刺莧提取物體外抑石作用研究*

江鳳玉，張一靜，唐靈芝，柯俊芳，陳蘭妹

（廈門(mén)醫(yī)學(xué)院，福建 廈門(mén) 361023）

刺莧（Amaranthus spinosus L.）為莧科莧屬一年生草本植物，全草入藥，性甘、涼，有清熱祛濕、散血消炎等療效[1]。因其能夠促進(jìn)膀胱的濕熱之氣向外排出，能夠消石通淋，刺莧用于治療腎結(jié)石，有較好的排石療效，且具有治療周期短、效價(jià)高、毒副作用低等優(yōu)點(diǎn)。刺莧的化學(xué)成分和相關(guān)活性研究文獻(xiàn)報(bào)道較少，目前相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道的活性主要集中在利尿、免疫、降溫[2]、傷口創(chuàng)面愈合、抗菌[3]、抗炎鎮(zhèn)痛[4]、抗氧化[5-6]等方面。

腎結(jié)石的主要組成成分草酸鈣（CaOX）存在兩種形式：一水草酸鈣（COM）和二水草酸鈣（COD），其中COM是COD的兩倍[7]。張生等[8]研究證明COD外表較圓鈍，黏附性不好，易于排出體外；而COM外表較尖銳，易黏附在損傷細(xì)胞表面形成結(jié)晶。筆者通過(guò)體外模擬實(shí)驗(yàn)，利用電子顯微鏡（EM）、傅里葉紅外光譜（FTIR）、掃描電鏡（SEM）、X射線(xiàn)衍射（XRD）等檢測(cè)方法，觀(guān)察刺莧提取物在體外是否具有抑制COM的生長(zhǎng)聚集或促使COM向COD轉(zhuǎn)化的作用，評(píng)估刺莧提取物的排石活性。

1 材料與儀器

1.1 藥材 刺莧，采自福建省漳平市和平鎮(zhèn)野外，經(jīng)廈門(mén)醫(yī)學(xué)院藥學(xué)系中藥專(zhuān)業(yè)鮑紅娟副教授鑒定為Amaranthus spinosus L.。

1.2 儀器 Alpha1-2冷凍干燥機(jī)（德國(guó)christ）；SQP十萬(wàn)分之一天平（Sartorius）；ALPHA傅里葉紅外光譜儀（德國(guó)Bruker）；FlexSEM 1000掃描電子顯微鏡（日本高新技術(shù)公司）；XRD6100 X射線(xiàn)衍射儀（日本高新技術(shù)公司）。

1.3 試劑 草酸鈉（泰坦科學(xué)股份有限公司，批號(hào)：P1571587）；無(wú)水氯化鈣（批號(hào)：2004172）、氯化鈉（批號(hào)：20170313）、無(wú)水乙酸鈉（批號(hào)：20170303）、氫氧化鈉（批號(hào)：20200826）、石油醚（60-90）（批號(hào)：2102011）、乙酸乙酯（批號(hào)：1810091）、正丁醇（批號(hào)：1809111）、95%乙醇（批號(hào)：2002171）、鹽酸（批號(hào)：20071128）均購(gòu)自西隴科學(xué)股份有限公司，分析純。

2 方 法

2.1 刺莧粗提

2.1.1 刺莧全草粗提 取刺莧全草525 g，加入5倍量的65%乙醇浸漬2 h，超聲功率400 W，溫度40 ℃，提取2次，每次1 h。過(guò)濾，濃縮，依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇進(jìn)行梯度萃取，濃縮得浸膏后冷凍干燥，得到4個(gè)樣品組分，分別為石油醚層、乙酸乙酯層、正丁醇層和水層，置于干燥器中貯存。

2.1.2 刺莧根粗提 取刺莧根750 g，加入6.5倍量65%乙醇浸漬2 h，超聲功率400 W，溫度40 ℃，提取2次，每次1 h。過(guò)濾，合并濾液濃縮后取少量濃縮液作為醇提層，其余濃縮液依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇進(jìn)行梯度萃取，濃縮得浸膏后冷凍干燥，得到4個(gè)樣品組分，分別為醇提層、石油醚層、乙酸乙酯層和正丁醇層，置于干燥器中貯存。

