPs處理對(duì)水稻種子發(fā)芽的影響由表3可以看出， 隨著ZnO NPs質(zhì)量濃度的增大，水稻種子的發(fā)芽勢(shì)呈現(xiàn)下降的趨勢(shì)，不同處理間的差異沒有達(dá)到顯著水平，說明ZnO NPs質(zhì)量濃度的提高在一定程度上阻礙了水稻發(fā)芽的進(jìn)度;種子的發(fā)芽指數(shù)也出現(xiàn)了不同程度的降低，但是ZnO NPs質(zhì)量濃度的提高沒有抑制發(fā)芽率。不同質(zhì)量濃度ZnO NPs處理的種子活力指數(shù)具有顯著差異，且質(zhì)量濃度越高，抑制作用越強(qiáng)。綜上可知，高質(zhì)量濃度ZnO NPs對(duì)種子胚根具有明顯影響。

2.2.2不同質(zhì)量濃度ZnO NPs處理對(duì)水稻幼苗生物量的影響由表4可以看出，與對(duì)照相比，在低質(zhì)量濃度下，ZnO NPs對(duì)水稻幼苗的地上部分物質(zhì)積累量有一定的促進(jìn)作用，當(dāng)ZnO NPs的質(zhì)量濃度超過100 mg/L時(shí)，水稻的地上部分生長受到一定抑制，但彼此之間無顯著差異。不同處理的根鮮質(zhì)量具有顯著差異，且ZnO NPs質(zhì)量濃度越高，抑制作用越明顯。與對(duì)照相比，地上部分鮮質(zhì)量除30-10處理增加了5.12%外，其他處理均有所減少，減少幅度為18.55%～33.48%，地下部分鮮質(zhì)量的減少幅度為33.36%～57.03%，可見地下部分鮮質(zhì)量的減少幅度明顯大于地上部分。

2.2.3不同質(zhì)量濃度ZnO NPs處理對(duì)水稻苗長、根長的影響由圖2可以看出，在不同質(zhì)量濃度下，ZnO NPs對(duì)水稻苗長、根長產(chǎn)生了不同作用。在低質(zhì)量濃度條件下，ZnO NPs可以促進(jìn)水稻根長、苗長的生長，與對(duì)照相比具有顯著差異。在高質(zhì)量濃度條件下，水稻的根長、苗長則受到顯著抑制，且質(zhì)量濃度越高，抑制作用越明顯。在不同質(zhì)量濃度條件下，水稻苗長抑制率為-10.56%～16.83%，根長抑制率為-32.26%～45.92%。由此可見，ZnO NPs對(duì)水稻根長的影響遠(yuǎn)大于苗長。

2.3不同粒徑和質(zhì)量濃度ZnO NPs處理的方差分析結(jié)果

從表5可以看出，在不同粒徑下，不同處理ZnO NPs除了對(duì)水稻種子的活力指數(shù)具有極顯著影響外，對(duì)發(fā)芽指標(biāo)、幼苗生長指標(biāo)均無顯著影響。在不同質(zhì)量濃度下，ZnONPs對(duì)種子發(fā)芽指數(shù)有顯著影響，對(duì)水稻幼苗苗長、根長有極顯著影響，對(duì)發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽率、活力指數(shù)、地上部鮮質(zhì)量、根鮮質(zhì)量、根冠鮮質(zhì)量比和總鮮質(zhì)量均無顯著影響。

