miR-29c調(diào)節(jié)DNMT3A表達對乳腺癌細胞Sk-Br-3生長的影響

劉麗梅，惠赫童，范馨元，王添琦，汪洺卉，夏 薇

(北華大學醫(yī)學技術(shù)學院，吉林 吉林 132013)

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，死亡率高.目前，我國乳腺癌的發(fā)病率呈逐年上升趨勢，乳腺癌的發(fā)生發(fā)展涉及遺傳與表觀遺傳等多種影響因素.我們的前期研究[1]發(fā)現(xiàn)：DNA甲基轉(zhuǎn)移酶3B(DNA methyltransferase，DNMT3B)的改變會通過影響基因組的甲基化水平影響miRNA的表達.而miRNA作為機體內(nèi)所產(chǎn)生的一類非編碼RNA，同樣具有調(diào)節(jié)基因表達的功能，成熟的miRNA可以與靶基因mRNA3′端非編碼區(qū)完全或不完全配對結(jié)合，影響相關(guān)基因的表達，進而影響細胞生長[2].因此，miRNA及DNA甲基化之間存在著復(fù)雜的相互調(diào)控關(guān)系，在很多癌變組織中DNMT的表達都顯示異常.為此，我們檢測了乳腺癌患者癌組織及癌旁正常乳腺組織中DNA甲基轉(zhuǎn)移酶的表達情況，并通過生物信息學軟件預(yù)測了可與DNA甲基轉(zhuǎn)移酶DNMT3A基因的mRNA結(jié)合的miRNA情況；同時采用細胞轉(zhuǎn)染的方法，將人工合成的miRNA模擬體轉(zhuǎn)染乳腺癌細胞中，考察其對DNMT3A表達的影響及其對乳腺癌細胞生長的影響，以探討miRNA對DNMT3A的影響在乳腺癌發(fā)生發(fā)展中的作用，從而為乳腺癌的早期診斷、早期預(yù)防提供新的分子標志及治療靶點.

1 材料與方法

1.1 研究材料

收集2017年8月—2018年7月吉林市中心醫(yī)院乳腺外科10例乳腺癌患者的乳腺癌組織與癌旁組織，其中，乳腺導(dǎo)管癌5例，乳腺黏液癌5例.同時收集5例乳腺纖維瘤患者乳腺纖維瘤組織，均在患者知情同意情況下由吉林市中心醫(yī)院乳腺外科醫(yī)生采集病理組織，置于潔凈的1.5 mL凍存管中，-80 ℃保存?zhèn)溆?人乳腺癌細胞系Sk-Br-3來源于中科院上海細胞庫.

1.2 方 法

1.2.1 組織與細胞總RNA提取及DNA甲基轉(zhuǎn)移酶檢測

組織與細胞總RNA的提取使用組織RNA提取試劑盒Qiazol(Qiagen公司，德國)，并按照說明書進行提取，將收集到的總RNA用反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Takara公司，中國)按照說明書進行反轉(zhuǎn)錄.應(yīng)用熒光定量PCR儀 (Thermo scientific PikoReal24)進行實時熒光定量PCR，以β-ACTIN為內(nèi)參，檢測DNA甲基轉(zhuǎn)移酶DNMT1、DNMT3A與DNMT3B的相對表達量，引物序列見表1.擴增體系：SYBRGreen Premix(2×) 12.5 μL，上游引物(10 μmol/L) 0.5 μL，下游引物(10 μmol/L)0.5 μL，cDNA 1 μL，ddH2O 10.5 μL，共25 μL；擴增反應(yīng)條件為95 ℃ 300 s預(yù)變性，擴增 40個循環(huán)，95 ℃變性5 s，52～56 ℃復(fù)性30 s，72 ℃延伸30 s；進行熒光信號采集，之后加載溶解曲線程序.

