骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞治療激素性股骨頭壞死的分子機(jī)制與大豆異黃酮的調(diào)節(jié)作用

張立巖，孫 新，徐曉蕾，李 巖，王 強(qiáng)，詹東銘，朱家博，聶 影，張雪峰

(1.北華大學(xué)附屬醫(yī)院，吉林 吉林 132011；2.吉林醫(yī)藥學(xué)院藥學(xué)院，吉林 吉林 132013；3.北華大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，吉林 吉林 132013；4.吉林市中心醫(yī)院，吉林 吉林 132011)

隨著現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的飛速發(fā)展，激素類藥物成為一種臨床應(yīng)用廣泛、治療效果較好的藥物.激素類藥物使患者獲益的同時(shí)，也帶來了不少問題，如發(fā)生激素性股骨頭壞死(steroid-induced osteonecrosis of the femoral head，SONFH).激素性股骨頭壞死是由于患者長期或大劑量使用激素類藥物，導(dǎo)致股骨頭供血減少，進(jìn)而導(dǎo)致股骨頭結(jié)構(gòu)改變，影響關(guān)節(jié)功能.SONFH是一種進(jìn)展性疾病，隨著病情不斷發(fā)展，患者股骨頭會(huì)出現(xiàn)結(jié)構(gòu)塌陷和關(guān)節(jié)障礙.由于修復(fù)壞死組織的困難及高致殘率，SONFH在醫(yī)學(xué)界得到了廣泛關(guān)注.臨床上對于股骨頭壞死分為手術(shù)治療和保髖治療.保髖治療主要適用于股骨頭壞死早期及股骨頭尚未塌陷或塌陷不明顯階段.近年來，隨著精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)的發(fā)展以及干細(xì)胞和分子生物學(xué)的深入研究，使用骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)治療SONFH已經(jīng)成為基礎(chǔ)試驗(yàn)和臨床早期干預(yù)治療研究的熱點(diǎn)，但是目前促進(jìn)BMSCs向成骨、成軟骨分化的調(diào)控機(jī)制尚不清楚，因此，本研究主要探討大豆異黃酮調(diào)節(jié)BMSCs分化對治療SONFH的作用，為臨床治療SONFH提供參考.

1 SONFH的發(fā)病機(jī)制

目前，SONFH的具體發(fā)病機(jī)制尚不清楚，認(rèn)為是多種因素共同作用的結(jié)果.20世紀(jì)70年代，有學(xué)者[1]提出彌散性血管內(nèi)凝血理論，在一些SONFH患者的股骨頭病理檢查中發(fā)現(xiàn)血管內(nèi)有血栓形成，并發(fā)現(xiàn)肝素有抑制SONFH的發(fā)生和發(fā)展的作用.還有學(xué)者[2]提出關(guān)于激素性股骨頭壞死的炎癥和細(xì)胞凋亡理論.糖皮質(zhì)激素可通過TLR4信號通路干擾免疫應(yīng)答，誘導(dǎo)SONFH，提示免疫應(yīng)答的破壞在SONFH發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮作用.目前，多數(shù)學(xué)者普遍認(rèn)為SONFH發(fā)病機(jī)制學(xué)說主要有以下幾種：脂質(zhì)代謝紊亂及骨內(nèi)壓增高學(xué)說；血管內(nèi)凝血與血管損傷學(xué)說；骨細(xì)胞凋亡學(xué)說；基因控制學(xué)說[3].越來越多的證據(jù)表明：BMSCs成骨和成脂分化能力的不平衡是造成SONFH的主要原因，糖皮質(zhì)激素可通過激活或抑制成骨和成脂細(xì)胞相關(guān)調(diào)控基因的表達(dá)來調(diào)節(jié)BMSCs的分化.但由于患者長期或大劑量應(yīng)用激素類藥物，促進(jìn)BMSCs向成脂肪細(xì)胞分化，促進(jìn)成骨細(xì)胞和骨細(xì)胞凋亡，增加了破骨細(xì)胞的數(shù)量，使BMSCs的數(shù)量難以提供足夠的成骨細(xì)胞來滿足骨重塑，最終導(dǎo)致骨壞死[4].另一方面，BMSCs向成脂細(xì)胞分化后，致使骨髓腔內(nèi)脂肪細(xì)胞數(shù)量增多，體積增大，造血細(xì)胞數(shù)量減少；脂肪細(xì)胞堆積引起骨髓腔內(nèi)壓增高，髓腔內(nèi)血管受到擠壓，股骨頭靜脈回流受阻，血液瘀滯，血管栓塞，最終導(dǎo)致細(xì)胞組織供氧不足，細(xì)胞功能出現(xiàn)障礙，從而導(dǎo)致股骨頭壞死的惡性循環(huán)[5].

