HPLC-MS/MS快速檢測(cè)果蔬中多種農(nóng)藥殘留的研究

馮超 姜雅紅

（昌邑市檢驗(yàn)檢測(cè)中心，山東 昌邑 261300）

一、概述

天然阿維菌素由8 個(gè)組構(gòu)成，包含總含量≥80%的A1a、A2a、B1a 和B2a 及總含量≤20%的A1b、A2b、B1b 和B2b。就當(dāng)前生物農(nóng)藥市場(chǎng)而言，阿維菌素有著極高的歡迎度和競(jìng)爭(zhēng)性。目前初級(jí)農(nóng)產(chǎn)品的農(nóng)藥殘留物中，針對(duì)阿維菌素殘留檢測(cè)一直只有獨(dú)立的檢測(cè)方法，提取方法復(fù)雜檢測(cè)效率低且不能同時(shí)與其他農(nóng)殘共同檢測(cè)。

二、課題內(nèi)容

本課題目標(biāo)是建立一種新的超高效液相串聯(lián)質(zhì)譜分析方法同時(shí)檢測(cè)殘留在水果、蔬菜組織中阿維菌素與氨基甲酸酯類、有機(jī)磷類等22 種農(nóng)藥殘留量，實(shí)驗(yàn)首先從樣品前處理入手，考察了不同提取液對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響；其次，分析了固相萃取的最優(yōu)化方法；最后，從檢測(cè)模式、目標(biāo)定量/定性離子選擇、流動(dòng)相的種類和配比三個(gè)方向?qū)?shí)驗(yàn)條件進(jìn)行探索和優(yōu)化。通過測(cè)定，進(jìn)行定量分析，從而找到最佳的實(shí)驗(yàn)方法，提高檢測(cè)效率。

為實(shí)現(xiàn)上述目的本發(fā)明提供一種新的超高效液相串聯(lián)質(zhì)譜分析方法包括：

A 樣品預(yù)處理中目標(biāo)物提取過程優(yōu)化得到最佳提取方案；

B 對(duì)比不同類型固相萃取柱對(duì)干擾物的凈化水平，獲取最佳凈化柱型；

C 電化學(xué)離子源正負(fù)模式下對(duì)目標(biāo)物離子化效率，得到最佳響應(yīng)模式；

D 目標(biāo)物母離子加H+電荷與加Na+電荷在不同流動(dòng)相中的響應(yīng)，獲得最佳定量離子與定性離子及相應(yīng)流動(dòng)相配比。

三、國(guó)內(nèi)外研究現(xiàn)狀

由于阿維菌素的毒性較強(qiáng)和世界各國(guó)逐步對(duì)其的禁用，其在水果蔬菜中的殘留檢測(cè)分析研究成為行業(yè)熱點(diǎn)。因此發(fā)展只需一種方法便可同時(shí)檢測(cè)在同一基質(zhì)中的阿維菌素及氨基甲酸酯類、有機(jī)磷類農(nóng)藥則非常必要。目前，阿維菌素殘留檢測(cè)方法主要是僅針對(duì)其單一化合物的液相色譜-質(zhì)譜法和液相色譜法。

四、研究主要內(nèi)容和結(jié)果

（一）原理

樣品加正己烷飽和乙腈溶液均質(zhì)提取后加氯化鈉離心脫水，提取液過固相萃取柱進(jìn)行凈化后收集流出液氮吹近干后定容，高效液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜測(cè)定，外標(biāo)法定量。

（二）試劑和儀器

除另作說明外，所用試劑均為分析純，實(shí)驗(yàn)用水為一級(jí)水。

1.試劑。甲醇、乙腈、丙酮、二氯甲烷均為色譜純（Fisher 試劑），氯化鈉（國(guó)藥），NH2-Carb 固相萃取柱、NH2 固相萃取柱、弗洛里硅膠固相萃取柱（迪馬科技）。阿維菌素、氧化樂果、多菌靈、涕滅威、內(nèi)吸磷、涕滅威砜、涕滅威亞砜、噠螨靈等各100μL 于10mL 容量瓶中，甲醇定容至10mL，濃度1μg/mL。

