李進(jìn)海，薛 琳，周 橋，黃 嵐，王忠義

雙管離子選擇性微電極制備方法研究

李進(jìn)海1，薛 琳2，周 橋1，黃 嵐1，王忠義1※

（1. 中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)信息與電氣工程學(xué)院，北京 100083；2. 北京聯(lián)合大學(xué)智慧城市學(xué)院，北京 100101）

雙管離子選擇性微電極被廣泛應(yīng)用于植物細(xì)胞外離子流速和細(xì)胞內(nèi)離子活度的測(cè)量，但雙管離子選擇性微電極（Ion-Selective Microelectrode，ISME）的制備過(guò)程繁瑣，不可控因素多，制備成功率低。針對(duì)存在的問(wèn)題，該研究提出了一種簡(jiǎn)易、快速的雙管ISME制備方法。首先，介紹了雙管微電極制備、硅烷化和電極尖端灌充液態(tài)離子交換劑（Liquid Ion Exchanger，LIX）的具體流程；其次，對(duì)制備的雙管ISME的能斯特斜率和響應(yīng)時(shí)間進(jìn)行了測(cè)試。試驗(yàn)結(jié)果表明，使用蒸汽硅烷法對(duì)雙管微電極進(jìn)行硅烷化處理，最優(yōu)硅烷化溫度、二甲基二氯硅烷劑量和硅烷化時(shí)間分別為150 ℃、45L和90 min；制備的雙管氫離子、鉀離子、鈣離子、氯離子選擇性微電極的能斯特斜率分別為54.08、56.51、27.08和-58.80 mV/dec；4種雙管ISME的響應(yīng)時(shí)間介于0.20～0.42 s之間。研究結(jié)果表明，由該研究制備方法制作的雙管ISME，可以滿足植物細(xì)胞外離子流速和細(xì)胞內(nèi)離子活度信息檢測(cè)的要求。雙管ISME的快速制備，降低了離子選擇性微電極技術(shù)的應(yīng)用難度，將有利于植物電生理檢測(cè)試驗(yàn)的進(jìn)行和離子選擇性微電極技術(shù)在農(nóng)作物育種、生理抗逆、植物營(yíng)養(yǎng)吸收與同化等研究領(lǐng)域的應(yīng)用。

微電極；試驗(yàn)；雙管離子選擇性微電極；硅烷化；制備方法

0 引 言

離子選擇性電極（Ion-Selective Electrode，ISE）是一種電化學(xué)傳感器，可將溶液中特定離子的活度轉(zhuǎn)換為電位，因此也稱(chēng)為特定離子電極（Specific Ion Electrode，SIE）。由于離子選擇性電極功能的實(shí)現(xiàn)需要借助對(duì)特定離子具有選擇性響應(yīng)的電極膜，因此又稱(chēng)為膜電極。根據(jù)國(guó)際純化學(xué)和應(yīng)用化學(xué)聯(lián)合會(huì)（International Union of Pure and Applied Chemistry，IUPAC）建議，離子選擇膜分為液態(tài)膜、固態(tài)膜和特殊膜等[1]。液態(tài)膜又稱(chēng)液態(tài)離子交換劑，具有良好的線性檢測(cè)范圍和快速的動(dòng)態(tài)響應(yīng)時(shí)間，可作為離子選擇性膜灌充在玻璃微電極的尖端，制成離子選擇性微電極。離子選擇性微電極技術(shù)實(shí)現(xiàn)了在介觀時(shí)空尺度對(duì)植物的電生理活動(dòng)的監(jiān)測(cè)，包括對(duì)植物細(xì)胞外離子流速的動(dòng)態(tài)檢測(cè)和對(duì)細(xì)胞內(nèi)特定離子活度的實(shí)時(shí)測(cè)量[2-3]。

