小型豬在人類疾病模型方面的研究進(jìn)展

吳華莉，涂尾龍，曹建國，王洪洋，范 春，王勝昌，趙 瑩，談?dòng)浪?/p>

（1.上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，上海 閔行 201106；2.上海市種豬工程技術(shù)研究中心，上海 浦東 201302；3.上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心，上海 浦東 201302）

隨著人類疾病研究的不斷發(fā)展，對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的需求越來越大，不僅對(duì)常用的小鼠和大鼠的數(shù)量增加，對(duì)其他動(dòng)物如兔、犬等實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的數(shù)量也在增加。然而這些實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和人在生理特征和基因表達(dá)等方面有所不同，不能充分模擬人類疾病，而豬由于在解剖學(xué)、神經(jīng)生物學(xué)、心臟血管系統(tǒng)、胃腸道和基因組等方面更接近人類，是理想的人類疾病模型[1-3]。豬作為一種動(dòng)物模型能夠?yàn)榉肿由锘瘜W(xué)研究提供足夠的組織和血液，而且豬的壽命長可以詳細(xì)跟蹤疾病的進(jìn)展。例如Baxa等對(duì)小型豬的亨廷頓氏病模型進(jìn)行系列研究時(shí)間長度達(dá)到8年，這在其他實(shí)驗(yàn)動(dòng)物身上是不可能的[4]?？蒲泄ぷ髡咭孕⌒拓i為醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型進(jìn)行大量研究，尤其作為人類疾病研究的動(dòng)物模型近年來得到很大發(fā)展。

1 用于人類疾病模型的小型豬品種

國內(nèi)用于人類疾病模型的小型豬品種有廣西巴馬小型豬、貴州小型豬、五指山小型豬近交系和西藏小型豬等[5-6]。國外用于人類疾病模型的小型豬品種有哥廷根系（Goottingen）、尤卡坦系（Yucatan）、明尼蘇達(dá)-荷曼小型豬（Minnesota-Hormel）、皮特曼-摩爾小型豬（Pitman-Moore）、科西嘉小型豬（Corsica）和漢佛特小型豬（Hanford）等[7-9]。

2 小型豬在人類疾病模型研究的進(jìn)展情況

2.1 在心血管疾病模型方面

豬被認(rèn)為是人類心血管系統(tǒng)的理想實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型，因?yàn)樨i的心臟形態(tài)、功能、血流動(dòng)力學(xué)和代謝方面與人類相似[10-11]。研究者采用基因修飾技術(shù)構(gòu)建人心血管疾病轉(zhuǎn)基因豬模型，包括內(nèi)皮一氧化氮合酶（eNOS）轉(zhuǎn)基因豬、過氧化氫酶（hCat）轉(zhuǎn)基因豬、載脂蛋白CIII（ApoCIII）轉(zhuǎn)基因豬和過氧化物酶體復(fù)合物-γ（PPAR-γ）基因敲除豬。Hao等采用尤卡坦小型豬生產(chǎn)eNOS轉(zhuǎn)基因豬。血管功能、血管結(jié)構(gòu)和穩(wěn)態(tài)部分受內(nèi)皮細(xì)胞eNOS釋放的一氧化氮（NO）調(diào)控，在機(jī)體健康和疾病中，eNOS釋放的NO在調(diào)節(jié)骨骼和心肌代謝中發(fā)揮重要作用。轉(zhuǎn)基因豬的eNOS基因由一個(gè)Tie-2啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)，并標(biāo)記V5 His標(biāo)簽，目的在于了解eNOS對(duì)心血管的調(diào)節(jié)作用[12]。Whyte等以內(nèi)皮特異性方式過表達(dá)hCat，培育轉(zhuǎn)基因尤卡坦小型豬，目的在于研究過氧化氫（H2O2）在血管健康和疾病機(jī)制中發(fā)揮的作用。hCat代謝H2O2，H2O2是血管緊張度的重要調(diào)節(jié)因子，可導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣硬化和子癇前期等疾病[13]。Wei等報(bào)道ApoCIII轉(zhuǎn)基因小型豬模型的產(chǎn)生，以研究高脂血癥與動(dòng)脈粥樣硬化疾病的關(guān)系。高甘油三酯血癥被認(rèn)為是冠心病的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，心血管疾病與脂蛋白代謝密切相關(guān)，ApoCIII與血漿甘油三酯水平密切相關(guān)。在轉(zhuǎn)基因豬中，發(fā)現(xiàn)血漿甘油三酯水平升高，血漿甘油三酯清除延遲，脂蛋白脂肪酶活性降低[14]。Yang等報(bào)道，生產(chǎn)PPAR-γ基因敲除豬，PPAR-γ在心血管疾病中起重要作用。PPAR-γ激動(dòng)劑噻唑烷二酮類（TZDs）是臨床應(yīng)用于治療2型糖尿病的胰島素增感劑。生產(chǎn)小型豬模型目的在于研究PPAR-γ和TZDs在糖尿病和心血管并發(fā)癥中的功能[15]。陳民利等建立了小型豬慢性心肌缺血模型，對(duì)五指山豬、巴馬小型豬和西藏小型豬的運(yùn)輸應(yīng)激和高脂誘導(dǎo)發(fā)生動(dòng)脈粥樣硬化（AS）的危險(xiǎn)因素進(jìn)行評(píng)估[16]。小型豬慢性心肌缺血模型，對(duì)于心臟疾病的研究與治療方面具有重要意義[17-18]。五指山小型豬被用于構(gòu)建急慢性心肌缺血模型、致急性心肌梗死模型、心力衰竭模型和心肺復(fù)蘇后心肌代謝評(píng)估等疾病模型[19]。