2.儀器。液相色譜串聯(lián)三重四級(jí)桿質(zhì)譜聯(lián)用儀（HPLC-MS/MS），配ESI 源（賽默飛世爾科技公司，TSQ-UltraEMR）；冷凍離心機(jī)；固相萃取裝置（安捷倫科技公司）；全自動(dòng)均質(zhì)器（廈門?？疲?；電子天平；旋渦混合器（IKA）；氮吹儀。

（三）分析步驟

1.提取。使用50mL 具塞離心管稱取20g 樣品，加入7g 氯化鈉（分析純），加入20mL 正己烷飽和乙腈（色譜純）溶液，漩渦混合30S，使用均質(zhì)器8000-10000r/min 均質(zhì)5min。完成后轉(zhuǎn)移至低溫離心機(jī)6000r/min 離心5min。離心完成后，取乙腈上清液10mL，氮吹（40℃）近干，殘余物用3mL2%二氯甲烷的甲醇溶液復(fù)溶。

2.凈化。將NH2固相萃取柱（500mg/6mL）用5mL甲醇活化，加入復(fù)溶液，收集所有流出液氮吹（40℃）近干，用甲醇水（50+50）1mL 定溶，過0.22μm有機(jī)濾膜上機(jī)測(cè)定。

3.測(cè)定。液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜參考條件：

a.色譜柱：C18 超細(xì)柱，100 mm×1.9 mm（內(nèi)徑），粒度<5μm。

b.流動(dòng)相：甲醇+2mmol/L 乙酸銨的甲酸水溶液（0.2%）=10+90。10min，配比互換梯度洗脫。

c.流速：0.30 mL/min。

d.柱溫：40℃。

e.進(jìn)樣量：5μL。

f.離子源：電化學(xué)離子源（ESI 源），正離子監(jiān)測(cè)模式。

計(jì)算樣品中阿維菌素及各類目標(biāo)物殘留量：

X=cv/1000m

X-試樣中各種農(nóng)殘目標(biāo)物殘留量，單位為毫克每千克（mg/kg）

c-標(biāo)準(zhǔn)工作液中各種農(nóng)殘目標(biāo)物的濃度，單位為納克每毫升（ng/ml）

v—試樣的提取液體積，單位為毫升（ml）。

m—最終試樣提取液代表的試樣稱重量，單位為克（g）。

五、結(jié)果與討論

（一）提取劑嘗試了丙酮、甲醇、乙腈、二氯甲烷，由于各類目標(biāo)物在不同溶劑中的溶解度不同，為最大效率的提高提取效率，對(duì)比了多種提取劑及混合提取劑：丙酮揮發(fā)性強(qiáng)，在均質(zhì)過程中不能與樣品充分接觸；二氯甲烷有較強(qiáng)毒性；甲醇能夠樣品中的水互溶，缺少有效分離方法；乙腈能夠充分溶解阿維菌素及各類目標(biāo)物，且與飽和氯化鈉溶液互相不容，毒性相對(duì)較輕。綜合了各方面的條件，最終確定正己烷飽和乙腈作為提取溶劑。