細(xì)胞外離子流速動(dòng)態(tài)檢測(cè)是指在不損傷生物活體樣品的前提下動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)離子進(jìn)出細(xì)胞膜的過(guò)程[4-5]。1974年，美國(guó)海洋生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室（Marine Biological Laboratory，MBL）的神經(jīng)科學(xué)家Jaffe等[6]首次提出了無(wú)損檢測(cè)的原始概念，并采用振動(dòng)電極技術(shù)實(shí)現(xiàn)了對(duì)細(xì)胞外電流信號(hào)的測(cè)量。1990年，Kühtreiber等[7]在已有的細(xì)胞外電流檢測(cè)系統(tǒng)的基礎(chǔ)上，利用微電極振動(dòng)技術(shù)和離子選擇性電極首次記錄到了細(xì)胞外的鈣離子流速，開(kāi)創(chuàng)了離子跨膜研究由靜態(tài)轉(zhuǎn)為動(dòng)態(tài)的先河。細(xì)胞外離子流速檢測(cè)可以在不破壞細(xì)胞的情況下檢測(cè)離子進(jìn)入細(xì)胞的流速和方向，為判斷植物的生理狀態(tài)提供依據(jù)[8-9]。目前應(yīng)用該技術(shù)可以測(cè)量的離子包括鈣離子（Ca2+）、氫離子（H+）、鉀離子（K+）、鈉離子（Na+）、氯離子（Cl-）、鎂離子（Mg2+）、鎘離子（Cd2+）、銨根離子（NH4+）和硝酸根離子（NO3-）等[10-12]。細(xì)胞內(nèi)離子活度的測(cè)量，實(shí)際上是將膜電位測(cè)量技術(shù)與離子選擇性微電極技術(shù)相結(jié)合，在活體條件下直接將離子選擇性微電極刺入單個(gè)細(xì)胞，測(cè)定細(xì)胞內(nèi)特定離子活度的實(shí)時(shí)變化。該技術(shù)被廣泛用于分析離子在細(xì)胞中的區(qū)域化分布和研究植物對(duì)養(yǎng)分離子的吸收機(jī)制[13-15]。ISME的成功制備是實(shí)現(xiàn)離子選擇性測(cè)量的先決條件。ISME分為單管和雙管ISME，通常使用硼硅酸鹽玻璃毛細(xì)管拉制而成，其內(nèi)部灌充電解質(zhì)溶液和液態(tài)離子交換劑。單管ISME制備工藝成熟，制作過(guò)程比較簡(jiǎn)單，但無(wú)法消除電遷移或膜電位變化對(duì)數(shù)據(jù)獲取產(chǎn)生的干擾，影響測(cè)量數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性。雙管ISME可以很好地解決試驗(yàn)中的干擾問(wèn)題，能夠獲取更為準(zhǔn)確的生理信息數(shù)據(jù)，但制作過(guò)程繁瑣、不可控因素多，制備成功率低[16-18]。

綜上，為了獲取更為準(zhǔn)確的離子活度和離子流速信息，針對(duì)雙管ISME制備存在的問(wèn)題，本研究利用單根隔壁式（一管雙腔）硼硅酸鹽玻璃毛細(xì)管制作雙管微電極，提出一種簡(jiǎn)易、高效的雙管微電極灌充方法，并確定了雙管ISME的硅烷化參數(shù)，對(duì)制備的雙管鉀離子、鈣離子、氫離子、氯離子選擇性微電極的能斯特斜率和響應(yīng)時(shí)間進(jìn)行測(cè)試。雙管ISME的快速制備，將有利于促進(jìn)離子選擇性微電極技術(shù)在農(nóng)作物育種、生理抗逆和植物營(yíng)養(yǎng)吸收與同化等研究領(lǐng)域的應(yīng)用。

1 雙管離子選擇性微電極（ISME）工作原理

1.1 雙管離子選擇性微電極（ISME）測(cè)定植物細(xì)胞外離子流速

但當(dāng)植物細(xì)胞產(chǎn)生動(dòng)作電位時(shí)，細(xì)胞（或者組織）作為一個(gè)點(diǎn)源會(huì)影響細(xì)胞外空間中的電場(chǎng)分布[22-23]，此時(shí)電遷移對(duì)離子流速測(cè)量的影響不可忽略。此時(shí)伴隨電極需同步測(cè)得兩測(cè)量點(diǎn)1和2處的電壓值21和22?；谀芩固?普朗克（Nernst-Planck）方程，得到準(zhǔn)確的離子流速如式（2）所示。

式中F為法拉第常數(shù)，F(xiàn)=96 485.33 C/mol；為基液中待測(cè)離子的濃度，mol/L。為絕對(duì)溫度，K；R為理想氣體常數(shù)，R=8.314 J/(K·mol)；為離子的化合價(jià)；Δ為伴隨電極在1和2間的電勢(shì)差，V。

