艾灸對(duì)腹瀉型腸易激綜合征大鼠結(jié)腸5-HT及 5-HT3R的影響

曹佳男 劉霞 劉濤 劉瓊 劉密 常小榮 謝輝

〔摘要〕 目的 觀察艾灸對(duì)腹瀉型腸易激綜合征（diarrhea predominant irritable bowel syndrome， IBS-D）大鼠5羥色胺（5-hydroxytryptamine， 5-HT）及5羥色胺3受體（5-hydroxytryptamine 3 receptor， 5-HT3R）的影響，分析艾灸治療IBS-D的作用機(jī)制。

方法 選取SPF級(jí)雄性SD大鼠48只隨機(jī)分為正常組、模型組、溫和灸組、西藥組，每組12只。乙酸灌腸后行束縛刺激，每天束縛1 h，持續(xù)束縛2周復(fù)制IBS-D大鼠模型。造模成功后，溫和灸組穴位分為兩組：Ⅰ組選肝俞、脾俞、足三里，Ⅱ組選章門、期門、足三里。Ⅰ組、Ⅱ組穴位隔日交替施灸，每次15 min，持續(xù)2周。西藥組以匹維溴銨片（10 mL/kg）灌胃，1次/d，持續(xù)2周。分別在治療前后觀察各組大鼠一般行為學(xué)、內(nèi)臟敏感性、糞便含水量、結(jié)腸病理;ELISA法檢測(cè)結(jié)腸組織5-HT的含量;Western blot檢測(cè)結(jié)腸組織5-HT3R的表達(dá)。結(jié)果 正常組大鼠精神、活動(dòng)佳，反應(yīng)靈敏;模型組大鼠精神、活動(dòng)差、反應(yīng)遲緩;與模型組相比，溫和灸組、西藥組大鼠一般行為學(xué)表現(xiàn)均有改善。各組大鼠結(jié)腸組織形態(tài)均正常，無(wú)明顯充血水腫潰瘍、炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)等病理組織學(xué)改變。與正常組比較，模型組大鼠內(nèi)臟敏感性升高（P<0.01）;與模型組相比，溫和灸組、西藥組大鼠內(nèi)臟敏感性下降（P<0.01）。與正常組比較，模型組大鼠糞便含水量增加（P<0.01）;與模型組相比，溫和灸組、西藥組大鼠大便含水量明顯降低（P<0.01）。與正常組相比，模型組結(jié)腸組織中5-HT、5-HT3R的表達(dá)量上升（P<0.05，P<0.01）;與模型組相比，溫和灸組、西藥組結(jié)腸組織中5-HT、5-HT3R的表達(dá)量下降（P<0.05，P<0.01）。結(jié)論 艾灸可以有效改善IBS-D大鼠腹瀉癥狀和內(nèi)臟高敏感性，可能與艾灸調(diào)節(jié)結(jié)腸組織中5-HT及其受體的表達(dá)相關(guān)。

〔關(guān)鍵詞〕 艾灸;腸易激綜合征;5羥色胺;5羥色胺3受體;內(nèi)臟敏感性

〔中圖分類號(hào)〕R245.8? ? ? ?〔文獻(xiàn)標(biāo)志碼〕A? ? ? ?〔文章編號(hào)〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2021.10.004

Effect of Moxibustion on Colon 5-HT and 5-HT3R in Diarrhea Predominant

Irritable Bowel Syndrome Rats

CAO Jianan1， LIU Xia2， LIU Tao3， LIU Qiong1， LIU Mi1， CHANG Xiaorong1*， XIE Hui4*

（1. Hunan University of Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410208， China;

2. Chongqing Three Gorges Medical College， Wanzhou， Chongqing 404120， China;

3. Jiangsu Province Academy of Traditional Chinese Medicine， Nanjing， Jiangsu 210028， China;

4. West Hospital of Chenzhou First Peoples Hospital， Chenzhou， Hunan 423000， China）

〔Abstract〕 Objective To observe the effect of moxibustion on 5-hydroxytryptamine （5-HT） and 5-hydroxytryptamine 3 receptor （5-HT3R） in colon tissue of rats with diarrhea predominant irritable bowel syndrome （IBS-D）， and to analyze the mechanism of moxibustion in the treatment of IBS-D.? Methods? 48 SPF male SD rats were randomly divided into normal group， model group，

