基于特有基因VY93_RS02885為靶標的滑液支原體qPCR檢測方法建立

徐彬　張敬峰　盧鳳英　孫華偉　趙莎　張曉曦　劉青濤　張小飛

摘要：利用CD-HIT-EST快速聚類分析和BLASTN同源性比對共鑒定出17個滑液支原體（Mycoplasma synoviae）特有基因，并從中選取保守基因VY93_RS02885作為分子診斷的靶標基因。根據(jù)該基因核苷酸序列設計了1對引物，建立了滑液支原體的SYBR green qPCR檢測方法。結(jié)果表明，該方法對不同濃度的模板和對應的CT值具有較好的線性關系，R2值為0.998 8;該方法的特異性較好，BLASTN比對，檢測引物對僅能匹配滑液支原體的特有基因VY93_RS02885，結(jié)果顯示，該方法能特異性地檢測滑液支原體，與其他常見的引起禽關節(jié)炎的細菌/支原體性病原無交叉反應;該方法的敏感性較好，100%陽性檢測的靶標基因最小拷貝數(shù)為10;該方法的重復性較好，對3個不同濃度的模板進行組間和組內(nèi)重復檢測，變異系數(shù)≤1.172 7%。此外，該方法對臨床樣品的檢出率與傳統(tǒng)檢測方法相符。因此，本研究建立的針對滑液支原體特有基因的SYBR green qPCR檢測方法具有用時短、特異性高、準確性高、敏感性高、可重復性強的優(yōu)點，可為滑液支原體的快速診斷和流行病學調(diào)查提供技術手段。

關鍵詞：滑液支原體;特有基因;qPCR;檢測方法

中圖分類號：S852.62 文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2021）19-0183-07

滑液支原體（Mycoplasma synoviae）是一種重要的禽病病原，是OIE必通報疫病病原。該病原所致疾病的致死率不高，但能導致雞關節(jié)炎、氣囊炎、生長遲緩、產(chǎn)蛋量下降、產(chǎn)畸形蛋并增加雞對其他病原的易感性和疾病程度等，疾病發(fā)展緩慢，病程長。該病原在雞群中感染后很難根除，對家禽養(yǎng)殖業(yè)造成嚴重的經(jīng)濟損失^[1-3]。

對滑液支原體的快速診斷對該病原所致疾病的防控非常重要^[4]，熒光定量PCR（qPCR）相對于常規(guī)PCR具有反應時間短、更高的敏感性、結(jié)果不用跑膠直接獲得等優(yōu)點?，F(xiàn)階段應用最廣泛的qPCR方法分別是熒光探針法qPCR（如TaqMan qPCR）和核酸染料法qPCR（如SYBR green qPCR）。對于單基因檢測，SYBR green qPCR相對于TaqMan qPCR等熒光探針法省去了探針的合成，經(jīng)濟上更實惠。許多報道也表明SYBR green qPCR具有不輸于TaqMan qPCR的準確性和敏感性^[5-6]。因此，本研究著眼于建立滑液支原體SYBR green qPCR的診斷方法。

到目前為止，針對滑液支原體的SYBR green qPCR檢測方法僅有Jarquin等建立的以16S rRNA的基因序列為靶標的方法。多項研究表明，僅針對單一基因位點進行病原檢測，可能出現(xiàn)由于靶標病原基因引物區(qū)的突變、其他物種同源性較高基因的非特異性擴增等諸多情況導致結(jié)果不可靠^[7]。如16S rRNA屬于所有物種的共有基因，在不同物種特別是近源物種之間具有不低甚至較高的同源性。Mekkes等建立的針對雞毒支原體（Mycoplasma gallisepticum）16S rRNA的檢測方法能非特異地檢測出模仿支原體（Mycoplasma imitans）^[8]。因此，建立針對其他靶點特別是特異性更高靶點的SYBR green qPCR具有研究價值。本研究選擇以滑液支原體的特有基因作為診斷靶標建立SYBR green qPCR快速診斷方法，為滑液支原體的臨床診斷和流行病學調(diào)查提供有效手段。

