趙伊然，林淑玲，劉奎昊，耿寧蔚，王思琪，李 寧*，劉思當(dāng)*

（1.山東農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院/山東省動物生物工程與疾病防治重點實驗/山東省畜禽疫病防制工程 技術(shù)研究中心，山東 泰安 271018；2.山東省棲霞市農(nóng)業(yè)農(nóng)村局，山東 棲霞）

腺病毒（fowl adenovirus，F(xiàn)AdV）是一種無囊膜的雙股DNA病毒，直徑大小為60~90 nm[1]。腺病毒根據(jù)其抗原結(jié)構(gòu)的不同可以分為3個群，其中I群主要是禽腺病毒，I群禽腺病毒屬又分為5個亞群（FadV-A、-B、-C、-D、-E）和12個血清型（FadV-1至 -8a、-8b至 -11）[2]。目前流行的禽腺病毒病主要是由FAdV-4感染所致，且存在其他血清型FAdV及免疫抑制病毒的混合感染，F(xiàn)AdV-4感染引起禽類的心包積液肝炎綜合征（Hydropericardium hepatitis syndrome，HHS），主要造成肝臟腫大出血[3]，肝細胞的變性壞死且細胞內(nèi)出現(xiàn)特征性的核內(nèi)包涵體，該病毒不會直接感染心肌細胞，但是血漿滲出會造成心包積液。

沙門氏菌是一種革蘭氏陰性無芽抱桿菌，動物感染后，可呈無癥狀帶菌狀態(tài)，或出現(xiàn)生產(chǎn)性能下降、腹瀉、急性敗血癥等癥狀，導(dǎo)致死亡率増加。沙門氏菌血清型眾多，至今已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了2 500多種[4]，而感染禽類的主要有鼠傷寒沙門氏菌、雞白痢沙門氏菌、雞傷寒沙門氏菌、腸炎沙門氏菌、鴨沙門氏菌、乙型副傷寒沙門氏菌、豬霍亂沙門氏菌等幾個血清型[5]。

近年來，腺病毒在山東、河南等地養(yǎng)殖的肉雞肉鴨中廣泛存在，造成了肉雞肉鴨生長緩慢、批量死亡等嚴重問題[6]，給養(yǎng)禽業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失，威脅著養(yǎng)禽業(yè)的健康發(fā)展[7]。腺病毒感染會造成強免疫抑制，因此經(jīng)常會引發(fā)各種細菌及其他病毒繼發(fā)感染[8]。為確診該病，對發(fā)病鴨進行了病理剖檢觀察、病理組織學(xué)檢查、病原學(xué)檢測、藥敏試驗，以及細菌分離鑒定和測序分 析，最終確定了引起該鴨場疫情的病因是腺病毒及沙門氏菌的混合感染。這次診斷給腺病毒及其與其他病原體混合感染的診斷與防治提供了一些經(jīng)驗。

1 材料與方法

1.1 主要試驗耗材

Easypure Viral DNA/RNA Kit核酸提取試劑盒、pEASY-T1 Simlie克隆試劑盒，均購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；Biospin Gel Extraction Kit膠回收試劑盒，購自杭州博日科技有限公司；瓊脂糖粉，購自Sigma公司；煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD）、血瓊脂培養(yǎng)基、普通Taq酶、DL 2 000 DNA Marker，購自寶生物工程（大連）有限公司。

1.2 發(fā)病情況

2020年9月，河南省某鴨場飼養(yǎng)的9 000只櫻桃谷鴨雛鴨飼養(yǎng)至20日齡時突然發(fā)病，大批量死亡，1 d的死亡量最高達到了60余只。部分患病雛鴨死亡前出現(xiàn)精神高度萎靡、排白色稀糞、食欲廢絕以及張口呼吸等癥狀，但大部分發(fā)病雛鴨未表現(xiàn)出明顯的臨床癥狀就突然死亡。

1.3 病理剖檢及組織病理學(xué)檢測

對病鴨進行病理剖檢，觀察各臟器病理變化。采集病鴨的肝、腦、心及脾等組織樣品，放于10 % 福爾馬林溶液中進行固定，然后把固定好的組織進行石蠟切片、HE染色、鏡檢，觀察其病理變化。

1.4 細菌分離鑒定

將接種環(huán)用酒精燈高溫滅菌后，將病鴨肝臟組織進行無菌取樣；接種于普通瓊脂培養(yǎng)基和XDL鑒別培養(yǎng)基，在培養(yǎng)箱中37 ℃ 培養(yǎng)24 h；挑取XDL鑒別培養(yǎng)基上的單菌落置于載玻片上，革蘭染色后鏡檢觀察細菌染色及形態(tài)特征。

1.5 藥敏試驗

挑取普通培養(yǎng)基上的少量菌于0.2 ml的生理鹽水中制成細菌混懸液，用高溫滅菌后的涂菌棒將待檢細菌混懸液均勻地涂布于平皿培養(yǎng)基表面。將鑷子于酒精燈火焰滅菌后略停，取藥敏片貼到平皿培養(yǎng)基表面，將平皿培養(yǎng)基置于37 ℃ 溫箱中培養(yǎng)24 h后，觀察效果。