1.2 雙管離子選擇性微電極（ISME）測(cè)定植物細(xì)胞內(nèi)離子活度

植物細(xì)胞膜電位的測(cè)量通常是將尖端直徑小于1m的單管玻璃微電極內(nèi)部灌充電解質(zhì)溶液，然后刺入細(xì)胞，通過(guò)氯化銀電極、前置放大器與數(shù)據(jù)采集系統(tǒng)相連，經(jīng)模數(shù)轉(zhuǎn)換后得到膜電位的變化數(shù)值[20]。微電極刺入植物細(xì)胞后，測(cè)得的電極與基液中參比電極間的電勢(shì)差即為細(xì)胞的膜電位。若將硅烷化后的單管微電極尖端灌充LIX后再刺入植物細(xì)胞，則可對(duì)細(xì)胞內(nèi)特定離子的離子活度進(jìn)行選擇性測(cè)量（圖1）。在進(jìn)行植物細(xì)胞內(nèi)離子活度測(cè)量時(shí)，測(cè)得的數(shù)據(jù)是ISME與基液中參比電極間的電勢(shì)差3（mV），這個(gè)電勢(shì)差不僅包含ISME刺入細(xì)胞后，ISME響應(yīng)離子活度的能斯特電勢(shì)i（mV），還包含該細(xì)胞的膜電位4（mV）。因此，欲得到準(zhǔn)確的離子活度值，需要先扣除膜電位的影響，即i=3-4，再將i經(jīng)過(guò)該電極的能斯特方程計(jì)算后，可得到相應(yīng)離子在細(xì)胞內(nèi)的離子活度。

1.液態(tài)離子交換劑 2.離子選擇性微電極的內(nèi)充電解液 3.伴隨電極的內(nèi)充電解液

1.Liquid ion exchanger 2.Filling electrolyte solution of the ISME 3.Filling electrolyte solution of the accompanying electrode

注：1和2為雙管ISME測(cè)定細(xì)胞外離子流速時(shí)的2個(gè)測(cè)量點(diǎn)；11和12分別為離子選擇性微電極在2個(gè)測(cè)量點(diǎn)測(cè)得的電壓值，mV；21和22為伴隨電極在2個(gè)測(cè)量點(diǎn)測(cè)得的電壓值，mV；3和4分別為利用雙管ISME測(cè)定細(xì)胞內(nèi)離子活度時(shí)離子選擇性微電極和伴隨電極測(cè)得的電壓值，mV。

Note:1and2are the two measuring points for the double-barreled ISME to measure the extracellular ion flux;11and12are the voltage values measured by the ISME at1and2, respectively, mV;21and22were the voltage values measured by the accompanying electrode at the two measuring points, mV;3and4are the voltage values measured by the ISME and the accompanying electrode respectively when the intracellular ion activity was measured by double-barreled ISME, mV.

圖1 雙管離子選擇性微電極工作原理示意圖

Fig.1 Schematic diagram of working principle of double-barreled Ion-Selective Microelectrode (ISME)

2 雙管離子選擇性微電極（ISME）的制備

2.1 雙管微電極的制備

雙管ISME的制備分為3步，分別為制作雙管微電極，雙管微電極硅烷化以及在雙管微電極尖端灌充LIX，因此制備雙管ISME首先要制作雙管微電極。傳統(tǒng)雙管微電極的制備方法極為復(fù)雜，制作流程如圖2a所示。1）將2支硼硅酸鹽玻璃毛細(xì)管固定。2）將2支固定在一起的玻璃毛細(xì)管穿過(guò)加熱絲，加熱后將玻璃毛細(xì)管扭轉(zhuǎn)180°。3）使用拉制儀（P97，Sutter，美國(guó)）將扭轉(zhuǎn)后的玻璃毛細(xì)管拉制成尖端直徑符合要求的微電極。4）利用酒精燈將雙管微電極中的伴隨電極尾端燒彎，便于將LIX與電解液從電極尾部灌入后使用壓力推至電極尖端。傳統(tǒng)雙管微電極制備采用上述工藝的主要原因是傳統(tǒng)雙管ISME制備無(wú)法采用簡(jiǎn)單地正向灌充LIX的方法而只能選擇背向灌充LIX。本研究在解決了雙管ISME正向灌充LIX工藝的基礎(chǔ)上（詳見(jiàn)2.3）利用隔壁式硼硅酸鹽玻璃毛細(xì)管?Septum Theta（TST150-6；World Precision Instruments，美國(guó)）制作雙管微電極（圖2b），該方法無(wú)需復(fù)雜的制備工藝，只需使用拉制儀將隔壁式硼硅酸鹽玻璃毛細(xì)管拉制成尖端直徑為6～10m的雙管微電極。