表1 引物序列Tab.1 Sequences of primers

1.2.2 miRNA模擬體的構(gòu)建與轉(zhuǎn)染

根據(jù)Targetscan軟件分析結(jié)果選擇可以與DNMT3A基因mRNA結(jié)合的MiRNA設(shè)計模擬體，序列送至上海吉瑪生物技術(shù)有限公司合成，帶有FAM標記的單鏈miR200c、miR-29b、miR-29c模擬體及其陰性對照.序列見表2.取對數(shù)生長期Sk-Br-3細胞，計數(shù)并調(diào)整細胞濃度為1×105個/mL，每孔1 mL，接種于24孔板中，待細胞貼壁后，次日進行轉(zhuǎn)染.轉(zhuǎn)染后，將細胞設(shè)空白對照組、陰性對照組、miR-200c模擬體組、miR-29b模擬體組與miR-29c模擬體組.用100 μL無血清培養(yǎng)基稀釋80 ng miRNA模擬體及陰性對照，各加入3 μL HiPerFect Transfection Reagent轉(zhuǎn)染試劑(Qiagen公司，德國)，混勻，室溫靜止10 min，分別加至各組細胞中.轉(zhuǎn)染24 h后，再加入Hoechst 33258避光染色10 min，用PBS清洗兩次后在熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染情況，計算轉(zhuǎn)染效率.同樣方法進行細胞轉(zhuǎn)染，用于RNA及DNA提取，備用.

表2 模擬體序列Tab.2 Sequences of mimics

1.2.3 miRNA模擬體轉(zhuǎn)染后細胞生長情況檢測

將篩選后有效的miRNA 模擬體轉(zhuǎn)染乳腺癌細胞中，分別于0、1、2、3、4、5 d消化細胞，制成細胞懸液，進行細胞計數(shù).低倍鏡下計數(shù)四角四個大方格內(nèi)的細胞數(shù)，計算細胞濃度，以時間為橫坐標，細胞數(shù)為縱坐標繪制細胞生長曲線.實驗進行3次.

1.2.4 免疫印跡分析miRNA模擬體轉(zhuǎn)染Sk-Br-3細胞后DNMT3A表達

miRNA模擬體轉(zhuǎn)染細胞96 h后，提取各組細胞總蛋白，蛋白濃度一致后行SDS電泳，轉(zhuǎn)膜后，用5%的脫脂奶4 ℃封閉過夜.將封閉好的膜置于配好的一抗中孵育，內(nèi)參選用GAPDH(博士德公司，中國)一抗1∶400稀釋，DNMT3A一抗(Santa Cruz公司，美國)1∶6 000稀釋，室溫孵育2 h，用PBS-T清洗4次，15 min/次.然后加入二抗孵育，內(nèi)參選用GAPDH(博士德公司，中國)1∶4 000稀釋，DNMT3A(博士德公司，中國)1∶5 000稀釋，室溫孵育40 min.用PBS-T洗兩次，10 min/次，再用PBS平衡10 min，進行曝光，將膠片進行掃描拍照.

1.2.5 雙熒光素酶報告基因的構(gòu)建與檢測

為進一步確定miRNA模擬體對甲基轉(zhuǎn)移酶DNMT3A轉(zhuǎn)錄后修飾的作用，將DNMT3A與miRNA模擬體處結(jié)合序列交由上海吉瑪生物技術(shù)有限公司合成，并克隆入雙熒光素酶報告基因GP-miRGLO載體中，按HiPerFect Transfection Reagent轉(zhuǎn)染試劑(Qiagen公司，德國)說明書將報告基因GP-miRGLO載體及miRNA 模擬體進行雙轉(zhuǎn)染，每組設(shè)置6復(fù)孔.轉(zhuǎn)染24 h后，更換新鮮配制的含10%血清的完全培養(yǎng)基.轉(zhuǎn)染48 h后，棄去培養(yǎng)基，用雙熒光素酶檢測試劑盒(Promega公司，美國)中的裂解液裂解細胞，按說明書操作依次加入螢火蟲熒光素作用底物與海腎熒光素作用底物，并應(yīng)用化學發(fā)光檢測儀(Sirus公司，德國)記錄數(shù)據(jù).

