異鼠李素對神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞C6的抑制作用及機(jī)制研究

摘要：目的?探究小分子化合物異鼠李素對神經(jīng)膠質(zhì)瘤的抑制作用。方法?選擇神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞C6細(xì)胞株為實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，通過噻唑藍(lán)（MTT）比色法實(shí)驗(yàn)檢測0、1、5、10、25、50μM的異鼠李素對C6細(xì)胞增殖的抑制作用，利用平板克隆實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證異鼠李素可以抑制C6細(xì)胞的克隆形成能力，并通過免疫蛋白印跡（Western?blot）法檢測不同濃度的異鼠李素對細(xì)胞蛋白表達(dá)水平影響。結(jié)果?異鼠李素明顯抑制C6細(xì)胞的增殖、克隆形成能力。并且，異鼠李素能夠下調(diào)CDK2的蛋白表達(dá)。結(jié)論?異鼠李素可能靶向CDK2，并通過下調(diào)CDK2的表達(dá)從而抑制C6細(xì)胞的生長。

關(guān)鍵詞：大鼠;神經(jīng)膠質(zhì)瘤;異鼠李素;C6;CDK2

腫瘤是在許多致癌因素的作用下，引起局部組織增生而形成的贅生物，并可以通過血液、淋巴液進(jìn)行遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移至全身不同臟器，是目前威脅人類健康最重要的疾病之一。據(jù)統(tǒng)計(jì)世界上每年都有超過?1400?萬的人患上腫瘤[1]，并在?2015?年之后腫瘤在全球死亡病因中列居第二[2]。飲食、慢性炎癥、吸煙、輻射、大氣環(huán)境污染等都可以促進(jìn)腫瘤的發(fā)生。

在惡性腫瘤中，神經(jīng)膠質(zhì)瘤是一種中樞神經(jīng)系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤，約占顱內(nèi)惡性腫瘤的50%。神經(jīng)膠質(zhì)瘤好發(fā)于成人，腫瘤細(xì)胞呈彌漫性生長，腫瘤邊界不清、惡性程度高等特點(diǎn)導(dǎo)致神經(jīng)膠質(zhì)瘤患者五年生存率低于10%，嚴(yán)重危害人類健康[3]。

1?方法

1.1?MTT法檢測異鼠李素對C6細(xì)胞增殖的抑制作用

收集細(xì)胞并合理調(diào)整細(xì)胞濃度，5%?CO2，37?℃孵育，至細(xì)胞單層鋪滿孔底，加不同濃度梯度的異鼠李素后每孔加入20?μL?MTT溶液。4h后終止培養(yǎng)，每孔加入150?μL二甲基亞砜，在酶聯(lián)免疫檢測儀OD490?nm處測量各孔的吸光值。后將數(shù)據(jù)整理利用Graphpad?prism軟件進(jìn)行作圖分析。

1.2?平板克隆實(shí)驗(yàn)檢驗(yàn)異鼠李素對C6細(xì)胞克隆形成的抑制作用

每孔2000個對數(shù)生長期的C6細(xì)胞接種于六孔板中，隔天給藥后置于CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7天左右。當(dāng)培養(yǎng)皿中出現(xiàn)肉眼可見的克隆時，終止培養(yǎng)，用PBS清洗細(xì)胞2次。加4%多聚甲醛固定液5?mL固定細(xì)胞15分鐘。然后去固定液，加適量結(jié)晶紫染色液染10～30分鐘，然后用流水緩慢洗去染色液，空氣干燥。用肉眼直接計(jì)數(shù)克隆，最后計(jì)算克隆形成率，Image?J軟件計(jì)數(shù)并作圖分析，克隆形成率（對照組）=實(shí)驗(yàn)組克隆數(shù)/對照組克隆數(shù)*100%，后將數(shù)據(jù)整理利用Graphpad?prism軟件進(jìn)行作圖分析。

1.3?Western?blot檢測異鼠李素作用后CDK2的表達(dá)水平

異鼠李素處理C6細(xì)胞后，對細(xì)胞裂解提取總蛋白。方法為，去除培養(yǎng)基，用PBS涮洗，每皿加入50?μL細(xì)胞裂解液，并使培養(yǎng)皿傾斜放入冰中10?min使細(xì)胞裂解充分，將細(xì)胞裂解液轉(zhuǎn)移至滅菌1.5?mL?EP管中，使用冷凍高速離心機(jī)在4?°C的條件下進(jìn)行離心后將沉淀?xiàng)壍?，上清液即為?xì)胞總蛋白。隨之利用BCA法測蛋白濃度。一抗4?°C過夜，二抗常溫孵育1?h，自動發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)讀取結(jié)果，分析結(jié)果。

1.4?統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

本研究采用Graphpad?prism軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理并繪圖，P<0.05可說明結(jié)果具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2?結(jié)果

與對照組相比（圖1），異鼠李素能夠明顯抑制C6神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖能力。并且，隨著異鼠李素濃度的升高，C6細(xì)胞的增殖活力明顯下降，在濃度為25?μM時，細(xì)胞存活率僅為45%。當(dāng)濃度達(dá)到最大給藥濃度50?μM時，細(xì)胞存活率下降了65%左右，這說明異鼠李素對C6腫瘤細(xì)胞具有明顯的殺傷效果。

細(xì)胞傷口愈合實(shí)驗(yàn)所示（圖2、3），和對照組相比，在相同給藥時間下，C6細(xì)胞的遷移能力隨著藥物濃度的增高呈下降趨勢。異鼠李素可以有效抑制C6神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的遷移、克隆形成能力。

實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)CDK2蛋白隨著異鼠李素濃度的增高而下降（圖4）。對western?blot條帶結(jié)果所進(jìn)行灰度值統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)（圖5），藥物濃度為10?μM時，CDK2的蛋白已下降50%以上。因此，異鼠李素可下調(diào)C6細(xì)胞CDK2蛋白的表達(dá)。

3?討論

C6是一株來源于大鼠的神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞。CDK2蛋白的異常高表達(dá)與腫瘤細(xì)胞的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，尤其該蛋白在細(xì)胞周期信號通路中發(fā)揮著舉足輕重的作用。本文研究顯示，異鼠李素能夠顯著降低CDK2蛋白表達(dá)水平，并且對C6神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖、遷移有抑制作用，因此可推測，異鼠李素可能通過降低CDK2蛋白的表達(dá)，影響了腫瘤細(xì)胞細(xì)胞周期通過，最終抑制神經(jīng)膠質(zhì)瘤生長。然而這些具體作用機(jī)制需要進(jìn)一步深入研究。

相信通過科研的不斷深入，進(jìn)一步了解小分子藥物異鼠李素的抗癌機(jī)制，相信在不久將來對神經(jīng)膠質(zhì)瘤分子靶向治療領(lǐng)域?qū)幸粋€質(zhì)的飛躍，造福全人類。

參考文獻(xiàn)：

[1]RUSSO?M，RUSSO?G?L，DAGLIA?M，et?al.Understanding?genistein?in?cancer：the“good”and?the“bad”effects：a?review[J].Food?Chemistry，2016，196：589-600.

[2]WE?Library.National?bureau?of?statistics?of?China.China?statistical?yearbook[M].Beijing：China?Statistics?Press，2010.

[3]AQUILANTI?E，MILLER?J，SANTAGATA?S，et?al.Updates?in?prognostic?markers?for?gliomas[J].Neuro-oncology，2018，20：17-26.

作者簡介：馬徐民，1993年10月生，男，漢族，湖北襄陽，助教，碩士研究生，小分子化合物抗腫瘤細(xì)胞的機(jī)制研究。