2.2 雙管微電極的硅烷化

硼硅酸鹽玻璃表面存在大量游離的OH-基團(tuán)，具有親水疏脂的特性，導(dǎo)致具有脂類(lèi)特性的LIX無(wú)法在電極的尖端長(zhǎng)時(shí)間保持[24]。硅烷化的目的是使微電極的管壁呈現(xiàn)親脂性，進(jìn)而提高電極的使用壽命。雙管微電極中伴隨電極的內(nèi)充液是電解質(zhì)溶液，硅烷化后易在電極尖端形成空腔，因此硅烷化時(shí)，使用耐高溫的導(dǎo)熱硅脂將伴隨電極末端封住，也可以使用醫(yī)用凡士林。本研究使用蒸汽硅烷法對(duì)雙管微電極進(jìn)行硅烷化處理（圖3），硅烷化試劑為二甲基二氯硅烷。硅烷化器皿為100 mL的玻璃燒杯，使用硅膠薄膜將燒杯口罩住，硅膠薄膜上有孔洞用于固定電極。硅烷化時(shí)，將電極尖端朝上放置，非尖端插入孔洞，薄膜的彈性會(huì)將電極緊密束縛，隨后整體放入恒溫箱中加熱。本研究關(guān)于電極硅烷化的試驗(yàn)，是在以往關(guān)于單管離子選擇性微電極硅烷化研究基礎(chǔ)上進(jìn)行的[24]，其目的是為了進(jìn)一步探索雙管離子選擇性微電極尖端保持LIX能力最強(qiáng)時(shí)的硅烷化條件。

2.3 雙管微電極的灌充

灌充LIX在雙管ISME的制備過(guò)程中最為困難。傳統(tǒng)雙管ISME制備時(shí)采用2支單管玻璃毛細(xì)管合并而不使用1支雙管玻璃毛細(xì)管，目的是為了將玻璃毛細(xì)管的末端彎曲，以便于灌充。微電極的灌充分為正向灌充和背向灌充。正向灌充時(shí)，先在微電極的內(nèi)部灌注電解質(zhì)溶液，然后將電極尖端接觸LIX池，隨后LIX會(huì)被吸入到微電極的尖端。正向灌充時(shí)使用的LIX量較少，可使用商品化的離子載體混合物（如表1所示）。由于背向灌充成功率低，為了降低成本一般自行配制LIX：將一定比例的離子載體、增塑劑、添加劑和基質(zhì)溶解于四氫呋喃，混合均勻后用微量進(jìn)樣器將LIX從離子選擇性微電極的尾部注入，隨后在干燥瓶中放置3 d，待四氫呋喃完全揮發(fā)后，電極尖端會(huì)留下固態(tài)或半固態(tài)的離子選擇性膜，最后向微電極內(nèi)灌注電解質(zhì)溶液。

表1 商用液態(tài)離子交換劑及其對(duì)應(yīng)的內(nèi)充電解液

正向灌充方法簡(jiǎn)單，電極制作成功率高。背向灌充的過(guò)程較為繁瑣，存在一些不可控的因素，電極制作成功率低，例如電極尖端離子選擇性膜的成型容易出現(xiàn)問(wèn)題、無(wú)法與管壁有效貼合、或者膜上存在孔隙等；同時(shí)，背向灌注電解液時(shí)，電解液與液態(tài)膜可能無(wú)法形成有效的接觸液面；亦或在電極中存在無(wú)法排出的氣泡甚至氣柱等。正向灌充在單管ISME制備中得到廣泛的應(yīng)用，而在雙管ISME制備中卻不適用。主要原因是雙管ISME的伴隨電極在灌充時(shí)會(huì)同步吸入LIX（硅烷化的目的只是提高LIX在玻璃微電極尖端的保持能力）。即使利用壓力將LIX從伴隨電極中推出，LIX也會(huì)從離子選擇性電極再次被吸入到伴隨電極尖端，這也是自行配制的離子選擇性膜需要呈現(xiàn)半固態(tài)（流動(dòng)性較弱）的原因。

雙管ISME尖端灌充LIX的具體過(guò)程如下：

1）配制瓊脂溶液。使用與伴隨電極電解液成分相同的無(wú)機(jī)鹽溶液配制濃度為0.3%～0.5% 瓊脂溶液，并用磁力攪拌器將瓊脂溶液攪拌加熱至沸騰；

2）使用微量進(jìn)樣器將10L沸騰的瓊脂溶液注入伴隨電極，隨后使用壓力注入法將溶液推至電極尖端；

3）在瓊脂溶液凝固前，使用微量進(jìn)樣器向伴隨電極中灌注20L電解質(zhì)溶液，其成分與基液成分相同。由于瓊脂溶液中無(wú)機(jī)鹽離子濃度與伴隨電極內(nèi)充液中無(wú)機(jī)鹽離子濃度相同，因此不會(huì)對(duì)后續(xù)的測(cè)量產(chǎn)生影響；