2 調(diào)控BMSCs分化的細(xì)胞通路

2.1 Wnt/β-catenin 信號通路

Wnt信號傳導(dǎo)途徑是由配體蛋白質(zhì)Wnt和膜蛋白受體結(jié)合激發(fā)的一組多下游通道的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，Wnt信號通路參與了人的發(fā)育、生長和疾病發(fā)生的多種過程.Wnt/β-catenin信號通路(Canonical Wnt/β-catenin pathway)是由Wnt家族分泌蛋白、Frizzled家族跨膜受體蛋白Dishevelled(Dsh)、糖原合成激酶3(GSK3)、APC、Axin、β-連環(huán)蛋白及TCF/LEF家族轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子等構(gòu)成.Wnt/β-catenin 信號通路是Wnt 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中的一條重要通路，可通過多種機(jī)制作用于骨形成過程，如促進(jìn)BMSCs和成骨細(xì)胞的增殖、誘導(dǎo)BMSCs向成骨細(xì)胞分化、抑制成骨細(xì)胞凋亡和骨細(xì)胞凋亡等[6].LONG等[7]研究發(fā)現(xiàn)：MIR-139-5p通過直接靶向Wnt/b-catenin途徑的關(guān)鍵因子CTNNB1和FZD4，在Wnt/b-catenin途徑發(fā)揮其在BMSCs成骨中的作用，抑制miR-139-5p可顯著促進(jìn)BMSCs向成骨細(xì)胞分化，而過表達(dá)miR-139-5p則會(huì)降低BMSCs向成骨細(xì)胞分化.WANG等[8]通過構(gòu)建了包含hApN基因的重組腺病毒，然后將該腺病毒體外轉(zhuǎn)染到BMSCs中，證明脂聯(lián)素ApN直接作用于BMSCs.脂聯(lián)素ApN通過Wnt/β-catenin途徑促進(jìn)BMSCs成骨分化和骨形成.SHI等[9]研究表明：血管活性腸肽(VIP)可通過Wnt/β-catenin信號通路促使大鼠BMSCs向成骨細(xì)胞分化，增強(qiáng)大鼠BMSCs成骨分化過程中血管生成標(biāo)志物VEGF的表達(dá)，通過促進(jìn)血管生成而促進(jìn)體內(nèi)成骨分化.

2.2 PPARγ 信號通路

過氧化物酶體增殖物激活型受體(peroxis- omeproliferator-activated receptor，PPARγ)是一種配體激活的核受體，是核激素受體超家族的成員，在BMSCs分化階段能促進(jìn)BMSCs向脂肪細(xì)胞分化，并抑制BMSCs向成骨細(xì)胞分化.KONG等[10]研究發(fā)現(xiàn)：中藥活骨方可以通過PPARγ信號通路調(diào)節(jié)脂代謝，抑制PPARγ表達(dá)，進(jìn)而減少BMSCs 向脂肪細(xì)胞的分化，增加向成骨細(xì)胞分化，從而阻止小鼠發(fā)生骨壞死.LI等[11]研究表明：丹酚酸 B可以抑制大鼠模型中PPARγ的表達(dá)，增加Ⅰ型膠原蛋白的表達(dá)，從而減少BMSCs向脂肪細(xì)胞的分化，阻止大鼠模型發(fā)生SONFH.

2.3 PI3K-AKT-mTOR信號通路

磷脂肌醇3-激酶(pho-sphati-dylinositol 3-kinase，PI3K)/蛋白激酶B(protein kinase B，AKT)/哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)是生物體內(nèi)較為重要的信號通路，作用于調(diào)控細(xì)胞增生、代謝、分化、凋亡和血管生成等過程.ZHAO等[12]證明了在BMSCs分化階段，益母草堿通過PI3K/Akt/mTOR途徑激活了BMSCs的自噬，并增加了自噬相關(guān)蛋白的表達(dá)，促進(jìn)BMSCs向成骨細(xì)胞分化.LUO等[13]發(fā)現(xiàn)淫羊藿苷Ⅱ(ICS Ⅱ)通過PI3K/AKT/mTOR/S6K1信號通路促進(jìn)了BMSCs的增殖，抑制了堿性磷酸酶(ALP)的活性，能夠顯著增加成骨蛋白/基因的表達(dá)，提高Akt和S6K1的磷酸化水平，減弱p-Akt、p-S6K1和成骨蛋白/基因的表達(dá)，促進(jìn)犬BMSCs的成骨分化.