2.2 亨廷頓氏病模型

亨廷頓氏病（Huntington's disease, HD）是一種遺傳性毀滅性的神經(jīng)退行性疾病[20]。目前尚無治愈方法，治療HD的方法在臨床應(yīng)用之前需要對(duì)其安全性、耐受性和有效性進(jìn)行測(cè)試。由于編碼亨廷頓（Huntingtin, Htt）蛋白的基因突變引起胞嘧啶、腺嘌呤和鳥嘌呤序列重復(fù)擴(kuò)增，導(dǎo)致Htt蛋白氨基端的多聚谷氨酰胺膨脹和突變蛋白積累。具有致病性鳥嘌呤序列重復(fù)次數(shù)與疾病的嚴(yán)重程度和發(fā)病年齡密切相關(guān)。這種疾病具備單遺傳性質(zhì)，從而使生產(chǎn)攜帶突變亨廷頓蛋白（the mutated huntingtin, mHTT）的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型成為可能[21]。Baxa等生產(chǎn)表達(dá)人亨廷頓蛋白的N端區(qū)域的轉(zhuǎn)基因亨廷頓病小型豬（transgenic HD minipig boars, TgHD）[22]。突變亨廷頓蛋白（mtHtt）不僅導(dǎo)致大腦神經(jīng)元變性，也會(huì)影響生殖系統(tǒng)。Macakova等對(duì)F1代（24～48月齡）和F2代（12～36月齡）轉(zhuǎn)基因小型豬（TgHD）和野生型（WT）的小型豬精子和睪丸的生殖細(xì)胞學(xué)參數(shù)和電鏡圖像進(jìn)行比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)24月齡和36月齡TgHD公豬的精子尾部和睪丸上皮細(xì)胞中有許多病理特征，睪丸中精原細(xì)胞的增殖活性顯著降低。mtHtt在TgHD公豬精子和睪丸中高表達(dá)，并定位于所有輸精管細(xì)胞中，研究結(jié)果證實(shí)TgHD公豬的精子和睪丸變性是由高表達(dá)的mtHtt功能獲得引起的[23]。Askeland等檢測(cè)48月齡TgHD豬線粒體DNA損傷和代謝改變的標(biāo)記物[21]。Ardan等在TgHD豬5～5.8歲時(shí)，檢測(cè)HD 的病理特征，在新紋狀體和大腦皮質(zhì)以及一些神經(jīng)元軸突中檢測(cè)到基因型特異性的顯著細(xì)胞丟失[24]。Baxa等檢測(cè)8歲前TgHD豬的運(yùn)動(dòng)、認(rèn)知和行為表型，建立新的測(cè)試方法調(diào)查TgHD豬的身體活動(dòng)，并探索其在壓力誘導(dǎo)下的行為和認(rèn)知變化。結(jié)果顯示了6～8歲的TgHD豬和野生型豬之間的顯著差異，與野生型野豬相比，4.6～6.5歲的TgHD公豬在午餐期間和下午的體力活動(dòng)都有所增加[4]?；谛⌒拓i建立亨廷頓氏病模型研究的結(jié)果，美國食品和藥物管理局和歐洲藥品評(píng)估機(jī)構(gòu)批準(zhǔn)其用于第一期和第二期臨床試驗(yàn)。研究者生產(chǎn)TgHD的意義在于通過大型動(dòng)物模型反映人類疾病進(jìn)展情況，從而有助于測(cè)試潛在治療HD的方法和縮短患者治療的時(shí)間。