3討論

在不同粒徑ZnO NPs的水培試驗(yàn)中，200 nm粒徑ZnO NPs處理的水稻種子發(fā)芽率最高，發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽指數(shù)也略高于90 nm粒徑ZnO NPs處理;在根長和根鮮質(zhì)量方面，表現(xiàn)為隨著粒徑增大，水稻種子根生長出現(xiàn)抑制趨勢(shì)。出現(xiàn)上述現(xiàn)象的原因可能是由于納米顆粒粒徑越小，越有可能通過孔隙進(jìn)入細(xì)胞，細(xì)胞壁小管、木質(zhì)部導(dǎo)管越容易堵塞，造成水分和礦物質(zhì)營養(yǎng)輸送困難，影響幼苗生長發(fā)育[13]。文雙喜等在水培試驗(yàn)下研究不同粒徑納米TiO2對(duì)蘆葦種子發(fā)芽的影響，發(fā)現(xiàn)在高濃度條件下，粒徑越小，種子的發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)、活力指數(shù)和幼苗質(zhì)量生長抑制作用越強(qiáng)，在對(duì)金魚藻種子的研究中也表現(xiàn)出相同的結(jié)果[14-15]。有研究發(fā)現(xiàn)，Ag NPs降低了黑麥草的長度、根系生物量，而6 nm粒徑的降幅高于25 nm粒徑。這是由于粒徑越小，納米顆粒的表面積越大，越容易被植物吸收，毒性就越強(qiáng)[16]。目前，關(guān)于MNPs的致毒機(jī)制仍然存在爭(zhēng)議。Chen等認(rèn)為，納米金屬對(duì)植物的毒性主要來源于溶出的金屬離子[17];Lee等通過試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，Ag NPs對(duì)植物的毒性來源于溶解的Ag+[18];García-Gómez等研究發(fā)現(xiàn)，ZnO NPs的毒性來源于Zn2+，但不能排除Zn2+、ZnO NPs的共同致毒效應(yīng)[19];Yin等則否認(rèn)了金屬離子的主效應(yīng)，通過研究發(fā)現(xiàn)Ag NPs對(duì)植物的毒性高于金屬離子[16]。還有研究表明，在相同濃度下，Zn2+對(duì)水稻種子生長的抑制作用要高于ZnO NPs[20]，與之前的研究表現(xiàn)出類似的結(jié)果，這可能由于ZnSO4的Zn2+濃度過高，超過了ZnO NPs對(duì)植物的毒性，而據(jù)報(bào)道，濃度為20～2 000 mg/L 的ZnO NPs懸液中的Zn2+濃度為 0.3～3.6 mg/L，不會(huì)對(duì)植物造成影響[21]。低濃度（10 mg/L）ZnO NPs處理促進(jìn)了水稻苗長、根長的生長，有利于生物量的累積，而在高濃度（100、500 mg/L）條件下，ZnO NPs處理則顯著抑制了水稻幼苗的生長。MNPs的低促高抑效應(yīng)已經(jīng)得到部分研究的支持。曹沖等在水培試驗(yàn)條件下研究了ZnO NPs對(duì)濕地種子萌發(fā)的影響，結(jié)果表明，在低濃度（0.1、1.0 mg/L）條件下，ZnO NPs能顯著促進(jìn)花葉蘆竹種子的根莖長度增加，而100 mg/L ZnO NPs對(duì)植物根莖生長則有明顯的抑制作用[22]。金盛楊等采用模擬土壤的瓊脂培養(yǎng)方法研究了CuO NPs對(duì)小麥根系發(fā)育的影響，結(jié)果表明，10 mg/L CuO NPs可以促進(jìn)根的伸長、根內(nèi)超氧化物歧化酶（SOD）活性的增加，而當(dāng)CuO NPs濃度為100 mg/L時(shí)則受到顯著抑制[23]。Itroutwar等研究發(fā)現(xiàn)，10 mg/L 海藻基生物ZnO NPs從種子發(fā)芽率、根長、幼苗長度等多個(gè)方面改善了水稻的農(nóng)業(yè)形態(tài)特征[24]。在本研究中，不同粒徑、不同濃度的ZnO NPs對(duì)水稻幼苗生長具有顯著影響，而對(duì)種子發(fā)芽情況沒有顯著差異，并且對(duì)水稻根長的影響大于對(duì)苗長的影響，可能是因?yàn)榉N子在萌發(fā)階段受到種皮的保護(hù)，可在一定程度上減輕MNPs的脅迫作用，因此水稻種子的發(fā)芽率沒有受到顯著影響。有研究發(fā)現(xiàn)，ZnO NPs在水培條件下對(duì)小麥發(fā)育階段的影響表現(xiàn)為吸脹階段<萌動(dòng)階段<發(fā)芽階段[25]。種子根部先破皮而出，相對(duì)于地上部暴露時(shí)間更長，接觸面積更大，根部對(duì)污染更敏感，受到MNPs的脅迫更深[26-27]，因此ZnO NPs對(duì)幼苗根部的抑制作用更強(qiáng)。

4結(jié)論

ZnO NPs延遲了水稻種子的發(fā)芽速度，但對(duì)種子的發(fā)芽率沒有顯著影響;ZnO NPs、Zn2+會(huì)對(duì)水稻幼苗生長產(chǎn)生抑制作用，且對(duì)地下部分的脅迫作用大于地上部分。不同粒徑的ZnO NPs對(duì)水稻生長無顯著影響。在同一質(zhì)量濃度下，相比于ZnO NPs，Zn2+對(duì)水稻幼苗根系生長和生物量積累的抑制作用更強(qiáng)，表現(xiàn)出更強(qiáng)的毒性。

不同質(zhì)量濃度ZnO NPs處理的水稻種子發(fā)芽試驗(yàn)結(jié)果表明，不同質(zhì)量濃度的ZnO NPs均延緩了水稻種子的發(fā)芽速度，降低了發(fā)芽指數(shù)，在低質(zhì)量濃度下水稻種子的發(fā)芽率受到一定抑制。ZnO NPs在低質(zhì)量濃度（10 mg/L）下可促進(jìn)水稻根長、苗長的生長，促進(jìn)地上部分物質(zhì)量的積累，而高濃度ZnO NPs則抑制了水稻幼苗的生長。ZnO NPs對(duì)地下部分的影響遠(yuǎn)大于地上部分。但是，隨著MNPs應(yīng)用與產(chǎn)量的日益增多，在納米科技合理農(nóng)用的同時(shí)，納米顆粒的環(huán)境暴露與生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)問題也不容忽視。

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基金項(xiàng)目：江蘇省自然科學(xué)基金（編號(hào)：BK20200264）;淮安市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院院長科研發(fā)展基金（編號(hào)：HNY201601、HNY201709、HNY202028）;淮安市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院高層次引進(jìn)人才科研啟動(dòng)發(fā)展基金（編號(hào)：002201901413）。

作者簡(jiǎn)介：殷小冬（1996—），男，安徽合肥人，碩士，研究實(shí)習(xí)員，主要從事土壤養(yǎng)分循環(huán)研究。E-mail：1553015412@qq.com。

通信作者：賈艷艷，博士，助理研究員，主要從事作物與土壤養(yǎng)分循環(huán)研究。E-mail：yyjia667@163.com。