1.6 PCR檢測

將采集的病鴨組織樣品剪碎后加入滅菌PBS充分研磨，然后置于 ?20 ℃ 冰箱中反復(fù)凍融3次后，4 ℃ 9 000 r/min離心3 min，從上清液中提取核酸并將其作為模板對臨床常見病原進行PCR檢測，包括禽流感病毒、黃病毒、圓環(huán)病毒、I型鴨肝病毒、Ⅲ型鴨肝病毒、呼腸孤病毒及腺病毒。細菌 16 SsrRNA 通用引物為27 F/1492R。以上引物均為本實驗室保存，具體序列見表1。

表1 試驗中所用檢測引物信息

將提取的核酸反轉(zhuǎn)錄為cDNA，采用檢測引物進行擴增。PCR擴增程序：94 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s，54~56 ℃ 30 s，72 ℃ 20~35 s，共32個循環(huán)；72 ℃ 7 min。產(chǎn)物經(jīng)1.0 % 瓊脂糖凝膠電泳檢測，將得到目的片段回收進行T-A克隆，陽性菌液送至上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測序。從GenBank中下載22株FAdV序列，具體見表2，5株沙門氏菌序列（KY776577和MT500568.1），2株大腸桿菌序列，通過MEGA6軟件中的Maximum Likehood tree方法進行本次分離毒株及菌株的遺傳進化分析，同時使用MegAlign軟件進行同源性分析。

表2 本研究中使用的FAd V的參考毒株

2 結(jié)果與分析

2.1 病理剖檢及病理組織學(xué)檢測

剖檢病鴨可見心包有淡黃色積液；肝臟出血腫大；腸道出血性卡他性炎癥；脾臟腫大出血。心肌細胞變性，間質(zhì)有漿液滲出；肝細胞變性壞死，出現(xiàn)核內(nèi)包涵體；胸腺、脾臟及法氏囊內(nèi)的淋巴細胞壞死；十二指腸上皮細胞壞死脫落；黏膜固有層出血。

2.2 細菌分離

病料接種到XDL鑒別培養(yǎng)基上可以見到光滑、稍隆起、無色有黑心的菌落。挑取菌落涂片鏡檢，結(jié)果經(jīng)革蘭氏染色后鏡檢發(fā)現(xiàn)有革蘭氏陰性的細小長桿菌。

2.3 藥敏結(jié)果

對培養(yǎng)出來的細菌用7種藥物進行藥敏試驗 藥敏檢測結(jié)果顯示細菌對恩諾沙星最敏感，對新霉素，粘桿菌素，林可霉素和氟苯尼考較敏感，對頭孢奎肟，磷霉素不敏感。

2.4 PCR鑒定

PCR結(jié)果顯示AIV、DTMUV、DUCV、GPMV、NDRV均為陰性，僅FadV為陽性。

2.5 腺病毒序列分析

將臨床收到的疑似鴨腺病毒分離株命名為SD202009，利用MegAlign進行同源性及進化樹分析，結(jié)果表明，此次分離的毒株與MK65019 3、KX421404等毒株親緣關(guān)系最近，表明該毒株為腺病毒4型（圖1、2）。

圖1 分離毒株的遺傳進化分析

圖2 分離毒株的同源性分析結(jié)果

2.6 沙門氏菌序列分析

將分離到的菌株命名為SD202090，利用 MegAlign進行同源性及進化樹分析，結(jié)果表明，此次分離的菌株與NR044370菌株親緣關(guān)系最近，表明該菌株為沙門氏菌（圖3）。

圖3 分離菌株的遺傳進化分析

3 討論

禽腺病毒是現(xiàn)在家禽中最常引發(fā)疾病的病原微生物之一，研究表明無論是健康的家禽還是患病的家禽體內(nèi)均可以分離到腺病毒[9]，該病毒可以在家禽體內(nèi)長期存在，只引起輕微的臨床癥狀，但感染腺病毒會引起免疫抑制，故該病毒常與其他病原體一起造成混合感染[10]。本研究中，發(fā)病鴨場20日齡的櫻桃谷鴨出現(xiàn)大批量突然死亡，經(jīng)過一系列的實驗室診斷技術(shù)，確診為禽腺病毒4型和沙門氏菌的混合感染。可以推斷本次診斷的病鴨先是感染了腺病毒，造成了抵抗力下降繼發(fā)感染了沙門氏菌后引起鴨群發(fā)病和死亡。

根據(jù)之前的報道，不同的鴨源腺病毒4型毒株對鴨的致病性不一[11]，該病毒會引起鴨“安卡拉病”，一年四季均可發(fā)生，但在冬、夏多發(fā)。該病可以感染40日齡以內(nèi)的鴨，主要感染20~40日齡的鴨，日齡越小發(fā)病率和死亡率越高，30日齡以后發(fā)病的常會發(fā)生混合感染，造成死亡率增加[12]，處于亞健康的青年鴨會出現(xiàn)心包積液，死亡率在30 % 以上。本次診斷的鴨群在20日齡時發(fā)病，有著較高的死亡率和發(fā)病率，且存在沙門氏菌的混合感染，符合上述鴨安卡拉病的特征。

由于現(xiàn)階段腺病毒存在大量的隱性感染，給養(yǎng)禽業(yè)造成了巨大的威脅。因此，一定要加強對該疾病防控的重視。本次診斷對FadV-4感染和沙門氏菌感染的診斷防控具有一定的指導(dǎo)意義。