mild moxibustion group and western medicine group， with 12 rats in each group. After acetic acid enema， the IBS-D rat model was reproduced by restraint stimulation for one hour a day and two weeks. After successful modeling， acupuncture points were divided into two groups in mild moxibustion group： group Ⅰ selected “Ganshu” （BL18）， “Pishu” （BL20） and “Zusanli” （ST36）， and group Ⅱ selected “Zhangmen” （LR13）， “Qimen” （LA14） and “Zusanli” （ST36）. Group Ⅰ and group Ⅱ were treated with moxibustion alternately every other day for 15 minutes each time for two weeks. The western medicine group was given piveronium bromide tablets （10 mL/kg）， once a day for two weeks. The general behavior， visceral sensitivity， fecal water content and colon pathology were observed before and after treatment. The content of 5-HT in colon tissue was detected by ELISA. The expression of 5-HT3R in colon was detected by Western blot. Results The rats in the normal group had good spirit and activity and sensitive response; the rats in the model group had poor spirit and activity and slow response; compared with the model group， the general behavior of rats in mild moxibustion group and western medicine group were improved. The colonic morphology of rats in each group was normal， without obvious histopathological changes such as congestion， edema， ulcer and inflammatory cell infiltration. Compared with the normal group， the visceral sensitivity of the model group was higher （P<0.01）; compared with the model group， the visceral sensitivity of rats in mild moxibustion group and western medicine group decreased （P<0.01）. Compared with the normal group， the fecal water content in the model group increased （P<0.01）; compared with the model group， the water content of stool in mild moxibustion

group and western medicine group decreased significantly （P<0.01）. Compared with the normal group， the expression levels of 5-HT and 5-HT3R in the colon of the model group increased （P<0.05， P<0.01）; compared with the model group， the expression levels of 5-HT and 5-HT3R in colon tissue of mild moxibustion group and western medicine group decreased （P<0.05， P<0.01）. Conclusion Moxibustion can effectively improve diarrhea symptoms and visceral hypersensitivity in IBS-D rats， which may be related to moxibustion regulating the expression of 5-HT and its receptor in colon tissue.

〔Keywords〕 moxibustion; irritable bowel syndrome; 5-hydroxytryptamine; 5-hydroxytryptamine 3 receptor; visceral sensitivity

腸易激綜合征（irritable bowel syndrome， IBS）是臨床上一種常見(jiàn)的功能紊亂的腸道疾病，在我國(guó)以腹瀉型腸易激綜合征（diarrhea predominant irritable bowel syndrome， IBS-D）發(fā)病率最高[1-2]。IBS的發(fā)病機(jī)制可能與腸道動(dòng)力及感覺(jué)異常、急性腸道感染引發(fā)的炎癥、免疫功能異常、腸道菌群改變、精神與心理等因素有關(guān)[3]。5羥色胺（5-hydroxytryptamine， 5-HT）作為一種重要的神經(jīng)遞質(zhì)，廣泛的存在于人體的各種組織與器官中，人體中約有95%的5-HT分布在于胃腸道中，與不同受體相結(jié)合產(chǎn)生相互作用，影響胃腸道的動(dòng)力、分泌及內(nèi)臟感覺(jué)等[4-7]。在5-HT各亞型受體中，與IBS-D關(guān)系密切的是5-HT3受體（5-hydroxytryptamine 3 receptor， 5-HT3R）[8-9]。近年來(lái)，中醫(yī)藥在治療IBS方面取得了良好的效果，具有不良反應(yīng)少、遠(yuǎn)期效果好的優(yōu)勢(shì)[10]，但有關(guān)艾灸對(duì)IBS-D的作用及其機(jī)制研究鮮有報(bào)道，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)艾灸治療IBS-D大鼠，檢測(cè)5-HT及5-HT3R的表達(dá)觀察其變化，探討艾灸治療IBS-D的作用機(jī)制，為指導(dǎo)臨床提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1? 動(dòng)物來(lái)源及分組

48只SPF級(jí)雄性SD大鼠，4周齡，體質(zhì)量（180±10） g，由湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供，許可證號(hào)：SCXK（湘）2016-0002。飼養(yǎng)于湖南中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，實(shí)驗(yàn)室溫度維持在21～23 ℃，濕度40%～60%。適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，將大鼠隨機(jī)分為正常組、模型組、溫和灸組、西藥組，每組12只。