1材料與方法

1.1菌種和病料

試驗用滑液支原體標準株ATCC 25204、20株滑液支原體臨床分離株、3株雞毒支原體、6株金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、4株禽致病性大腸桿菌（Avian pathogenic Escherichia coli）、2株雞白痢沙門氏菌（Salmonella pullorum）、3株雞傷寒沙門氏菌（Salmonella gullinarum）、3株鼠傷寒沙門氏菌（Salmonella typhimurium）、48份滑液支原體陽性雞跗關節(jié)組織、10份SPF健康雞跗關節(jié)組織均由江蘇省農(nóng)業(yè)科學院獸醫(yī)研究所保存。試驗時間自2019年底至2021年初，試驗地點在江蘇省農(nóng)業(yè)科學院獸醫(yī)研究所。

1.2主要儀器和試劑

北京格瑞德曼公司GT200組織細胞樣品均質(zhì)儀;美國ABI公司StepOnePlus熒光定量PCR儀;德國Eppendorf公司Mastercycler nexus gradient 多用途PCR儀和BioPhotometer D30核酸蛋白測定儀。2×Taq Plus Master Mix Ⅱ（Dye Plus），AceQ^?qPCR SYBR Green Master Mix （High ROX Premixed）購自Vazyme公司;pMD18-T Vector Cloning Kit，MiniBEST Bacteria Genomic DNA Extraction Kit Ver.3.0購自TaKaRa公司;Mycoplasma gDNA Miniprep Kit購自BIOMIGA公司;Gel Extraction kit和Plasmid Mini Kit Ⅰ購自OMEGA公司。

1.3生物信息學分析篩選和鑒定滑液支原體核苷酸水平特有基因

從NCBI GenBank中收集包括6株滑液支原體在內(nèi)的46株來自25種/亞種動物致病性支原體的全基因組所有基因的核苷酸序列集。46株支原體分別是：鴨支原體（Mycoplasma anatis）NCTC10156株;關節(jié)炎支原體（Mycoplasma arthritidis）158L3-1株和NCTC10162株;牛生殖支原體（Mycoplasma bovigenitalium）HAZ596株和NCTC10122株;牛鼻支原體（Mycoplasma bovirhinis） GS01株和HAZ141_2株;牛支原體（Mycoplasma bovis） NADC58株和Ningxia-1株;加州支原體（Mycoplasma californicum） HAZ106_1株和ST-6株;犬支原體（Mycoplasma canis）LV株和PG 14株;山羊支原體山羊亞種（Mycoplasma capricolum subsp. capricolum）ATCC 27343株;山羊支原體山羊肺炎亞種（Mycoplasma capricolum subsp. capripneumoniae）04012株和87001株;鴿口支原體（Mycoplasma columborale）NCTC10179株;犬支原體（Mycoplasma cynos）C142株;貓支原體（Mycoplasma felis）Myco-2株;禽支原體（Mycoplasma gallinaceum）NCTC10183株和Peacock20181011株;生殖支原體（Mycoplasma genitalium）G37株和M6282株;嗜肝糖支原體（Mycoplasma glycophilum）NCTC10194株;豬肺炎支原體（Mycoplasma hyopneumoniae）168株和7448株;豬鼻支原體（Mycoplasma hyorhinis）DBS 1050株和HUB-1;豬滑液支原體（Mycoplasma hyosynoviae）M60株;衣阿華支原體（Mycoplasma iowae）695株和NCTC10185株;火雞支原體（Mycoplasma meleagridis）NCTC10153株;絲狀支原體絲狀亞種（Mycoplasma mycoides subsp. mycoides）Ben1株和T1/44株;肺炎支原體（Mycoplasma pneumoniae）M29株和M2192株;雛支原體（Mycoplasma pullorum）B359_6株;雞毒支原體mx-4株、NCTC10115株、str. Rlow株;滑液支原體53株、86079/7NS株、ATCC 25204株、HN01株、MS-H株、NCTC10124株。