4）使用微量進(jìn)樣器向離子選擇性微電極內(nèi)灌充30L電解液（表1），并使用壓力注入的方法將電解液推至電極尖端；

5）使用正向灌注的方法灌充LIX。將雙管ISME接觸LIX池，LIX會(huì)被吸入離子選擇性微電極，伴隨電極由于瓊脂塊的阻擋，不會(huì)吸入LIX。

需要注意的是，瓊脂溶液的凝固時(shí)間隨著瓊脂濃度的增加而縮短，濃度過(guò)高，瓊脂溶液會(huì)在伴隨電極尖端快速凝固；反之，若濃度過(guò)低則容易產(chǎn)生氣泡。伴隨電極的內(nèi)充液為100 mmol/L氯化鉀溶液，測(cè)量離子流速時(shí)的伴隨電極內(nèi)充液為基液，一般為2 mmol/L 氯化鉀和1 mmol/L氯化鈣的混合溶液。使用改進(jìn)灌充方法制備的雙管ISME如圖4所示。

3 雙管離子選擇性微電極（ISME）性能測(cè)試

雙管ISME的性能測(cè)試在中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)開(kāi)發(fā)的自參考離子選擇性微電極技術(shù)（Self-referencing Ion Electrode Technique，SIET）測(cè)試系統(tǒng)[20]上進(jìn)行。該系統(tǒng)采用離子選擇性玻璃微電極和膜電位玻璃微電極作為傳感器，將傳感器通過(guò)高輸入阻抗前置放大器連接到動(dòng)態(tài)測(cè)量系統(tǒng)，實(shí)現(xiàn)對(duì)植物細(xì)胞外離子流速、細(xì)胞內(nèi)離子活度以及細(xì)胞膜電位的測(cè)量。

3.1 硅烷化效果測(cè)試

電極硅烷化的效果直接決定了ISME的使用壽命。薛琳[24]通過(guò)大量試驗(yàn)驗(yàn)證了時(shí)間（min）、溫度（℃）、試劑用量（L）等因素對(duì)單管ISME硅烷化效果的影響。發(fā)現(xiàn)當(dāng)硅烷化器皿為100 mL，二甲基二氯硅烷劑量、硅烷化時(shí)間和溫度分別為20L、30～45 min、150 ℃時(shí)，硅烷化的效果最佳，并確定影響硅烷化效果的敏感性因素由大到小依次為硅烷化溫度、硅烷化試劑用量和硅烷化時(shí)間[20]。本研究對(duì)改進(jìn)的雙管ISME進(jìn)行硅烷化時(shí)，發(fā)現(xiàn)在20L、30～45 min、150 ℃的組合參數(shù)下，硅烷化效果并不穩(wěn)定，因此通過(guò)設(shè)計(jì)電極的硅烷化梯度試驗(yàn)，對(duì)雙管ISME的硅烷化參數(shù)進(jìn)行調(diào)整，以找到普適性最強(qiáng)的雙管ISME硅烷化組合參數(shù)。

3.2 能斯特斜率測(cè)試

能斯特斜率是檢驗(yàn)離子選擇性微電極制作成功與否的標(biāo)準(zhǔn)。利用離子選擇性電極檢測(cè)植物細(xì)胞外離子流速和細(xì)胞內(nèi)離子活度前，需要對(duì)電極的能斯特斜率進(jìn)行標(biāo)定。ISME的實(shí)測(cè)能斯特斜率可由電極浸入溶液時(shí)的電位（，mV）與標(biāo)定液中待測(cè)離子的離子活度之間的關(guān)系得到，如式 （3）所示。然后與式（4）得到的理論能斯特斜率值進(jìn)行比較。離子選擇性微電極的實(shí)測(cè)能斯特斜率應(yīng)不小于理論能斯特斜率的90%，否則電極被認(rèn)為不符合工作要求[25]。