1.2? 主要試劑與儀器

電子天平（型號(hào)：HLD-10002，杭州友恒稱重設(shè)備有限公司）;小動(dòng)物電子秤（型號(hào)：YP10002，上海佑科儀表有限公司）;組織病理包埋儀（型號(hào)：EG1160，德國(guó)Leica公司）;組織病理切片機(jī)（型號(hào)：RM 2135，德國(guó)Leica公司）;導(dǎo)尿管（型號(hào)：F8，揚(yáng)州市吉康醫(yī)療器械有限公司）。5-HT酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）試劑盒（批號(hào)：E-EL-0033c，武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司）;5-HT3R抗體（批號(hào)：10443-1-AP，美國(guó)Proteintech公司）;艾條（規(guī)格：5.3 mm×65 mm，50支/盒，湖南高圣生物有限公司）、匹維溴銨片[國(guó)藥準(zhǔn)字：H20160396（原H20120127），規(guī)格：50 mg/片，法國(guó)Abbott Healthcare SAS公司]等。

1.3? 模型制備及評(píng)價(jià)

參考相關(guān)文獻(xiàn)[11]，采用乙酸灌腸+束縛應(yīng)激刺激復(fù)制IBS-D大鼠模型：實(shí)驗(yàn)前24 h給造模大鼠（模型組+溫和灸組+西藥組）禁食不禁水，灌腸前用無(wú)菌棉球蘸取石蠟油潤(rùn)滑肛門及導(dǎo)管，插入肛門距離約8 cm，向肛門內(nèi)注入4%乙酸1 mL，緩慢拔出導(dǎo)尿管，用手壓迫肛門并將大鼠尾巴抬高30 s以防乙酸流出，隨即用0.01 mol/L PBS 1 mL沖洗結(jié)腸，7 d后行束縛應(yīng)激刺激，將灌腸大鼠置于自制束縛裝置中1 h，持續(xù)2周。正常組大鼠常規(guī)喂養(yǎng)，不予任何措施。

模型評(píng)價(jià)：以大鼠精神萎靡、活動(dòng)度差、反應(yīng)遲緩，內(nèi)臟敏感性降低和糞便含水量升高，與正常組之間對(duì)比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義為造模成功[12-13]。

1.4? 干預(yù)方法

1.4.1? 正常組? SD大鼠，以正常喂養(yǎng)2周，無(wú)特殊處理。

1.4.2? 模型組? 造模成功后，正常喂養(yǎng)，并予生理鹽水（10 mL/kg）灌胃，每日1次，持續(xù)時(shí)間為2周。

1.4.3? 溫和灸組? （1）取穴分組及穴位定位：Ⅰ組選肝俞、脾俞、足三里，Ⅱ組選章門、期門、足三里。穴位定位參照《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》大鼠常用針灸穴位結(jié)合擬人比照法進(jìn)行穴位定位[14]。（2）溫和灸方法：IBS-D模型大鼠，正常喂養(yǎng)，將艾條點(diǎn)燃懸于穴位上方2～3 cm艾灸，Ⅰ組、Ⅱ組穴位隔日交替施灸，每次每穴15 min，持續(xù)時(shí)間為2周。

1.4.4? 西藥組? IBS-D模型大鼠，正常喂養(yǎng)，并予匹維溴銨（10 mL/kg）灌胃，每日1次，持續(xù)時(shí)間為2周。

1.5? 指標(biāo)檢測(cè)及標(biāo)本采集

1.5.1? 一般行為學(xué)觀察? 觀察大鼠的精神狀態(tài)、飲食情況、皮膚毛發(fā)的順滑度以及活動(dòng)狀態(tài)。

1.5.2? 內(nèi)臟敏感性測(cè)試? 采用腹壁回撤反射（abdominal withdrawal reflex， AWR）評(píng)分為3時(shí)（腹部以及背腰部的肌肉群強(qiáng)烈收縮，腹部開始離開地表面）的注水量測(cè)定[15]。測(cè)試AWR評(píng)分之前，限制其食物攝入（不限制飲水），于大鼠清醒狀態(tài)下導(dǎo)尿管從肛門口往里插入大約8 cm，為方便進(jìn)入，先用石蠟油將其潤(rùn)滑，再將其與大鼠尾部相固定，以防止活動(dòng)時(shí)脫出。接著將大鼠放入制備的透明度高的固定盒中以便觀察其活動(dòng)情況，此固定盒的設(shè)置只允許大鼠前后走動(dòng)，但限制其身體轉(zhuǎn)動(dòng)，待其處于一個(gè)絕對(duì)的平靜期時(shí)開始注入水，注水的同時(shí)需密切觀察大鼠反應(yīng)情況，并記錄AWR評(píng)分為3分的注水量，維持30 s，反復(fù)操作3次，每次操作間隔4 min，再取測(cè)量的均值。