（二）固相萃取柱及洗脫溶液比對(duì)，通過嘗試NH2 柱、PSA 柱、弗洛里硅膠柱、NH2-Carb 復(fù)合柱和不同種類的洗脫液配比。弗洛里柱僅對(duì)有機(jī)氯類農(nóng)殘干擾物保留效果明顯，對(duì)色素有機(jī)酸保留能力一般。PSA 柱對(duì)多種干擾物有較強(qiáng)保留，但價(jià)格相對(duì)昂貴，性價(jià)比不高。NH2柱對(duì)有機(jī)酸、色素、脂肪酸等目標(biāo)干擾物有較好的保留能力，且對(duì)目標(biāo)物農(nóng)殘保留能力較弱，性價(jià)比高，但對(duì)綠葉菜、火龍果等葉綠素、花青素色素含量較高樣品凈化能力不足，此時(shí)應(yīng)使用NH2-Carb 復(fù)合柱進(jìn)行樣品凈化。洗脫溶液嘗試了甲醇，乙腈，以及二氯甲烷甲醇混合液，乙腈洗脫能力過強(qiáng)，干擾物無法保留在柱子上，降低了凈化效果；純甲醇需用較大體積洗脫，才能有效將目標(biāo)物淋洗下來；我們?cè)囍诩状既芤褐刑砑?%-5%的二氯甲烷，通過比對(duì)發(fā)現(xiàn)二氯甲烷配比在2%時(shí)，只需3-4mL 洗脫液便可有效將殘余目標(biāo)物從氨基柱上洗脫下來。最終優(yōu)化后的凈化條件為：氨基凈化柱，2%二氯甲烷的甲醇洗脫液。

（三）質(zhì)譜條件優(yōu)化

GB 23200.20-2016 中，檢測(cè)阿維菌素殘留物的質(zhì)譜條件為電化學(xué)離子源（APCI 源），負(fù)離子模式。APCI 源能夠?qū)⒎菢O性化合物較好的離子化，且負(fù)離子模式相較正離子模式狀態(tài)下的檢測(cè)器對(duì)目標(biāo)化合物的響應(yīng)相對(duì)偏低，但也相對(duì)正離子模式引入的干擾噪音減少更大。但考慮到兼顧有機(jī)磷、有機(jī)氯、氨基甲酸酯類多種農(nóng)殘的檢測(cè)，選擇了更容易電離多種化合物的電化學(xué)離子源（ESI 源），正離子模式，并通過調(diào)整目標(biāo)物離子對(duì)，使得質(zhì)譜儀對(duì)阿維菌素及各類農(nóng)殘有較好的響應(yīng)。阿維菌素在ESI 源電離下存在加H+離子碎片和加Na+離子碎片；但我們?cè)诹鲃?dòng)相中引入了乙酸銨，因此可以獲得響應(yīng)較好的加NH3+離子碎片，既保證了對(duì)干擾物的有效去除，同時(shí)兼顧了儀器響應(yīng)大小，以此作為定量離子。

（四）液相色譜分離條件優(yōu)化，現(xiàn)有國(guó)標(biāo)方法用乙腈+水作為流動(dòng)相，但乙腈在C 18 超細(xì)柱上的洗脫能力過強(qiáng)，各類目標(biāo)物在液相色譜柱上的保留時(shí)間相對(duì)過于集中容易使目標(biāo)物與雜質(zhì)共同進(jìn)入質(zhì)譜，影響質(zhì)譜儀對(duì)目標(biāo)物的響應(yīng)，且乙腈毒性較強(qiáng)。甲醇毒性相對(duì)乙腈更低，其略低于乙腈對(duì)目標(biāo)物的洗脫能力，能夠有效實(shí)現(xiàn)目標(biāo)物與基質(zhì)中雜質(zhì)干擾的有效分離，且有效保證各目標(biāo)物保留時(shí)間相對(duì)合理分布。

（五）最低檢出限

以3 倍信噪比計(jì)算，確定本方法對(duì)阿維菌素及各類農(nóng)殘的最低檢出限為2.0μg/kg。使用本方案可在盡短時(shí)間內(nèi)有效同時(shí)檢測(cè)在同一基質(zhì)中的阿維菌素及有機(jī)磷、氨基甲酸酯類農(nóng)藥。

（六）準(zhǔn)確性考察（加標(biāo)回收率測(cè)定）

分別以陰性果蔬樣品作為基質(zhì)進(jìn)行加標(biāo)回收定量實(shí)驗(yàn)，稱取樣品20g，且做平行實(shí)驗(yàn)。分別在樣品中混入2.0μg/kg 和20.0μg/kg 兩種級(jí)別濃度的標(biāo)準(zhǔn)混合溶液，充分混勻，按照本方法的操作步驟進(jìn)行測(cè)試。上機(jī)測(cè)試結(jié)果：