式中0為能斯特截距，mV；為能斯特斜率，mV/dec。測(cè)試得到的能斯特斜率與理論值越接近，說(shuō)明電極性能越好。

3.3 響應(yīng)時(shí)間測(cè)試

測(cè)量植物細(xì)胞外離子流速時(shí)，需要將ISME以固定時(shí)間在1與2間2個(gè)固定點(diǎn)間（圖1）做往復(fù)運(yùn)動(dòng)。ISME分別在2個(gè)固定點(diǎn)處短暫停留，分別測(cè)出ISME在1、2處的響應(yīng)電位值。電極在2個(gè)測(cè)量點(diǎn)停留的時(shí)間可由系統(tǒng)設(shè)置，但必須不小于選擇性膜的響應(yīng)時(shí)間。響應(yīng)時(shí)間是指從離子選擇性微電極接觸標(biāo)定液時(shí)起到電極電位穩(wěn)定值的95%所經(jīng)過(guò)的時(shí)間[25]，本研究測(cè)試了K+、Ca2+、H+、Cl-共4種雙管ISME的響應(yīng)時(shí)間，測(cè)試現(xiàn)場(chǎng)如圖5所示。

4 結(jié)果與分析

4.1 最優(yōu)硅烷化參數(shù)

由于硅烷化對(duì)溫度最為敏感，使得硅烷化的效果不容易被控制，因此本研究在課題組先前研究獲取的單管微電極硅烷化參數(shù)的基礎(chǔ)進(jìn)行進(jìn)一步研究[24]，在保持溫度（150 ℃）不變的條件下，通過(guò)調(diào)整硅烷化試劑用量和硅烷化時(shí)間來(lái)獲取最優(yōu)參數(shù)組合。使用的硅烷化器皿容積為100 mL，一次性硅烷化6根電極，硅烷化試劑為二甲基二氯硅烷。由于燒杯材料為高硼硅酸鹽玻璃，因此在首次硅烷化時(shí)對(duì)燒杯進(jìn)行硅烷化處理。處理時(shí)使用硅膠薄膜將燒杯罩住，向燒杯內(nèi)注入200L二甲基二氯硅烷，在150 ℃溫度下烘烤2 h，使燒杯壁完全硅烷化。試驗(yàn)時(shí)，將尖端灌充100m LIX的雙管ISME在溶液中以0.5 Hz的頻率往復(fù)移動(dòng)30 min，顯微鏡下觀察尖端LIX的剩余量，剩余量越多，保持液態(tài)離子交換劑的能力越好。雙管ISME硅烷化梯度試驗(yàn)設(shè)計(jì)如表2所示。

不同種類(lèi)ISME所需的硅烷化條件不同，相對(duì)而言，Ca2+選擇性電極對(duì)電極硅烷化的條件要求并不苛刻，而Cl-選擇性電極隨著應(yīng)用硅烷化試劑量和時(shí)間的增加，測(cè)試時(shí)尖端仍會(huì)有少量的LIX滲出，雖然會(huì)在一定程度上影響尖端電位的穩(wěn)定，但短時(shí)間測(cè)量不會(huì)產(chǎn)生較大影響。由表2試驗(yàn)數(shù)據(jù)可知，使用45L試劑（二甲基二氯硅烷）在150 ℃下烘烤90 min得到的離子選擇性電極保持液態(tài)離子交換劑能力的普適性最強(qiáng)。

注：每組試驗(yàn)的樣本數(shù)為6，液態(tài)離子交換劑剩余量為每組樣本的平均值±標(biāo)準(zhǔn)差；“—”是由于該試驗(yàn)條件下，部分電極尖端的LIX出現(xiàn)分段現(xiàn)象，這是由于“過(guò)硅烷化”導(dǎo)致的，此時(shí)電極不可用。

Note: The number of samples in each group was 6. The remaining amount of the liquid ion exchanger was means ± standard deviation of each set of samples. “—” means the segmentation phenomenon of LIX at some electrode tips under this test condition, which was caused by “hyper-silanization”, and the electrodes were not available at this time.