將核苷酸同源性的閾值設置為99%、核苷酸序列長度的差異閾值設置為70%，其他參數(shù)均為默認參數(shù)，利用CD-HIT-EST快速聚類方法（v 4.8.1）^[9]獲取上面所提46株支原體的特有基因和共有基因。選取6株滑液支原體共有且相對于其他支原體特有的基因集進行BLASTN分析，鑒定滑液支原體相對于已知基因序列的其他物種的核苷酸水平特有基因。

1.4支原體、細菌、跗關節(jié)組織基因組DNA的提取

支原體的基因組DNA利用Mycoplasma gDNA Miniprep Kit并按用戶手冊提取，細菌的基因組DNA利用MiniBEST Bacteria Genomic DNA Extraction Kit Ver.3.0并按用戶手冊提取。

取“1.1”節(jié)中病料和健康組織，經(jīng)反復凍融2～3次、剪碎、按質(zhì)量體積比1 ∶3與PBS（pH值7.4）混合后，利用均質(zhì)儀進行組織的充分均質(zhì)。均質(zhì)物經(jīng)6 000 r/s離心5 min，取上清液用于基因組DNA的提取。利用Mycoplasma gDNA Miniprep Kit并按用戶手冊提取各樣品基因組DNA。

使用核酸蛋白測定儀測定各樣品中DNA的含量。獲得的樣品基因組DNA立即使用，或置于 -40 ℃ 冰箱中保存，避免反復凍融。

1.5引物設計與合成

利用Primer Premier 5軟件對引物進行設計。qPCR檢測的上游引物命名為qMS-2885F;下游引物命名為qMS-2885R。設計好的引物經(jīng)BLASTN分析是否能非特異性地結(jié)合除滑液支原體外其他物種的DNA。同時設計用于常規(guī)PCR擴增VY93_RS02885基因片段的引物對MS-2885F和MS-2885R。引物序列信息見表1，交由南京擎科生物科技有限公司進行引物合成。

1.6陽性重組質(zhì)粒的構(gòu)建

以滑液支原體標準株ATCC 25204的基因組DNA為模板，以MS-2885F和MS-2885R為引物，利用2×Taq Plus Master Mix Ⅱ（Dye Plus）并按用戶手冊設置PCR反應體系和反應程序，擴增基因片段，基因片段命名為MS-2885。

將MS-2885利用pMD18-T Vector Cloning Kit并按用戶手冊連接至pMD-18T。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至DH5α。經(jīng)PCR檢測含有陽性重組質(zhì)粒pMD-18T：：MS-2885的DH5α送至南京擎科生物科技有限公司測序。測序結(jié)果顯示沒有堿基突變的pMD-18T：：MS-2885作為后續(xù)使用的陽性重組質(zhì)粒。

1.7SYBR green qPCR反應體系和反應程序

按照AceQ^?qPCR SYBR Green Master Mix（High ROX Premixed）的用戶手冊設置qPCR反應體系和程序。具體如下：

qPCR反應體系（20 μL）：AceQ^?qPCR SYBR Green Master Mix（High ROX Premixed）（2X）10 μL，10 μmol/L的qMS-2885F和qMS-2885R各 0.4 μL，樣品DNA 1 μL（濃度<100 ng/μL），其余用滅菌雙蒸水補齊。

qPCR反應程序：預變性，95 ℃ 5 min;PCR反應，95 ℃ 10 _s、60 ℃ 30_s，40個循環(huán);按儀器默認設置進行解離步驟。

1.8標準曲線的建立和溶解曲線分析

將“1.6”節(jié)中所得陽性重組質(zhì)粒pMD-18T：：MS-2885進行DNA濃度測定和調(diào)整及10倍梯度稀釋。以1×10⁹到10 拷貝/μL的質(zhì)粒為模板，參照“1.7”節(jié)反應體系和反應程序進行SYBR green qPCR檢測，并繪制標準曲線和進行熔解曲線分析。