2.3 侏儒病模型

骨的生長主要受生長激素（GH）和胰島素樣生長因子I（GH-IGF-I）軸調(diào)控，豬的GH-IGF-I軸與人類有許多相似之處[25]。在胚胎發(fā)育過程中，囊胚的形成和上肢芽的出現(xiàn)等關(guān)鍵事件在豬和人的妊娠期同時(shí)發(fā)生，豬的生長曲線與人相似[26]。豬骨質(zhì)代謝方面與人有諸多相似，為研究生長激素受體 （GHR）缺陷對(duì)人原發(fā)性生長激素不敏感綜合征（Laron）對(duì)骨生長和代謝的影響提供了更好的模型。Cui等利用鋅指核酸酶（ZFNs）敲除GHR基因，獲得了3種F0雜合子豬（GHR+/4 bp、GHR+/2 bp、GHR+/3 bp），將雜合子豬培育成純合子（GHR4 bp/4 bp）豬，其體形小，體重減輕。從生物化學(xué)角度看，這些豬表現(xiàn)出明顯的GH水平升高和IGF-I水平降低，這些結(jié)果與在Laron患者身上觀察到的表型相似，提示這些豬可以作為Laron綜合征疾病的研究模型[27]。

2.4 癌癥模型

2.4.1 乳腺癌模型 乳腺癌相關(guān)基因1（BRCA1）變異與乳腺癌發(fā)生、發(fā)展和治療密切相關(guān)[28]。BRCA1是腫瘤抑制因子，在DNA斷裂的同源修復(fù)中發(fā)揮重要作用。BRCA1的突變導(dǎo)致基因組不穩(wěn)定和癌癥易感性[29-30]。年輕人的乳腺癌與BRCA1基因的突變有關(guān)[31]。Luo等培育出敲除BRCA1等位基因的尤卡坦小型仔豬，然而所有的小豬在出生后18天內(nèi)死亡，這些豬早期死亡的原因仍不清楚[32]。

2.4.2 結(jié)直腸癌模型 結(jié)直腸癌（Colorectal cancer, CRC）是全球第三大常見人類癌癥，也是截至2018年癌癥相關(guān)死亡的第二大原因[33]。并且結(jié)直腸癌發(fā)病率呈現(xiàn)年輕化趨勢(shì)[34-35]。結(jié)直腸癌起源于結(jié)腸和直腸的上皮襯里，抑制腫瘤的腺瘤樣結(jié)腸息肉蛋白（adenomatous polyposis coil, APC）的功能破壞是引發(fā)腺瘤性息肉形成的主要事件，APC作為Wnt通路的負(fù)調(diào)控因子，丟失或功能障礙導(dǎo)致Wnt信號(hào)異常，從而導(dǎo)致增殖和腫瘤形成的增加[36-37]。已經(jīng)產(chǎn)生攜帶內(nèi)源性豬APC基因1311位（APC1311）翻譯停止密碼子的豬，該密碼子與導(dǎo)致嚴(yán)重家族腺瘤性息肉?。╢amilial adenomatous polyposis, FAP）的人類APC1309突變同源。APC1311/+豬在1年內(nèi)出現(xiàn)結(jié)腸和直腸息肉，表現(xiàn)為典型的人類腺瘤癌序列，如異常隱窩病灶、高級(jí)別瘤變和原位癌等。豬腺瘤表現(xiàn)出人類FAP和散發(fā)性CRC的遺傳和生化特征。從APC1311這樣的單一突變啟動(dòng)癌前腫瘤的一個(gè)重要優(yōu)勢(shì)是可以詳細(xì)跟蹤導(dǎo)致癌癥的后續(xù)自發(fā)事件，這在老鼠身上是不可能的[38]。