2.4 TGF-βSmad 信號通路

轉(zhuǎn)化生長因子 β(transforming growth factor-β，TGF-β) 是一種多功能細(xì)胞因子，在正常發(fā)育和體內(nèi)平衡中具有重要作用，可通過促進(jìn)BMSCs的增殖、向成骨細(xì)胞分化和生成骨基質(zhì)等促進(jìn)骨形成.LIU等[14]研究表明：含鍶α-半水硫酸鈣(Sr-CaS)在體外和體內(nèi)均可通過TGF-β/Smad2/3分子信號通路促進(jìn)BMSCs的成骨分化，且隨著Sr濃度的增加而增強(qiáng).Sr-CaS還可上調(diào)TGF-β、Smad2/3和β-catenin的表達(dá)，隨著Sr含量的增加而增強(qiáng).HU等[15]研究表明：MOTS-c能夠通過TGF-β/Smad途徑促進(jìn)BMSCs向成骨細(xì)胞分化，MOTS-c可以上調(diào)ALP、BGLAP和Runx2的表達(dá)水平，并提高BMSCs的成骨能力.

3 骨代謝基因在調(diào)控BMSCs分化中的作用

3.1 Runx2

Runx2屬于轉(zhuǎn)錄因子家族，是Runx家族的重要成員，使BMSCs只向成骨細(xì)胞或軟骨細(xì)胞分化，并能夠促進(jìn)成骨細(xì)胞成熟，在成骨細(xì)胞分化過程中起重要作用.KOMORI T等[16]研究顯示：激素能夠下調(diào)BMSCs中 Runx2蛋白的表達(dá)，促進(jìn)BMSCs向成脂方向分化.Runx2、SP7和Wnt信號相互調(diào)節(jié)，引導(dǎo)BMSCs向成骨細(xì)胞分化，從而抑制脂肪細(xì)胞和軟骨細(xì)胞的分化.LI等[17]研究顯示：蘆薈蛋白通過激活ERK1/2-Runx2信號通路促進(jìn)BMSC的成骨分化，用信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制劑PD98059(ERK1/2)處理BMSC可有效減弱這些細(xì)胞中Runx2的激活，并抑制成骨細(xì)胞分化.

3.2 Osterix

Osterix是成骨細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)錄因子，屬于SP1轉(zhuǎn)錄家族成員，可在成骨細(xì)胞分化為成熟成骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞的過程中激活基因庫，在成骨細(xì)胞生成、分化和骨形成過程中具有至關(guān)重要的作用.LIU等[18]研究發(fā)現(xiàn)：miR-96通過靶向osterix來調(diào)節(jié)成骨作用，miR-96的過表達(dá)減少了BMSCs的成骨分化，而miR-96的抑制作用則增加了BMSCs的成骨分化.LAI等[19]研究表明：Nell-1通過正反饋激活了Runx2和Osterix，并提高了Runx2的磷酸化水平，促進(jìn)BMSCs的成骨分化.隨著時(shí)間的延長，Runx2可進(jìn)一步上調(diào)Osterix的表達(dá)，從而促進(jìn)成骨細(xì)胞的分化和成熟.

4 大豆異黃酮的生物學(xué)特性和功能

大豆異黃酮(Soybean Isoflavone，SI)是大豆生長過程中形成的一類次生代謝產(chǎn)物，因其分子結(jié)構(gòu)與雌激素相類似，是一種具有雌激素樣作用且對人體有益的天然活性物質(zhì)，故又稱之為植物雌激素(phy-toestrogen)[20].大豆中天然存在的SI總共有12 種，可以分為3 類，即黃豆苷類(Daidzin groups)、染料木苷類(Genistin groups)、黃豆黃素苷類(Glycitin groups)，每類以游離型、葡萄糖苷型、乙?；咸烟擒招汀⒈；咸烟擒招偷?種形式存在[21].其中，染料木黃酮(Genistein)和黃豆黃苷(Glycitein)是游離型苷元中最主要的2種成分.從20世紀(jì)80年代起，很多研究[22-23]及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明SI具有多種生物學(xué)活性.KANG N H等[24]通過研究SI對前列腺癌細(xì)胞進(jìn)程的影響，認(rèn)為SI可通過(ER)β途徑調(diào)節(jié)控制細(xì)胞周期和細(xì)胞存活的基因表達(dá)，進(jìn)而對細(xì)胞周期的G2期和M期產(chǎn)生抑制作用，使癌細(xì)胞周期停滯，促進(jìn)癌細(xì)胞凋亡.研究[24]表明：胰島素樣生長因子-1(IGF-1)的水平升高可增加罹患癌癥的風(fēng)險(xiǎn)，LEE J等[25]發(fā)現(xiàn)SI可通過減弱IGF-1誘導(dǎo)的β-catenin信號傳導(dǎo)有效抑制IGF-1刺激癌細(xì)胞的生長.SI對骨質(zhì)疏松也具有積極的預(yù)防和治療作用，SI能夠調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞[26]、成骨細(xì)胞及骨細(xì)胞[27]之間的動(dòng)態(tài)平衡.骨質(zhì)疏松癥(osteoporosis，OP)是一種因破骨細(xì)胞介導(dǎo)的骨再吸收多于成骨細(xì)胞介導(dǎo)的骨形成，以骨強(qiáng)度減弱、易發(fā)生骨折為特征的全身代謝性骨病.SI可通過調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞和調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞及骨細(xì)胞間的動(dòng)態(tài)平衡過程，預(yù)防和治療骨質(zhì)疏松.有研究[28]發(fā)現(xiàn)：SI還對心血管健康有積極作用，具有改善血管內(nèi)皮細(xì)胞功能、抗血小板聚集等作用；還有研究[29-31]發(fā)現(xiàn)：SI對于改善AD患者癥狀有積極意義，SI具有抗氧化應(yīng)激、抗神經(jīng)毒性物質(zhì)損傷、促進(jìn)神經(jīng)營養(yǎng)因子表達(dá)、保護(hù)血腦屏障、降低炎性反應(yīng)作用.SI多樣而突出的生物學(xué)活性引起了國內(nèi)外研究者的廣泛關(guān)注，特別是對骨質(zhì)疏松有積極的預(yù)防和治療作用.