1.9敏感性分析

以1 000、100、10、5、2.5、1 拷貝/反應的陽性重組質(zhì)粒為模板，分別進行10次“1.7”節(jié)所述qPCR反應，統(tǒng)計每個拷貝能獲得CT值的百分率。以100%能陽性擴增獲得CT值的最小靶標基因拷貝數(shù)作為檢測極限。

1.10重復性分析

以1×106、1×105、1×104拷貝/反應的陽性重組質(zhì)粒為模板，分別進行4次（組間）“1.7”節(jié)所述qPCR反應，每次反應相同條件設置4個重復（組內(nèi)）。計算組內(nèi)、組間CT值的平均值、標準差和變異系數(shù)。

1.11特異性分析

取雞毒支原體、禽致病性大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、雞白痢沙門氏菌、雞傷寒沙門氏菌、鼠傷寒沙門氏菌和滑液支原體標準株和臨床分離株的基因組DNA。測定各基因組DNA的濃度并將濃度調(diào)整到1 ng/μL。以各菌/支原體基因組DNA為模板進行“1.7”節(jié)所述qPCR反應。以滅菌雙蒸水為陰性對照。每組qPCR反應進行3次獨立試驗。

1.12滑液支原體陽性雞組織和SPF健康雞組織的檢測

取實驗室保存的48份基于病原分離培養(yǎng)、基因組DNA提取、常規(guī)PCR鑒定獲得的滑液支原體陽性雞跗關節(jié)組織和10份SPF健康雞跗關節(jié)組織，提取這些雞跗關節(jié)組織的基因組DNA，并測定和調(diào)整DNA濃度到1 ng/μL。以這些基因組DNA為模板進行“1.7”節(jié)所述qPCR反應。以滅菌雙蒸水為陰性對照，每組qPCR反應進行3次獨立試驗。

2結(jié)果與分析

2.1滑液支原體核苷酸水平特有基因的篩選和后續(xù)分子診斷靶標的確定

CD-HIT-EST快速聚類顯示46株支原體中總共有22 044個泛基因集。進一步篩查，總共有433個基因集是6株滑液支原體所共有且相對于其他40株支原體特有。以往的研究報道將BLASTN比對下，在E值<103的情況下，匹配的非本物種基因覆蓋度不大于40%的基因作為該物種的特有基因。將這433個基因集進行逐一的BLASTN比對，符合這一條件的特有基因集有96個。其中，在E值<103的情況下，匹配的非滑液支原體基因覆蓋度不大于5%的基因集總共有27個。由表2可知，為方便后續(xù)用于分子診斷靶標特有基因的確定，僅選取>500 bp的17個特有基因集用作后續(xù)分析;這17個基因集包含的基因均為各滑液支原體中的單拷貝基因。參照先前研究報道對滑液支原體共有基因的鑒定^[10]，最終選擇編碼假定蛋白的特有基因VY93_RS02885作為后續(xù)分子診斷的靶標。

2.2引物的設計和特異性分析

利用Primer Premier 5在VY93_RS02885的開放閱讀框中設計SYBR green qPCR診斷引物，預測的上游引物和下游引物的Tm值分別為59.4 ℃和596 ℃。引物擴增的片段大小為122 bp（表1）。經(jīng)過BLASTN比對，該引物對僅能匹配滑液支原體的基因VY93_RS02885，說明這對引物的特異性良好。