1.樣品添加水平在2.0μg/kg 時(shí)，各組分檢出值：阿維菌素1.92、氧化樂果2.10、多菌靈1.94、涕滅威2.03、噻蟲嗪1.96、涕滅威砜1.95、涕滅威亞砜1.93、吡蟲啉1.94、克百威1.92、3-羥基克百威2.04、啶蟲脒2.06、滅多威1.94、敵百蟲1.96、內(nèi)吸磷1.94、速滅威1.98、甲萘威2.07、異丙威2.04、仲丁威2.10、嘧霉胺2.10、甲氨基阿維菌素2.07、噠螨靈2.10（μg/kg）；所有農(nóng)藥殘留目標(biāo)物的回收率均在96.2%-105.2%之間。

2.樣品添加水平在20.0μg/kg 時(shí)，各組分檢出值：阿維菌素19.5、氧化樂果20.7、多菌靈20.4、涕滅威18.6、噻蟲嗪20.5、涕滅威砜18.5、涕滅威亞砜18.8、吡蟲啉18.8、克百威18.6、3-羥基克百威19.0、啶蟲脒19.8、滅多威18.8、敵百蟲20.3、內(nèi)吸磷19.8、速滅威19.0、甲萘威19.3、異丙威20.6、仲丁威20.8、嘧霉胺21.2、甲氨基阿維菌素20.4、噠螨靈19.5（μg/kg）；所有農(nóng)藥殘留目標(biāo)物的回收率均在92.5%-104.2%之間。

可見測(cè)定結(jié)果和回收率，測(cè)定結(jié)果符合農(nóng)藥殘留物檢測(cè)定性定量分析的要求。

（七）精密度考察

實(shí)驗(yàn)采用陰性樣品進(jìn)行阿維菌素、有機(jī)磷、有機(jī)氯、氨基甲酸酯等21 種農(nóng)藥殘留物的添加水平為10μg/kg 時(shí)，連續(xù)六次測(cè)定，RSD 分別為阿維菌素1.32%、氧化樂果1.59%、多菌靈1.52%、涕滅威2.31%、噻蟲嗪1.81%、涕滅威砜2.5%、涕滅威亞砜2.3%、吡蟲啉1.63%、克百威1.23%、3-羥基克百威1.57%、啶蟲脒1.59%、滅多威1.61%、敵百蟲2.1%、內(nèi)吸磷2.7%、速滅威2.63%、甲萘威2.64%、異丙威2.12%、仲丁威2%、嘧霉胺2.64%、甲氨基阿維菌素2.58%、噠螨靈2.1%，表明儀器穩(wěn)定性良好。

六、結(jié)論

從樣品前處理入手，確定正己烷飽和乙腈溶液作為提取溶劑；其次，分析了固相萃取的凈化條件為：氨基凈化柱，2%二氯甲烷的甲醇洗脫液。最后，從檢測(cè)模式、目標(biāo)定量/定性離子選擇、流動(dòng)相的選擇和配比三個(gè)方向?qū)?shí)驗(yàn)條件進(jìn)行探索和優(yōu)化，確定了ESI 源正離子模式和主要目標(biāo)物離子對(duì)，流動(dòng)相為甲醇+2mmol/L 乙酸銨的甲酸水溶液（0.2%）配比10+90，配比互換梯度洗脫。結(jié)果表明：該方法操作簡(jiǎn)便、提取效率高、具有高準(zhǔn)確性和重復(fù)性，適用于水果蔬菜等農(nóng)產(chǎn)品中同時(shí)檢測(cè)阿維菌素、有機(jī)磷和氨基甲酸酯類農(nóng)藥殘留量的定性、定量分析測(cè)定。