5 大豆異黃酮調(diào)節(jié)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化的作用機(jī)制

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)在不同體位環(huán)境誘導(dǎo)下，能實(shí)現(xiàn)多向分化，其結(jié)果是分化為成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、肌細(xì)胞等多種細(xì)胞.如果分化誘導(dǎo)的條件發(fā)生改變，也可誘導(dǎo)定向分化體系的變化.隨著對SI的研究深入，SI的促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化和抑制破骨細(xì)胞分化及功能作用備受關(guān)注.如今人們已經(jīng)認(rèn)識到大豆異黃酮在不引發(fā)副作用的情況下對骨骼重塑具有積極作用[32].ZHANG等[33]研究發(fā)現(xiàn)：決定BMSCs向成脂肪細(xì)胞、成骨細(xì)胞分化的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子是PPARγ(成脂轉(zhuǎn)錄因子)，SI可通過抑制BMSCs中的PPARγ表達(dá)，增強(qiáng)Runx2(成骨轉(zhuǎn)錄因子)的表達(dá)，促進(jìn)BMSCs成骨分化，減少脂肪細(xì)胞生成.與TNF受體有關(guān)的蛋白質(zhì)RANKL(破骨細(xì)胞分化因子)和OPG(骨保護(hù)素)比率的動(dòng)態(tài)平衡在介導(dǎo)破骨細(xì)胞分化中起重要作用.CHEN等[34]發(fā)現(xiàn)：SI主要通過激活MAPK/NF-κB/AP-1而誘導(dǎo)ERα基因表達(dá)，調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)OPG、RANKL、RANK等蛋白之間比率平衡，通過抑制M-CSF等途徑抑制破骨細(xì)胞骨吸收，調(diào)節(jié)骨代謝.BATEMAN M E等[35]認(rèn)為，SI可通過ER途徑使ASC(脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞)中的RUNX2和c-FOS表達(dá)增強(qiáng)，上調(diào)BMSCs中的LXRα、LXRβ、ABCA1、ABCA2、ABCG1和APOA1的基因表達(dá)，誘導(dǎo)ASC和BMSCs成骨.還有研究[36]表明：SI既可增加骨礦化所需的細(xì)胞外基質(zhì)蛋白o(hù)steocalcin的表達(dá)，又可利用雌激素分子傳導(dǎo)途徑誘導(dǎo)成骨途徑，在BMSCs分化的初始階段和終末階段都具有刺激成骨細(xì)胞成骨特性的能力.

綜上所述，SONFH的發(fā)病機(jī)制尚未完全清楚，也可能是多種機(jī)制共同作用的結(jié)果.隨著精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)和干細(xì)胞、分子生物學(xué)研究的發(fā)展，探索SONFH的發(fā)病機(jī)制成為可能.研究SONFH的發(fā)病機(jī)制不僅有助于揭示該疾病的過程，還可以幫助篩查高危人群，采取預(yù)防和干預(yù)措施，最大限度地減少激素類藥物治療的副作用.目前，BMSCs治療SONFH已經(jīng)取得良好效果，但還需要不斷的基礎(chǔ)研究和大量的臨床試驗(yàn)來完善治療技術(shù)和方法.SI在促進(jìn)成骨細(xì)胞分化、抑制破骨細(xì)胞生成方面具有積極作用，有望成為利用BMSCs治療SONFH的新方向.相信隨著現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的不斷發(fā)展和醫(yī)學(xué)工作者的不懈努力，利用SI調(diào)節(jié)BMSCs的分化對治療SONFH會(huì)有突破性進(jìn)展，為SONFH患者的保髖治療帶來福音.