1.5.3? 糞便含水量測(cè)定? 收集各組大鼠24 h糞便，用天平測(cè)定出的重量即為大便的濕重，接著將大便置于烘干箱干燥，即為糞便的干重。糞便的濕重減去糞便的干重所得的值，與大便濕重的比值則是糞便的含水量[16]。

1.5.4? 結(jié)腸組織形態(tài)病理觀察? 腹腔注射10%（3 mL/kg）水合氯醛麻醉，處死，取用生理鹽水洗滌腸內(nèi)容物后，在8 cm結(jié)腸處取3片約1 cm×1 cm的樣品，并置于10%福爾馬林中24 h。然后常規(guī)脫水，石蠟包埋，HE染色，光學(xué)顯微鏡下觀察大鼠結(jié)腸黏膜病理組織學(xué)改變。

1.5.5? 酶聯(lián)免疫法檢測(cè)結(jié)腸5-HT的表達(dá)? 應(yīng)用酶聯(lián)免疫法（euzyme linked immuno sorbrnt assay， ELISA）測(cè)定大鼠結(jié)腸中5-HT的含量，具體方法參照ELISA試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。測(cè)定前先分別提取大鼠結(jié)腸組織蛋白，用BCA法進(jìn)行蛋白定量[17]。

1.5.6? WB檢測(cè)結(jié)腸5-HT3R的表達(dá)? 抽提30 μg組織蛋白樣品，BCA法將蛋白定量，將獲得的蛋白質(zhì)樣品通過(guò)SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，并通過(guò)轉(zhuǎn)移電泳將凝膠上分離到的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)印至固相支持物PVDF膜上，用抗靶蛋白的非標(biāo)記抗體（一抗）與轉(zhuǎn)印后膜上的靶蛋白進(jìn)行特異性結(jié)合，再與經(jīng)辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記（偶聯(lián)）的二抗結(jié)合，最后用ECL超敏發(fā)光液試劑檢測(cè)。

1.6? 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。數(shù)據(jù)均采用“x±s”表示，多組間比較采用單因素方差分析，方差齊用LSD分析，方差不齊用Dunnet T3分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1? 各組大鼠一般行為學(xué)變化

實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，正常組大鼠精神狀態(tài)好，活潑好動(dòng)，反應(yīng)靈敏，皮毛有光澤;模型組大鼠精神萎靡，活動(dòng)度差，反應(yīng)遲緩，皮毛缺乏光澤;與模型組相比，溫和灸組、西藥組大鼠精神、活動(dòng)度、皮毛光澤度等方面均有所改善。

2.2? 各組大鼠內(nèi)臟敏感性、糞便含水量變化

與正常組相比，模型組大鼠的內(nèi)臟敏感性增高（AWR評(píng)分為3分時(shí)的注水量降低）（P<0.01）;與模型組比較，溫和灸組、西藥組大鼠內(nèi)臟敏感性降低（AWR評(píng)分為3分時(shí)的注水量升高）（P<0.01）。與正常組比較，模型組糞便含水量顯著增加（P<0.01）;與模型組比較，溫和灸組、西藥組大鼠糞便含水量顯著下降（P<0.01）。見(jiàn)表1。

2.3? 各組大鼠結(jié)腸病理切片檢測(cè)

各組大鼠結(jié)腸組織結(jié)構(gòu)正常，黏膜上皮完整，無(wú)明顯充血水腫、潰瘍和炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)等病理組織學(xué)改變，這與IBS-D為一種功能性胃腸疾病有關(guān)，提示IBS-D為一種功能性胃腸道疾病。見(jiàn)圖1。

2.4? 各組大鼠結(jié)腸中5-HT及5-HT3R表達(dá)的變化

與正常組相比，模型組大鼠結(jié)腸的5-HT、5-HT3R含量升高（P<0.05，P<0.01）;與模型組相比，溫和灸組、西藥組大鼠結(jié)腸5-HT、5-HT3R含量下降（P<0.05，P<0.01）;與溫和灸組相比，西藥組大鼠結(jié)腸5-HT含量下降（P<0.01）。見(jiàn)表2。