2.5 色素性視網(wǎng)膜炎（Retinitis pigmentosa, RP）模型

色素性視網(wǎng)膜炎（RP）的特征是光感受器最初的進(jìn)行性喪失、隨后血管和其他細(xì)胞層惡化，是一種遺傳性、致盲性視網(wǎng)膜疾病[39]。RP患者由于視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞功能逐漸喪失及光感受器進(jìn)行性凋亡從而導(dǎo)致不可逆的視力損傷。RP小鼠模型由于小鼠和人類之間眼球細(xì)胞結(jié)構(gòu)差異，不能完全復(fù)制這種疾病。人與鼠眼球的主要區(qū)別在于視網(wǎng)膜上感光細(xì)胞的數(shù)量和分布，尤其是視錐感光細(xì)胞，人的視網(wǎng)膜比嚙齒動(dòng)物的視網(wǎng)膜有更多的視錐感光細(xì)胞，人眼視網(wǎng)膜的視錐感光細(xì)胞主要分布在黃斑區(qū)晚期。然而在嚙齒類動(dòng)物的視網(wǎng)膜中，這些細(xì)胞均勻地分布在整個(gè)視網(wǎng)膜上[40]。豬的視網(wǎng)膜有一個(gè)黃斑區(qū)域，富含視錐感光細(xì)胞，類似于人類的視網(wǎng)膜。豬是再生醫(yī)學(xué)臨床研究的理想對(duì)象，因?yàn)樗难劬υ诖笮『徒Y(jié)構(gòu)上與人的眼睛相似，外圍主要是桿狀光感受器，而視覺條紋主要是錐狀光感受器，因此，豬是比鼠更好的RP模型。Petters等生產(chǎn)表達(dá)突變的視紫紅質(zhì)基因Pro347Leu突變的轉(zhuǎn)基因豬，早期時(shí)出現(xiàn)嚴(yán)重的桿狀光感受器丟失，最初它們的視錐光感受器相對(duì)存活，但這些幸存的視錐光感受器慢慢退化，當(dāng)轉(zhuǎn)基因豬發(fā)育到20個(gè)月齡時(shí)，只有一層形態(tài)異常的視錐光感受器，視錐細(xì)胞視網(wǎng)膜電圖明顯減少[41]。Ross等生產(chǎn)表達(dá)人視紫紅質(zhì)P23H突變的轉(zhuǎn)基因豬模型，這些轉(zhuǎn)基因豬在3個(gè)月后出現(xiàn)異常暗視和明視的視網(wǎng)膜電圖。豬RP模型的這種表型與RP患者的表型相似，為研究RP的發(fā)病機(jī)制和治療方法提供了新的工具[42]。

2.6 囊性纖維化病模型

囊性纖維化?。╟ystic fibrosis, CF）是一種常染色體隱性遺傳病，是由編碼囊性纖維化跨膜傳導(dǎo)調(diào)節(jié)因子（cystic fibrosis transmembrane conductance, CFTR）的基因突變引起的[43]。CF影響多個(gè)器官，如胰腺、腸、肝、輸精管和肺。肺疾病是導(dǎo)致CF發(fā)病和死亡的主要原因。豬的肺與人類相似，已被建立為幾種人類肺部疾病狀態(tài)的模型。Welsh等生產(chǎn)的新生CFTR-/-仔豬表現(xiàn)出腸道病變、胰腺破壞、膽囊異常和早期肝硬化，與人類CF中觀察到的情況相似。隨著時(shí)間的推移，CFTR-/-豬出現(xiàn)了人類CF中肺部疾病的標(biāo)志性特征。CFTR-/-豬模型復(fù)制了人類CF的大部分特征，提示這些CFTR-/-豬對(duì)更好地理解CF的發(fā)病機(jī)制以及開發(fā)新的治療方案具有價(jià)值[44]。

3 展望

目前小型豬已有多種用于人類疾病的轉(zhuǎn)基因豬模型問世。與小鼠相比，可用來復(fù)制人類疾病的豬模型數(shù)量有限。造成這種情況的原因有很多，如成本高、懷孕時(shí)間長和性成熟。此外豬的技術(shù)方面極大地限制了轉(zhuǎn)基因豬模型的生產(chǎn)。因此，到目前為止，只有少數(shù)基因敲除豬模型被實(shí)現(xiàn)。鑒于特異性基因修飾新技術(shù)的出現(xiàn)，如ZFN、轉(zhuǎn)錄激活子樣效應(yīng)因子核酸酶（Transcription activator-like effector nucleases, TALEN）、具有長期增殖能力的供體細(xì)胞、豬的誘導(dǎo)多能干細(xì)胞等，這些新技術(shù)使豬的基因修飾比以往更加有效。此外功能基因組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)有助于分析豬模型在人類疾病模型的生物學(xué)和病理學(xué)復(fù)雜的分子機(jī)制。特別是基因組、轉(zhuǎn)錄和蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)的整合產(chǎn)生的“系統(tǒng)生物學(xué)”促進(jìn)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型快速發(fā)展。未來需要建立實(shí)驗(yàn)用小型豬標(biāo)準(zhǔn)化實(shí)驗(yàn)室，包括遺傳學(xué)、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理學(xué)，以及實(shí)驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)和設(shè)備。隨著特定基因修飾技術(shù)和實(shí)驗(yàn)室豬標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)的進(jìn)步，不久的將來會(huì)產(chǎn)生更多用于人類疾病的豬模型，從而促進(jìn)人類疾病臨床研究和轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)的發(fā)展。