2.3標準曲線的建立和溶解曲線分析

以10倍稀釋所構(gòu)建的陽性重組質(zhì)粒，用上述引物對進行SYBR green qPCR檢測。由圖1可知，不同濃度的模板均能擴增出典型的“S”形擴增曲線，采用模板濃度從1×109～1×10拷貝/反應及其對應的擴增CT值作的標準曲線呈現(xiàn)良好的線性關系。以模板濃度的lg值為橫坐標，以擴增CT值為縱坐標，所作標準曲線的方程式為y=-3.719 6x+38395，r2為0.998 8。由圖2可知，熔解溫度（Tm）在75.54 ℃左右出現(xiàn)狹窄、單一的特異性峰，沒有引物二聚體及非特異性擴增的峰，說明所構(gòu)建的方法特異性較好。特異性擴增峰的Tm值相對較低，可能與滑液支原體基因的GC比在28%左右有關^[11]。

2.4敏感性分析

將陽性重組質(zhì)粒倍比稀釋到1 000、100、10、5、2.5、1拷貝/反應并作為模板，以本研究建立的qPCR方法分別擴增10次，結(jié)果（圖3）表明，當模板在1 000、100、10拷貝/反應時，均能100%擴增出CT值;當模板在5.0、2.5、1.0拷貝/反應時，分別有90%、90%、80%的概率擴增出CT值。這說明本研究構(gòu)建的SYBR green qPCR檢測方法的敏感性為10拷貝/反應。

2.5重復性分析

由表3可知，將3種不同濃度的陽性重組質(zhì)粒模板分別組內(nèi)和組間重復4次，組內(nèi)標準差在0031 0～0.155 1間，變異系數(shù)在0.153 5%到 0.651 5% 之間;組間標準差在0.178 4到0.235 6之間，變異系數(shù)在0.747 1%～1.165 8%間，說明本研究建立的SYBR green qPCR檢測方法的可重復性較好。表3重復性分析結(jié)果

項目1×106拷貝CT值1×105拷貝CT值1×104拷貝CT值平均值標準差變異系數(shù)（%）平均值標準差變異系數(shù)（%）平均值標準差變異系數(shù)（%）第一次（組內(nèi)）15.923 80.043 50.273 120.200 30.031 00.153 523.811 50.155 10.651 5第二次（組內(nèi)）15.897 50.073 10.460 019.818 80.092 40.466 424.042 00.078 30.325 6第三次（組內(nèi)）16.174 00.104 30.645 020.387 30.055 60.272 723.697 30.083 40.351 9第四次（組內(nèi)）16.296 00.082 20.504 319.945 80.070 90.355 323.985 50.146 80.611 9組間16.072 80.187 41.165 820.088 00.235 61.172 723.884 10.178 40.747 1

2.6特異性分析

利用本研究建立的SYBR green qPCR診斷方法檢測滑液支原體標準株ATCC 25204和20株臨床分離株。由圖4可知，結(jié)果均能擴增出現(xiàn)典型的“S”形擴增曲線，且CT值在13.595～17.377間;檢測其他6種臨床上常見的引起雞關節(jié)炎的細菌/支原體性病原和滅菌雙蒸水均檢測不到CT值，結(jié)果說明本研究建立的SYBR green qPCR檢測方法具有較高的特異性。

2.7雞組織中病原檢測

用本研究建立的SYBR green qPCR診斷方法檢測實驗室保存的48份滑液支原體陽性雞跗關節(jié)組織樣品的基因組DNA，結(jié)果顯示均能擴增出CT值，最大的CT值為29.155;檢測實驗室保存的10份SPF健康雞的跗關節(jié)組織基因組DNA和滅菌雙蒸水均不能擴增出CT值。說明本研究建立的診斷方法準確性較高。

3討論

滑液支原體的生長緩慢，且沒有針對滑液支原體的選擇培養(yǎng)基，從宿主分離出來的滑液支原體，前2代液體培養(yǎng)往往需要1周甚至更長的時間。因此，病原分離不適用于滑液支原體感染的及時診斷，且病原分離后也需要進行例如常規(guī)PCR等方法鑒定?；褐гw所致疾病發(fā)展緩慢，往往需要 1～3 周的時間才能刺激宿主產(chǎn)生抗體[12]。因此，ELISA和血凝抑制試驗不適用于滑液支原體感染的早期診斷。多種多樣的PCR檢測方法成為了滑液支原體感染的快速診斷方法。