3 討論

IBS-D屬于中醫(yī)學(xué)“腹痛”“泄瀉”等范疇[18]，其發(fā)病的根本原因主要為肝脾失調(diào)，肝木克脾土導(dǎo)致運(yùn)化失調(diào)，病理產(chǎn)物以及代謝異常導(dǎo)致氣血運(yùn)行不暢、經(jīng)脈瘀堵，最終引起腹部不適以及大便性狀改變等臨床癥狀的發(fā)生[19]。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)束縛應(yīng)激刺激以及乙酸灌腸復(fù)制肝郁脾虛模型，根據(jù)大鼠的情緒變化、糞便含水量以及內(nèi)臟敏感性證實(shí)造模成功。研究表明[20-24]，中醫(yī)藥對(duì)IBS-D的治療效果顯著，本實(shí)驗(yàn)基于疏肝健脾、利濕止瀉的治療原則，以及“合治內(nèi)府”“俞募配穴”的配穴原則，選擇艾灸作為治療手段，選擇肝俞、脾俞、足三里、章門、期門諸穴進(jìn)行治療，結(jié)果提示艾灸可以有效治療IBS-D。

腸道動(dòng)力異常及內(nèi)臟高敏感是IBS的主要病理學(xué)基礎(chǔ)[17]，5-HT作為自體活性物質(zhì)，是一種參與胃腸道活動(dòng)的腦腸肽，廣泛存在于中樞神經(jīng)系統(tǒng)和胃腸道，具有許多生物學(xué)功能，如參與心理和神經(jīng)功能的調(diào)節(jié)[25]。當(dāng)機(jī)體受到刺激時(shí)，腸嗜鉻細(xì)胞分泌大量的5-HT，5-HT與腸黏膜上的5-HT受體相結(jié)合，即可引起腸道運(yùn)動(dòng)發(fā)生異常改變，導(dǎo)致腹痛、腹瀉等發(fā)生。唐紅梅等[26]采用母子分離聯(lián)合醋酸刺激和束縛應(yīng)激成功制備IBS-D大鼠模型，檢測(cè)大鼠結(jié)腸組織中5-HT蛋白的表達(dá)，證實(shí)IBS-D大鼠結(jié)腸中5-HT含量的增高可導(dǎo)致腸道內(nèi)臟高敏感，也會(huì)引起腹瀉。王迎寒等[27]研究顯示，降低大鼠5-HT含量可以達(dá)到改善IBS-D大鼠腹痛、腹瀉等癥狀。

在5-HT的諸多受體中，胃腸道感覺(jué)和運(yùn)動(dòng)關(guān)系最為密切的受體是5-HT3R，5-HT3R可同時(shí)調(diào)節(jié)興奮性和抑制性神經(jīng)傳導(dǎo)物質(zhì)的傳遞[28-29]。當(dāng)5-HT與5-HT3R結(jié)合時(shí)，可以增加細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度并刺激中樞和外周神經(jīng)元的興奮性，促進(jìn)神經(jīng)遞質(zhì)的釋放，引起乙酰膽堿增多，從而導(dǎo)致脘腹部疼痛不適以及內(nèi)臟高敏感性等[30-31]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，較正常組相比，模型組大鼠結(jié)腸組織的5-HT與5-HT3R表達(dá)量升高（P<0.01，P<0.05），考慮是由于造模成功，大鼠結(jié)腸黏膜5-HT含量改變，并與5-HT3R相結(jié)合，二者共同作用導(dǎo)致大鼠情緒變化、腸道敏感以及腸道運(yùn)動(dòng)失常。此外，模型組大鼠一般情況、結(jié)腸病理的變化以及內(nèi)臟敏感性、糞便含水量的變化均提示造模成功。與模型組相比，溫和灸組、西藥組均可以有效降低IBS-D大鼠內(nèi)臟敏感性、糞便含水量、5-HT含量以及5-HT3R含量，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05，P<0.01）。

綜上，基于艾灸可以有效治療IBS-D，以及5-HT及其受體在中樞系統(tǒng)和胃腸道系統(tǒng)中扮演的重要角色，考慮艾灸治療IBS-D的作用機(jī)制在于調(diào)節(jié)腦-腸軸通路上重要元件的表達(dá)，下一步研究可以增加艾灸對(duì)IBS-D大鼠腦內(nèi)如下丘腦、海馬等組織中5-HT及受體表達(dá)的檢測(cè)。

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