4.2 能斯特斜率

本研究對(duì)制備的K+、Ca2+、H+、Cl-雙管ISME的能斯特斜率進(jìn)行測(cè)試，其結(jié)果如表3所示。由于溫度的變化會(huì)對(duì)實(shí)際測(cè)得的電極能斯特斜率產(chǎn)生影響，此次試驗(yàn)選定在室溫25 ℃下進(jìn)行。此條件下一價(jià)離子的能斯特斜率理論值的絕對(duì)值為59.16 mV/dec，二價(jià)離子絕對(duì)值為29.28 mV/dec。當(dāng)實(shí)測(cè)能斯特斜率達(dá)到理論能斯特斜率的90%時(shí)，一價(jià)離子實(shí)測(cè)能斯特斜率的絕對(duì)值不小于53.24 mV/dec，二價(jià)離子絕對(duì)值不小于26.35 mV/dec。由表3可知，利用文中方法制作的雙管ISME的實(shí)際能斯特斜率均可以到達(dá)理論值的90%以上，可以滿足植物細(xì)胞外離子流速和細(xì)胞內(nèi)離子活度的測(cè)量要求。表3中離子選擇性微電極的實(shí)際能斯特斜率低于理論值的原因，是由于離子選擇性微電極雖然對(duì)某種離子具有選擇性，但并非僅對(duì)特定離子具有選擇性，即溶液中的同價(jià)離子也有可能被ISME檢測(cè)到，這些離子通常被稱(chēng)為干擾離子。例如，K+選擇性電極對(duì)Na+也具有一定的選擇性，只是該電極對(duì)K+的選擇性更高。此外影響電極實(shí)際能斯特斜率的因素還有很多，例如室內(nèi)溫度過(guò)高或過(guò)低都會(huì)影響電極的實(shí)際能斯特斜率。由于存在諸多因素的影響，從試驗(yàn)中積累的經(jīng)驗(yàn)以及獲取的數(shù)據(jù)上看，對(duì)于實(shí)際能斯特斜率的絕對(duì)值而言，一價(jià)離子（55±5 mV/dec），二價(jià)離子（26 ±3 mV/dec）都是可接受的。

表3 雙管離子選擇性微電極的能斯特斜率測(cè)試結(jié)果

4.3 響應(yīng)時(shí)間

響應(yīng)時(shí)間的測(cè)試結(jié)果如表4所示。響應(yīng)時(shí)間的最大值是決定離子選擇性微電極性能的重要因素。在進(jìn)行離子流速測(cè)量時(shí)，電極響應(yīng)時(shí)間越長(zhǎng)，電極往復(fù)移動(dòng)的時(shí)間間隔就會(huì)越大，電極的數(shù)據(jù)采集頻率就會(huì)越低，這勢(shì)必會(huì)影響到電活動(dòng)快速變化時(shí)離子流速信息的記錄。因此，需要依據(jù)響應(yīng)時(shí)間確定電極的振動(dòng)頻率。試驗(yàn)結(jié)果顯示，Ca2+選擇性電極測(cè)試時(shí)出現(xiàn)了最長(zhǎng)的響應(yīng)時(shí)間為0.42 s，因此電極在測(cè)試時(shí)的停留時(shí)間須高于0.42 s。目前文獻(xiàn)中使用SIET技術(shù)測(cè)試細(xì)胞外離子流速時(shí)，ISME的數(shù)據(jù)采集頻率為0.5 Hz[26-28]，對(duì)應(yīng)的電極的往復(fù)移動(dòng)周期為2 s，此時(shí)電極每次在2個(gè)固定點(diǎn)間的移動(dòng)時(shí)長(zhǎng)為1 s，在2個(gè)測(cè)量點(diǎn)的停留時(shí)間各為0.5 s（大于0.42 s），滿足本研究測(cè)試雙管離子選擇性電極對(duì)響應(yīng)時(shí)間的要求。因此，使用雙管ISME測(cè)試離子流速時(shí)，0.5 Hz是一個(gè)較為合理的數(shù)據(jù)采集頻率。

表4 雙管離子選擇性微電極的響應(yīng)時(shí)間測(cè)試結(jié)果

注：1～8為試驗(yàn)次數(shù)，響應(yīng)時(shí)間為從電極接觸溶液開(kāi)始到接觸電位穩(wěn)定所需時(shí)間的95%。

Note: 1-8 represent the number of tests. Responded time was 95% of the time from the start of the electrode contact with the solution to the stabilization of the contact potential.

5 結(jié) 論

本研究提出了一種簡(jiǎn)易的雙管離子選擇性微電極制備方法，解決了傳統(tǒng)雙管離子選擇性微電極制備過(guò)程繁瑣、不易制備成功的難題。本研究的主要結(jié)論如下：

本研究詳細(xì)介紹了雙管微電極制備和電極尖端灌充液態(tài)離子交換劑的具體流程，并確定雙管微電極的最優(yōu)硅烷化溫度、二甲基二氯硅烷劑量和硅烷化時(shí)間分別為150 ℃、45L和90 min。制備的雙管氫離子、鉀離子、鈣離子、氯離子選擇性微電極的能斯特斜率達(dá)到了54.08、56.51、27.08和-58.80 mV/dec，可以滿足離子選擇性電極使用要求；4種雙管ISME的響應(yīng)時(shí)間介于0.20～0.42 s之間，并以此為依據(jù)確定了離子流速測(cè)量時(shí)電極的移動(dòng)頻率（0.5 Hz）。將雙管離子選擇性微電極制備方法化繁為簡(jiǎn)，有利于促進(jìn)離子選擇性微電極技術(shù)在農(nóng)業(yè)工程、作物育種、生理抗逆以及植物細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)等研究領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用。

