正交試驗(yàn)法優(yōu)選玄參中肉桂酸的超聲提取工藝

鄧 瑩 劉 杰 李 香 魏學(xué)軍

黔南民族醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校，貴州 都勻 558000

玄參又名浙玄參、廣玄參、元參，是玄參科植物玄參ScrophularianingpoensisHemsl.的干燥根，具有滋陰降火、解毒散結(jié)的功效，主要用于治療熱入營血、溫毒發(fā)斑、熱病傷陰、咽喉腫痛等癥[1]。研究[2]表明玄參的化學(xué)成分主要為環(huán)烯醚萜類、苯丙素苷類、有機(jī)酸類等，其有機(jī)酸中的肉桂酸具有抗菌、消炎、利膽、輕瀉等作用[3]，是玄參的生物活性成分之一。超聲波提取具有提取效率高、時(shí)間短、溶劑消耗少、污染少、提取工藝溫度低、能有效維持提取物的生物活性，且設(shè)備相對簡單等特點(diǎn)，是一種新型環(huán)保提取技術(shù)[4]。為優(yōu)化玄參中肉桂酸的超聲提取工藝，本實(shí)驗(yàn)在單因素考察的基礎(chǔ)上，采用L9(34)正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化玄參肉桂酸超聲提取工藝的甲醇濃度、液固比、提取時(shí)間、提取次數(shù)，旨在為玄參肉桂酸的提取工藝提供參考。

1 材料與試藥

1. 1 試藥 實(shí)驗(yàn)用玄參采于貴州省遵義市道真縣中藥材種植基地，經(jīng)黔南民族醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校中藥教研室李香教授鑒定為玄參科植物玄參ScrophularianingpoensisHemsl. 的根。肉桂酸對照品(批號：CHB190106，成都克洛瑪生物科技有限公司)。乙腈(色譜純)；其他試劑均為分析純。

1. 2 儀器 Agilent1260高效液相色譜儀 (美國安捷倫公司)；SG - 4050C數(shù)顯恒溫水浴鍋(上海碩光公司)；AE240電子分析天平(瑞士MettLer公司)；AS10200A 超聲波提取機(jī)(杭州匯爾公司)。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 Agilent C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相為乙腈-0.1%磷酸水(40-60)；流速1 .0 mL/min；進(jìn)樣量10 μL；柱溫25 ℃；檢測波長285 nm。色譜圖如圖1所示。

圖1 肉桂酸HPLC圖

2.2 供試品溶液制備[3]精密稱取玄參樣品粉末約1.0 g，置于三角瓶中，準(zhǔn)確移入30%甲醇50 mL，密塞稱重，浸泡1 h，超聲提取30 min，冷卻后，用30%甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，0.45 μm微孔濾膜過濾，即得。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制[3]制備質(zhì)量濃度為1、2、5、10、15、20 μg/mL的肉桂酸對照品溶液，按照“2.1”色譜條件測肉桂酸峰面積。以對照品色譜峰面積為縱坐標(biāo)(Y)，進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)(X)作線性回歸，得肉桂酸線性回歸方程為Y=867.8X-674.09(R2=0.9998)，表明肉桂酸在1～20 μg/mL內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.4 方法學(xué)考察 精密吸取0.1 mg/mL的肉桂酸對照品溶液10 μL，按“2.1”項(xiàng)下方法測定5次，測得峰面積的RSD值為0.14%。取“2.2”項(xiàng)下供試品溶液，在0、6、12、24、48 h測定，結(jié)果峰面積的RSD值為1.29%。取玄參藥材粉末1.0 g，6份，精密稱定，按上述“2.2”項(xiàng)方法制備供試液，測定峰面積，結(jié)果峰面積的RSD值為1.06%。取0.5 g含量為1.97 mg的玄參粉末6份，精密稱定，每2份為一組，共為3組，各組中依次加入肉桂酸對照品0.98、1.97、2.96 mg，按“2.2”項(xiàng)制備供試品溶液，按照“2.1”項(xiàng)色譜條件測定。結(jié)果見表1。

表1 加樣回收率測定結(jié)果 (n=6)

2.5 樣品含量測定 分別取3份玄參藥材粉末，各1.0 g，精密稱定，按“2.2”項(xiàng)下方法操作，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，計(jì)算玄參中肉桂酸的平均含量為(6.68±0.08)mg/g(n=3)。

2.6 單因素實(shí)驗(yàn)

2.6.1 甲醇濃度考察 精密稱取玄參藥材粉末約1.0 g，5份，分別加20%、30%、40%、50%、60%甲醇30 mL，超聲提取20 min，提取1次，測定肉桂酸峰面積并計(jì)算含量，結(jié)果如圖2所示。由圖可知，肉桂酸含量隨著甲醇濃度的增加而增加，當(dāng)用40%甲醇作為提取溶劑時(shí)，肉桂酸含量最高，而用50%甲醇提取所得的肉桂酸含量反而下降，可能是因?yàn)殡S著甲醇濃度的增加，玄參中醇溶性物質(zhì)溶出增多，與肉桂酸競爭溶劑，故選擇40%甲醇作為提取溶劑。

圖2 甲醇濃度對肉桂酸含量的影響

2.6.2 液固比考察 精密稱取玄參藥材粉末約1.0 g，5份，分別以40%甲醇10、20、30、40、50 mL超聲提取20 min，提取1次，測定肉桂酸峰面積并計(jì)算含量，結(jié)果如圖3所示，由圖可知液固比為40∶1時(shí)所提取的肉桂酸含量已趨于穩(wěn)定，與液固比為30∶1時(shí)差別不大，從節(jié)約溶劑的角度考慮，選擇液固比為30∶1來進(jìn)行工藝優(yōu)化。