2.2 溶液配制與樣品制備

2.2.1 儲(chǔ)備液的配制 溶液A的配制：精密稱(chēng)取無(wú)水氯化鈣、氯化鈉、無(wú)水乙酸鈉，先用純化水溶解，后轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶中，定容至100 mL，搖勻。用鹽酸或氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值至5.7，配成濃度為10.0、8.5、1.0 mmol/L的CaCl2溶液。

溶液B的配制：精密稱(chēng)取草酸鈉、氯化鈉、無(wú)水乙酸鈉，先用純化水溶解，后轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶中，定容至100 mL，搖勻。用鹽酸或氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值至5.7，配成濃度為5.0、1.5、1.0 mmol/L的Na2C2O4溶液。

2.2.2 刺莧提取液的制備 稱(chēng)取刺莧全草和根8個(gè)樣品冷凍干燥組分各0.04 g，量取40.0 mL純化水，制備成1 000 μg/mL提取液，過(guò)濾，用純化水稀釋配制成750、500、250、125 μg/mL的提取液，備用。

2.2.3 草酸鈣對(duì)照品的配制 按鄧芳等[9]的方法，量取1.1 mol/L的氯化鈣溶液、0.2 mol/L的氯化鈉溶液和適量的純化水于干凈的燒杯中，攪拌均勻后加0.033 mol/L的草酸鈉溶液，使最終溶液中c（Ca2+）=c（C2O42-）=11.0 mmol/L，攪拌反應(yīng)20 min，密封，陳化12 h。

將陳化好的草酸鈣溶液用0.22 μm微孔過(guò)濾膜過(guò)濾，得草酸鈣沉淀，真空干燥，40 ℃，過(guò)夜，得空白對(duì)照品。

2.2.4 草酸鈣樣品的配制 取干凈燒杯，分別加入1.1 mol/L的氯化鈣溶液，濃度為1 000、750、500、250、125 μg/mL的刺莧根提取物及適量的純化水，參考草酸鈣對(duì)照品的配制，得草酸鈣樣品。

2.3 刺莧提取物體外抑石作用研究 將制備得到的草酸鈣對(duì)照品和草酸鈣樣品進(jìn)行EM、SEM、FTIR、XRD分析，通過(guò)FTIR檢測(cè)COD紅外特征峰（νs 1 324 cm-1和νas 1 646 cm-1）進(jìn)行定性分析，XRD檢測(cè)COD晶面（200）進(jìn)行定量分析。

2.3.1 電子顯微鏡法觀(guān)察 24孔板中加入475 μL溶液A，50 μL的1 000 μg/mL刺莧全草水層提取液，475 μL的溶液B，制成不同摩爾比的草酸鈣溶液[10]。以含有50 μL純化水的樣品代替刺莧提取物作為空白對(duì)照。置于不同倍數(shù)的顯微鏡下觀(guān)察，并對(duì)晶體大小、形狀和密度進(jìn)行定性分析。

2.3.2 SEM觀(guān)察草酸鈣晶體的外部形態(tài)結(jié)構(gòu) 參考文獻(xiàn)[11]，制備草酸鈣晶體，量取0.01 mol/L的氯化鈣溶液、0.2 mol/L的氯化鈉溶液及適量的純化水，待攪拌均勻后，加0.01 mol/L的草酸鈉溶液，使c（Ca2+）=c（C2O42-）=1.00 mmol/L，攪拌反應(yīng)20 min，超聲功率100 W，溫度30 ℃，15 min，得樣品溶液。

在培養(yǎng)皿中放大小相當(dāng)?shù)膱A形濾紙，用鑷子夾取5 mm×5 mm的單晶硅片，光亮面朝上，放于濾紙中央，用1～2滴無(wú)水乙醇清洗硅片，待干后加入上述溶液50 μL，自然晾干，得草酸鈣樣品。進(jìn)行SEM觀(guān)察，電壓10 kV。

2.3.3 XRD的測(cè)試條件 參照胡鵬等[12]的XRD測(cè)試條件：Cu靶，Kα輻射，40 kV，20 mA；狹縫：DS，1°，RS，0.15 mm，SS，1；掃描速度：8（°）/min，掃描范圍：2θ為5°～60°。

2.3.4 COD百分含量計(jì)算 按照文獻(xiàn)[13]的實(shí)驗(yàn)方法，用COD(%)=ICOD/（ICOM+ICOD)×100%計(jì)算樣品中COD的百分含量，式中ICOM為COM（101）晶面的強(qiáng)度，ICOD為COD（200）晶面的強(qiáng)度。