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Preparation of double-barreled ion-selective microelectrodes

Li Jinhai1, Xue Lin2, Zhou Qiao1, Huang Lan1, Wang Zhongyi1※

(1.100083,; 2.100101,)

Ion-Selective Microelectrode (ISME) technology has widely been used to evaluate the plant electrical activity in mesoscopic space-time scale, including dynamic measurements on extracellular ion fluxes and intracellular ion activities. But the interference of electromigration or membrane potential changes has posed a great challenge on the traditional single-barreled ISME during the electrophysiological experiments, particularly on the accuracy of measured data. In this study, a double-barreled ISME monitoring scheme was proposed to eliminate the influence of potential drift on the measurement for more accurate information of ion flux. A simple and rapid preparation process of double-barreled ISMEs fabrication was also developed to widen the application of ion-selective electrode technology. Septum Theta (a borosilicate glass capillary with two cavities) was used to fabricate the improved double-barreled microelectrode during preparation, particularly on the silanization and liquid ion exchanger filling in the microelectrode tip of double-barreled ISME. The experimental measurements were conducted for the Nernst slope and response time of double-barreled ISMEs. A standardized feasibility plan was provided for the preparation and performance testing of double-barreled ISMEs. Experimental results showed that the optimal silanization temperature, dimethyldichlorosilane dosage, and silanization time were 150 ℃, 45L, and 90 min, respectively, when the double-barreled microelectrodes were silanized by the steam silane. In this case, the double-barreled ISME that filled 100m liquid ion exchanger in the tip was reciprocated in the test solution at a frequency of 0.5Hz for 30min, where the remaining amount of liquid ion exchanger was observed under the microscope. The remaining amount of liquid ion exchanger was (100±0)m in the double-barreled potassium ion, calcium ion, and hydrogen ISMEs’ tip. In double-barreled chlorine ISMEs, the remaining amount of liquid ion exchanger in the tip was (90±8.2)m. The Nernst slopes of double-barreled hydrogen ion, potassium ion, calcium ion, and chlorine ISMEs were 54.08, 56.51, 27.08, and -58.80 mV/dec, respectively. The measured Nernst slope of ISMEs was more than 90% of the theoretical value suitable for the requirements of the application. The response time of ion-selective electrodes with different liquid ion exchangers was between 0.2 and 0.42 s. Therefore, 0.5 Hz was a reasonable vibration frequency for the measurement of extracellular ion fluxes with the double-barreled ISMEs. The experimental results demonstrated that the double-barreled ISME developed by the improved preparation can well meet the requirements of ISME technology, thereby effectively capturing the extracellular ion fluxes or intracellular ion activities of plant cells. Consequently, the facile preparation of double-barreled ISME can be expected to greatly reduce the experimental difficulty of ISME fabrication. The finding can also provide a great contribution to acquire experimental data of plant physiological detection and applications in agricultural engineering, crop breeding, physiological stress tolerance, and cellular nutrition.

microelectrodes; test; double-barreled ion-selective microelectrodes; silanization; preparation method

李進(jìn)海，薛琳，周橋，等. 雙管離子選擇性微電極制備方法研究[J]. 農(nóng)業(yè)工程學(xué)報(bào)，2021，37(16)：24-30.doi：10.11975/j.issn.1002-6819.2021.16.004 http://www.tcsae.org

Li Jinhai, Xue Lin, Zhou Qiao, et al. Preparation of double-barreled ion-selective microelectrodes[J]. Transactions of the Chinese Society of Agricultural Engineering (Transactions of the CSAE), 2021, 37(16): 24-30. (in Chinese with English abstract) doi：10.11975/j.issn.1002-6819.2021.16.004 http://www.tcsae.org

2021-01-11

2021-05-11

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（61571443）

李進(jìn)海，博士生，研究方向?yàn)樯锵到y(tǒng)感測(cè)與智能裝備。Email：lijinhai@cau.edu.cn

王忠義，博士，教授，研究方向?yàn)樯锵到y(tǒng)感測(cè)與智能裝備。Email：wzyhl@cau.edu.cn

10.11975/j.issn.1002-6819.2021.16.004

O657.15

A

1002-6819(2021)-16-0024-07