圖3 液固比對肉桂酸含量的影響

2.6.3 超聲提取時(shí)間考察 取玄參藥材粉末約1.0 g，5份，精密稱定，分別加40%甲醇30 mL后，分別超聲提取10、20、30、40、50 min，提取1次，測定肉桂酸峰面積并計(jì)算含量，結(jié)果如圖4所示，由圖可知肉桂酸含量隨著超聲時(shí)間的延長而逐漸升高，但當(dāng)超聲40 min時(shí)肉桂酸的含量與超聲30 min時(shí)無顯著差異，可能是因?yàn)殡S著提取時(shí)間的增加，甲醇的揮發(fā)降低了甲醇的濃度影響了肉桂酸的溶出，從節(jié)約能源和提高效率的角度考慮，選擇超聲提取30 min來進(jìn)行工藝優(yōu)化。

圖4 超聲提取時(shí)間對肉桂酸含量的影響

2.6.4 提取次數(shù)考察 精密稱取玄參藥材粉末約1.0 g，4份，加入40%甲醇30 mL，超聲30 min，分別提取1次、2次、3次、4次，測定肉桂酸峰面積并計(jì)算含量，結(jié)果如圖5所示，由圖可知提取至3次時(shí)肉桂酸含量已趨于穩(wěn)定，從節(jié)約資源和時(shí)間的角度考慮選擇提取3次來進(jìn)行優(yōu)化。

圖5 提取次數(shù)對肉桂酸含量的影響

2.7 超聲提取工藝優(yōu)選 結(jié)合單因素考察結(jié)果，選取甲醇濃度(A)、液固比(B)、提取時(shí)間(C)和提取次數(shù)(D)為影響因素，以玄參肉桂酸含量為評價(jià)指標(biāo)，進(jìn)行L9(34)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，以直觀分析和方差分析判斷四個(gè)因素對玄參肉桂酸含量的影響，篩選最佳工藝。因素水平見表2，實(shí)驗(yàn)安排及結(jié)果見表3，方差分析見表4。

表2 因素與水平

表3 正交實(shí)驗(yàn)安排表及結(jié)果

表4 方差分析

由表3中各因素極差大小可知，影響玄參肉桂酸含量的因素順序?yàn)镈>A>B>C，其中A因素和B因素的R值相同，以極差值最小的C因素作為誤差項(xiàng)進(jìn)行方差分析，由方差分析結(jié)果表4可知，4個(gè)影響因素對玄參肉桂酸含量均無顯著性影響，因此結(jié)合K值，可選擇最佳提取工藝為A1B1C2D3，即用30%甲醇作為提取溶劑，液固比為20∶1，超聲提取3次，每次30 min。

2.8 驗(yàn)證試驗(yàn) 為進(jìn)一步驗(yàn)證優(yōu)選工藝的可行性，取玄參藥材粉末1.0 g，3份，精密稱定，按“2.7”項(xiàng)下優(yōu)化的最佳提取工藝條件提取，即加入30%甲醇20 mL，超聲提取3次，每次30 min，合并濾液定容至100 mL，用0.45 μm微孔濾膜過濾，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，計(jì)算得玄參中肉桂酸的平均含量為(8.78±0.07)mg/g，與優(yōu)選前“2.5”項(xiàng)下樣品中肉桂酸含量相比較具顯著性差異(P<0.01)，RSD=1.05%。結(jié)果表明優(yōu)化的提取工藝科學(xué)合理、穩(wěn)定可行。

3 討論

根據(jù)肉桂酸的溶解性，試驗(yàn)選取了對人體相對安全的50%甲醇和50%乙醇來對玄參中的肉桂酸進(jìn)行提取，結(jié)果發(fā)現(xiàn)用50%甲醇作為提取溶劑時(shí)，玄參中肉桂酸的提取率更高，因此試驗(yàn)中用的提取溶劑為甲醇。此外，本試驗(yàn)還比較了回流提取法和超聲提取法對玄參肉桂酸含量的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)超聲提取法所得肉桂酸含量高于回流提取法，且超聲提取法更省時(shí)、高效、節(jié)能。

肉桂酸具有輕瀉作用，而滋陰是玄參的主要功效，因此肉桂酸在玄參中的含量密切關(guān)系著玄參藥理作用的發(fā)揮[5]。對于玄參中肉桂酸的研究，文獻(xiàn)中多見含量測定[6-8]，但玄參中肉桂酸提取工藝研究筆者尚未見國內(nèi)外文獻(xiàn)報(bào)到，為提高玄參中肉桂酸的提取率，本試驗(yàn)在預(yù)試驗(yàn)和單因素考察的基礎(chǔ)上，采用正交試驗(yàn)對玄參中肉桂酸的超聲提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，并結(jié)合直觀分析和方差分析，篩選出了科學(xué)、合理的最佳工藝。3次驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果顯示，優(yōu)選出的工藝所提取的玄參肉桂酸含量較高，RSD小于1.5%。

綜上，試驗(yàn)所得到的玄參中肉桂酸超聲提取工藝穩(wěn)定性好、專屬性強(qiáng)，可為玄參中肉桂酸的提取和進(jìn)一步開發(fā)利用提供參考。該優(yōu)化工藝提取的肉桂酸對玄參藥理藥效作用的影響有待下一步深入研究。