3 結(jié)果與討論

3.1 EM結(jié)果分析 空白對(duì)照品中，隨著溶液中Ca/Ox摩爾比的減少，生成的草酸鈣晶體數(shù)量增加，且晶形也不同。（見(jiàn)圖1～8）劉虹等[14]的研究也表明，草酸鹽濃度對(duì)草酸鈣的形成影響更大。在空白對(duì)照品中分別加入1 000 μg/mL刺莧全草水層提取物后，可以發(fā)現(xiàn)所形成的草酸鈣晶體相應(yīng)的數(shù)量增加，但晶形聚集變小，聚集形狀由尖銳變?yōu)檩^圓鈍。由此可見(jiàn)，刺莧全草水層提取物具有一定的抑制草酸鈣晶體生長(zhǎng)和聚集的作用。由ZARIN M A等[15]的研究結(jié)果可推測(cè)刺莧全草水層提取物中可能含有皂苷、黃酮苷等成分。

圖1 空白對(duì)照品[c(Ca2+)∶c(C2O42-)=2∶1]EM 圖

圖2 1000μg/mL全草水層[c(Ca2+)∶c(C2O42-)=2∶1]EM圖

圖3 空白對(duì)照品[c(Ca2+)∶c(C2O42-)=8.5∶1.5]EM 圖

圖4 1000μg/mL全草水層[c(Ca2+):c(C2O42-)=8.5∶1.5]EM圖

圖5 空白對(duì)照品[c(Ca2+)∶c(C2O42-)=2∶1]EM 圖

圖6 1000μg/mL全草水層[c(Ca2+)∶c(C2O42-)=10∶1]EM圖

圖7 空白對(duì)照品[c(Ca2+)∶c(C2O42-)=2∶1]EM 圖

圖8 1000μg/mL全草水層[c(Ca2+)∶c(C2O42-)=1∶5]EM圖

3.2 草酸鈣對(duì)照品結(jié)果分析

3.2.1 SEM結(jié)果分析 由文獻(xiàn)[8]可知，草酸鈣晶體的SEM圖像，COM多為外表棱角分明的六角形狀，COD為較圓鈍的四邊形椎體。本實(shí)驗(yàn)制備的草酸鈣晶體對(duì)照品中大多為COM。（見(jiàn)圖9）

圖9 草酸鈣晶體對(duì)照品的SEM 圖

3.2.2 FTIR結(jié)果分析 在COM和COD的標(biāo)準(zhǔn)紅外光譜圖中，在3 000～3 600 cm-1處的寬峰由O-H的伸縮振動(dòng)引起，其中COM分裂成5個(gè)小峰，而COD為1個(gè)大峰，強(qiáng)度比COM強(qiáng)，主要是因?yàn)镃OD比COM多含有1個(gè)H2O。草酸根（COO-）的對(duì)稱(chēng)伸縮振動(dòng)νs（COO-）分別為1 316 cm-1和1 324 cm-1，反對(duì)稱(chēng)伸縮振動(dòng)νas（COO-）分別為1 620 cm-1和1 646 cm-1。指紋區(qū)COM的吸收帶出現(xiàn)在949 cm-1、885 cm-1和663 cm-1，COD則出現(xiàn)在912 cm-1和611 cm-1處[17]。（見(jiàn)圖10）

圖10 一水草酸鈣（上）和二水草酸鈣（下）的標(biāo)準(zhǔn)IR 譜圖[16]

經(jīng)FTIR定性，草酸鈣對(duì)照品草酸根（COO-）的對(duì)稱(chēng)伸縮振動(dòng)νs（COO-）與COD的對(duì)稱(chēng)伸縮振動(dòng)峰相似，而反對(duì)稱(chēng)伸縮振動(dòng)νas（COO-）主要存在COM的反對(duì)稱(chēng)伸縮振動(dòng)峰，指紋區(qū)出現(xiàn)COM的吸收峰663 cm-1，說(shuō)明草酸鈣對(duì)照品中同時(shí)存在COM和COD，以COM為主。（見(jiàn)圖11）