1.3 統(tǒng)計學分析

2 結(jié)果與分析

2.1 乳腺癌組織DNA甲基轉(zhuǎn)移酶表達差異

分別取癌旁正常乳腺組織、乳腺囊性纖維瘤、乳腺癌患者癌組織，提取RNA，反轉(zhuǎn)錄擴增DNMT3B、DNMT3A、DNMT1的mRNA，以β-ACTINE的轉(zhuǎn)錄作為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt計算3種基因的相對表達量.與正常乳腺組織比較，乳腺浸潤性導(dǎo)管癌組織中DNMT3A及DNMT3B的相對表達量均顯著增高(P<0.05).結(jié)果見表3.

表3 乳腺正常組織及乳腺癌組織中甲基轉(zhuǎn)移酶轉(zhuǎn)錄情況Tab.3 DNA methyltransferases in tissues of breast cancer patients and healthy individuals

2.2 miRNA模擬體對DNMT3A表達的影響

針對DNMT3A設(shè)計并合成的miRNA 3種單鏈模擬體：miR-200c、miR-29b、miR-29c模擬體轉(zhuǎn)染至乳腺癌細胞Sk-Br-3，轉(zhuǎn)染72 h后，運用熒光定量PCR技術(shù)分別檢測U6、hsa-miR-200c、hsa-miR-29b、hsa-miR-29c的表達水平，轉(zhuǎn)染96 h后，運用Westen blotting檢測甲基轉(zhuǎn)移酶DNMT3A的表達情況：實驗組與內(nèi)參U6表達比較，可看出轉(zhuǎn)染72 h后hsa-miR-200c、hsa-miR-29c、hsa-miR-29b的相對表達均顯著上調(diào).見表4～6.轉(zhuǎn)染96 h后，Westen blotting結(jié)果可見轉(zhuǎn)染miR-29c模擬體細胞甲基轉(zhuǎn)移酶DNMT3A的表達顯著下調(diào)(P<0.05).見圖2、表7.提示miR-29c可與DNMT3A的mRNA結(jié)合，從而影響DNMT3A的表達.

表4 Sk-Br-3細胞轉(zhuǎn)染miRNA模擬體后hsa-miR-200c表達情況

表5 Sk-Br-3細胞轉(zhuǎn)染miRNA模擬體后hsa-miR-29b表達情況

表6 Sk-Br-3細胞轉(zhuǎn)染miRNA模擬體后hsa-miR-29c表達情況

1.空白對照組；2.陰性對照組；3.miR-200c模擬體組；4.miR-29b模擬體組；5.miR-29模擬體組.圖1 Sk-Br-3細胞轉(zhuǎn)染miRNA模擬體后DNMT3A的表達情況Fig.1Expression of DNMT3A of Sk-Br-3 cell after transfection with miRNA mimics

表7 miRNA模擬體轉(zhuǎn)染Sk-Br-3細胞后DNMT3A相對表達量

2.3 熒光素酶報告基因結(jié)果

為進一步確認miR-29c對DNMT3A的mRNA轉(zhuǎn)錄后修飾的作用，將與miR-29c所結(jié)合的序列克隆至雙熒光素酶報告基因載體GP-miRGLO中.見圖2.將其與miR-29c模擬體共轉(zhuǎn)染到乳腺癌細胞Sk-Br-3中，通過化學發(fā)光檢測儀檢測人工合成的miRNA模擬體對雙熒光素酶報告基因兩種熒光素酶表達的影響，以確認其對DNMT3A轉(zhuǎn)錄后修飾的影響.結(jié)果發(fā)現(xiàn)：與陰性對照比較，miR-29c模擬體顯著影響雙熒光素報告基因熒光的表達(P<0.05).見表8.