國外研究學者建立了以滑液支原體16S rRNA、23S rRNA及其周圍基因間序、vlhA保守區(qū)為靶標的常規(guī)PCR檢測方法^[13-15]。此外，針對以上3個靶點的TaqMan qPCR檢測方法和針對16S rRNA的SYBR green qPCR檢測方法也已建立^[16-17]。鑒于臨床上區(qū)分野毒和弱毒活疫苗的需要，逐步建立了以obg基因為靶標的SYBR green qPCR檢測方法和以obg基因或者oppF基因為靶標的巢式PCR與高分辨率熔解曲線分析相結(jié)合的方法來鑒別MS-H疫苗株與野毒株^[18-20]。以及建立了以HIT家族蛋白編碼基因的單堿基突變?yōu)榘袠说腻e配放大突變分析方法區(qū)分疫苗株MS1和野毒株^[21]。2017年開始我國開放進口弱毒苗MS-H[（2017）外獸藥證字33號]，因此針對MS-H與野毒的鑒別診斷在我國也具有了臨床意義。我國研究學者也以vlhA保守區(qū)為靶標建立了TaqMan qPCR診斷方法^[22]。鑒于如前言所述單基因靶標的潛在問題、qPCR相對于常規(guī)PCR的檢測敏感度、SYBR green qPCR的經(jīng)濟實惠等因素，本研究重點建立針對其他靶點的滑液支原體SYBR green qPCR檢測方法。

PCR檢測的特異性是臨床診斷的重要方面，是準確診斷何種病原所致感染的關鍵。本研究利用生物信息學手段鑒定出多個核苷酸水平上的滑液支原體特有基因，并結(jié)合國外報道的滑液支原體共有核心基因來選擇qPCR診斷的靶標，以從靶標選擇上確保PCR檢測的特異性。本研究鑒定的特有基因也為其他研究學者建立相關的分子診斷、病原基因分型方法提供備選靶標。

qPCR的敏感性是該分子診斷方法的另一個重要方面。想要做到及時快速診斷，就要省略病原分離步驟，從發(fā)病甚至疑似發(fā)病的組織或者氣管拭子、鼻拭子等直接提取基因組DNA用于診斷。從宿主組織中提取的DNA會摻雜很高比例的宿主基因組DNA。從拭子中提取的DNA又往往濃度不高。在這些情況下，就需要qPCR的檢測敏感性足夠高。本研究建立的qPCR診斷方法的敏感性在10拷貝/反應，高于國外針對16S rRNA所建立的SYBR green qPCR檢測方法1倍以上^[12]。這對待檢樣品中病原含量較低時的快速準確診斷具有積極意義。

本研究建立的以特有基因為靶標的滑液支原體SYBR green qPCR檢測方法具有用時短、特異性高、敏感性高、可重復性強、經(jīng)濟實惠等優(yōu)點，能滿足大批量樣品的快速準確鑒定，有利于滑液支原體感染的早期診斷、及時治療和預防病原的進一步擴散，有利于減少滑液支原體感染所致養(yǎng)禽業(yè)的經(jīng)濟損失，促進養(yǎng)禽業(yè)的健康發(fā)展。

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基金項目：國家重點研發(fā)計劃（編號：2017YFD0500706）;國家自然科學基金（編號：32002291）

作者簡介：徐彬（1987—），男，河北廊坊人，博士，助理研究員，主要從事動物傳染病防治研究。E-mail：xubin9999@foxmail.com。

通信作者：張小飛，博士，研究員，主要從事動物傳染病防治研究。E-mail：xiaofei0804@sina.com。