圖11 草酸鈣對(duì)照品IR 圖

3.2.3 XRD結(jié)果分析 由文獻(xiàn)[7]可知，COM主要晶面為（101）、（020）、（202）、（130），COD主要晶面為（200）、（211）、（400）、（213）。草酸鈣對(duì)照品的XRD圖中以COM晶面為主要存在形式。（見(jiàn)圖12）

圖12 草酸鈣對(duì)照品XRD 圖

因此，綜上可以確定草酸鈣對(duì)照品中的主要成分主要為COM。本實(shí)驗(yàn)擬通過(guò)FTIR和XRD，將草酸鈣樣品與草酸鈣對(duì)照品進(jìn)行比較，觀(guān)察刺莧根提取物是否可以抑制草酸鈣晶體中COM的生長(zhǎng)或誘導(dǎo)COD的形成，探究其是否存在抑石作用。

3.3 草酸鈣樣品結(jié)果分析

3.3.1 FTIR結(jié)果分析 FTIR測(cè)定結(jié)果發(fā)現(xiàn)，4個(gè)刺莧根提取物的5個(gè)不同濃度FTIR結(jié)果相差不大，結(jié)合XRD結(jié)果，分別從中選取一個(gè)作用較明顯的濃度進(jìn)行比較。（見(jiàn)圖13～16）

圖13 醇提層樣品500 μg/mL IR 圖

圖14 正丁醇層樣品500 μg/mL IR 圖

圖15 乙酸乙酯層樣品1 000 μg/mL IR 圖

圖16 石油醚層樣品1 000 μg/mL IR 圖

將草酸鈣對(duì)照品與草酸鈣樣品的FT-IR譜圖進(jìn)行對(duì)比，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 不同草酸鈣樣品的FT-IR 檢測(cè)結(jié)果

由表1可知，刺莧根4個(gè)不同部位提取物制備的草酸鈣樣品的對(duì)稱(chēng)伸縮振動(dòng)νs（COO-）無(wú)明顯差異，與COD的對(duì)稱(chēng)伸縮振動(dòng)峰相似。而反對(duì)稱(chēng)伸縮振動(dòng)νas（COO-），正丁醇層和石油醚層顯示COD伸縮振動(dòng)峰，醇提層和乙酸乙酯層無(wú)顯著區(qū)別，主要與COM的伸縮振動(dòng)峰相似。

由FTIR譜圖結(jié)果可知，刺莧根的4個(gè)不同部位提取物制備得到的草酸鈣樣品，均存在COD的特征峰，說(shuō)明刺莧根提取物可以誘導(dǎo)COD的生成，具有一定的抑石活性。

3.3.2 XRD結(jié)果分析 根據(jù)COD（%）=ICOD/（ICOM+ICOD）×100%計(jì)算COD的百分含量，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 不同草酸鈣樣品所含COD 的含量

由表2可知，刺莧根的4個(gè)不同部位提取物制備的草酸鈣樣品中含有一定量的COD，且隨著濃度的增加，誘導(dǎo)生成的COD百分含量增加。由XRD圖可以看出，草酸鈣樣品中均以COM晶面為主要存在形式，COD晶面僅少量存在。（見(jiàn)圖17～18）由此可見(jiàn)，刺莧根的4個(gè)不同部位提取物均有一定程度的誘導(dǎo)COD晶體形成的作用，但作用并不顯著。

圖17 醇提層500 μg/mL XRD 圖

圖18 石油醚層1 000 μg/mL XRD 圖

4 結(jié) 論

腎結(jié)石是泌尿系統(tǒng)的常見(jiàn)病，草酸鈣結(jié)石在腎結(jié)石中最常見(jiàn)[18]，本實(shí)驗(yàn)采用EM、FTIR、XRD、SEM等方法比較研究了刺莧根4個(gè)不同部位提取物對(duì)草酸鈣晶體生長(zhǎng)的調(diào)控作用。研究表明，4個(gè)不同部位的刺莧根提取物有一定的抑制草酸鈣晶體成核和生長(zhǎng)，以及誘導(dǎo)COD晶體形成的作用，但作用不顯著。結(jié)合本課題組的前期研究[19]，在以小鼠為實(shí)驗(yàn)對(duì)象建立的體內(nèi)草酸鈣結(jié)石損傷模型中，刺莧根正丁醇層提取物表現(xiàn)出明顯的排石活性，可以發(fā)現(xiàn)刺莧提取液的排石活性機(jī)制可能主要為利尿作用，抑石作用較為微弱。