表8 miR-29c模擬體對雙熒光素酶報告基因的作用

2.4 miR-29c模擬體對乳腺癌細胞生長的影響

將篩選出可以明顯抑制DNMT3A表達的miR-29c模擬體轉(zhuǎn)染至乳腺癌細胞株Sk-Br-3細胞中，繪制細胞生長曲線，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：miR-29c模擬體可以明顯抑制Sk-Br-3細胞生長(P<0.05).見圖3.

圖2 雙熒光報告基因GP-miRGLO載體與DNMT3A mRNA3′端序列Fig.2The dual-luciferase reporter gene vector GP-miRGLO and the sequence of the mRNA 3′ of DNMT3A

圖3 miR-29c模擬體對乳腺癌細胞Sk-Br-3生長的影響Fig.3Effect of miR-29c mimics on growth of Sk-Br-3 cells

3 討 論

有研究[3]顯示：多種癌組織中DNA甲基轉(zhuǎn)移酶表達異常，這很可能是癌組織中DNA異常甲基化產(chǎn)生的主要原因.為此，我們檢測了乳腺癌患者的癌組織中與DNA甲基化有關(guān)的3種酶DNMT1、DNMT3A與DNMT3B的轉(zhuǎn)錄情況，結(jié)果顯示：DNMT3A與DNMT3B的轉(zhuǎn)錄水平均顯著增高.但TAVAKOLIAN S[4]的檢測發(fā)現(xiàn)：只有DNMT3B的表達顯著增高，這可能為所選取的患者乳腺癌組織類型不同所致，有研究[5]顯示：DNMT3A的表達與HER基因表達有關(guān)，因此，在接下來的實驗中我們選取HER基因表達陽性的乳腺癌細胞Sk-Br-3進行后續(xù)實驗.

已有研究[6]發(fā)現(xiàn)：多種miRNA可以反饋調(diào)節(jié)DNMT3B，從而影響腫瘤的發(fā)生發(fā)展，但影響乳腺癌中DNMT3A的miRNA研究較少，為此，我們通過Targetscan篩選了3種影響DNMT3A的miRNA，通過免疫印跡與雙熒光素酶報告基因確定miR-29c可以與DNMT3A的mRNA3′端非編碼區(qū)相結(jié)合，從而影響DNMT3A的表達.早在2012年，PLAISIER C L等[7]發(fā)現(xiàn)在非小細胞肺癌中，miR-29c的表達呈下調(diào).有研究[8]發(fā)現(xiàn)：miR-29s在肝癌細胞中表達明顯下調(diào)，并顯著抑制肝癌細胞的生長，這提示miR-29可能是一個有效的抑癌基因，可通過多種途徑發(fā)揮抑癌作用.但前期研究[9]發(fā)現(xiàn)hsa-miR-29c在乳腺癌中的表達不一，這可能與乳腺癌的類型有關(guān).AURE M R等[10]的研究發(fā)現(xiàn)：在雌激素受體簇的中心，hsa-miR-29c與DNMT3A的表達呈負相關(guān)，并且他們發(fā)現(xiàn)在浸潤前乳腺病變中hsa-miR-29c的表達已失調(diào)，推測hsa-miR-29c可能觸發(fā)雌激素受體陽性的乳腺癌早期異常DNA甲基化.由于DNMT3A的表達與HER基因的表達具有相關(guān)性，因此，對于雌激素受體陽性、HER基因表達陽性的乳腺癌患者，探討miR-29c的表達變化有重要意義.

綜上所述，在乳腺惡性導(dǎo)管癌組織中存在著DNMT3A的表達異常，而miR-29c可以通過與DNMT3A mRNA 3′端非編碼區(qū)結(jié)合影響DNMT3A的表達，從而影響HER基因陽性的乳腺癌細胞的生長.miR-29c在乳腺癌發(fā)生發(fā)展中的作用還有待于進一步研究.