β細胞替代治療1型糖尿病的研究進展

楊靜靜，戎成振，蔣 影，曹秀菁

(1.阜陽市第二人民醫(yī)院 a.內(nèi)分泌科；b.心內(nèi)科；c.檢驗科, 安徽 阜陽 236000；2.安徽醫(yī)科大學(xué)，安徽 合肥 230032)

1型糖尿病患者治療的主要目標是使其血糖保持在最佳的范圍，避免嚴重低血糖、酮癥發(fā)生，延緩糖尿病慢性并發(fā)癥的發(fā)生。很多患者通過強化胰島素治療可達到這一目標，但對于病程長、腎功能下降的患者卻經(jīng)常發(fā)生胰島素治療后的低血糖事件。β細胞替代治療可通過恢復(fù)胰島素水平，以及調(diào)整影響血糖的相關(guān)激素，調(diào)節(jié)胰島素分泌來維持血糖水平的正常波動。診斷排除糖尿病的供體，其提供的胰腺細胞進行移植可明顯改善1型糖尿病患者血糖波動。移植后通過免疫抑制來預(yù)防自身免疫和同種免疫反應(yīng)，通常會使血糖持續(xù)維持在正常水平。胰腺移植有巨大的手術(shù)并發(fā)癥風(fēng)險，其中大部分與胰腺的外分泌組織有關(guān)。1999年, 在加拿大的埃德蒙頓, Shirpiro等將分離、純化后的胰島移植給7例糖尿病患者, 2003年末, 由美國國立衛(wèi)生研究院(National Institutes of Health, NIH)免疫耐受網(wǎng)牽頭的多中心臨床研究顯示, 在給予30例1型糖尿病患者54次胰島輸注后, 其中有隨訪資料的17例患者平均糖化血紅蛋白A1c(hemoglobin A1c, HbA1c)為6.1%, 均無需胰島素治療, 其中4例患者不依賴胰島素治療達2年余。2005年1月20日報道日本京都大學(xué)醫(yī)院19日成功完成了世界首例活體胰島細胞移植手術(shù)。接受移植的是1例20歲左右的女性糖尿病重癥患者，移植用的胰島細胞來自她的母親。中國胰島移植研究方興未艾，海軍軍醫(yī)大學(xué)附屬長征醫(yī)院完成胰島移植的數(shù)量及療效位居國內(nèi)第一。此外，長征醫(yī)院與上海仁濟醫(yī)院、瑞金醫(yī)院合作開展了6例胰島移植；深圳、青島、安徽等地的胰島移植手術(shù)也已經(jīng)陸續(xù)開展。天津市第一中心醫(yī)院成功完成全國首例小兒胰島移植。供體器官短缺是全世界移植領(lǐng)域的共同難題, 它同樣也嚴重制約了胰島移植的開展。隨著分離技術(shù)不斷改進, Edmonton方案推廣以來, 從一個移植受者需接受2～3個供體的胰腺, 到目前使用單個胰腺已能成功移植。

胰島移植的侵入性較小，其替代胰島素治療1型糖尿病的潛力也得到了充分證明，Shapiro等[1]研究結(jié)果表明，胰島移植可以使患者胰島素更好發(fā)揮作用，具有良好的代謝控制作用，對于患嚴重的低血糖或血糖控制不佳引起的意識障礙的1型糖尿病患者，胰島移植是有效的治療方法之一，對于低血糖引起的意識障礙有很好的預(yù)防作用[2]，一項隨機臨床試驗也證實了胰島移植相比于單用胰島素治療，對嚴重的1型糖尿病患者起有效的干預(yù)作用[3]，1型糖尿病患者經(jīng)常發(fā)生嚴重的低血糖時，啟用肝內(nèi)胰島移植可長期有效改善血糖控制水平和低血糖癥狀，有助于血糖的穩(wěn)定[4]。胰島移植治療晚期1型糖尿病療效確切，創(chuàng)傷小、安全性高[5]，可改善糖尿病患者周圍感覺神經(jīng)的傳導(dǎo)速度[6]。在血糖波動較大的嚴重低血糖患者中，胰島移植后血糖得到了更好的控制，對患者是否發(fā)生慢性并發(fā)癥及生存時間產(chǎn)生更大的影響[7]，降低了低血糖頻率和血糖變異性。本文旨在介紹β細胞替代治療1型糖尿病的方法、β細胞替代的來源以及如何解決和避免潛在的移植后免疫抑制。

1 β細胞替代：胰島分離及胰島移植

β細胞替代最主要的一種方法就是同種異體胰島移植，旨在通過將胰島植入到胰島素缺乏型糖尿病患者體內(nèi)，以補充胰島素缺乏糖尿病患者體內(nèi)適當(dāng)?shù)囊葝u素、胰高血糖素等，這種情況最常見于1型糖尿病患者。胰島移植通過匿名多器官捐贈獲得的胰島與已故捐贈者的胰腺分離。在極少數(shù)情況下，部分胰腺切除術(shù)會從一個活體的相關(guān)供體中分離出胰島，約43%的最初身體健康的捐贈者在部分胰腺切除術(shù)后會出現(xiàn)葡萄糖耐受不良[8]，由于手術(shù)和代謝風(fēng)險較高，因此通常不使用該技術(shù)。胰島移植根據(jù)標準化技術(shù)，基于酶和機械消化法分離胰島，然后進行密度梯度純化[9]，如果獲得的胰島數(shù)量超過20萬，則通常將其釋放出來進行移植，并對胰島活力、純度、組織體積和無菌性進行可行性的評估。胰島移植制備過程中，需要提高移植胰島的純度，降低移植胰島的組織量[10]。胰島隔離技術(shù)是由很少機構(gòu)(主要在北美，歐洲和澳大利亞)進行的，考慮到胰島隔離小組有必要 24小時提供服務(wù)以及移植涉及復(fù)雜的協(xié)調(diào)工作，相關(guān)協(xié)調(diào)工作需要高度專業(yè)化的配套設(shè)施。胰腺的采購和運輸應(yīng)盡量減少冷缺血時間，胰島設(shè)施可以將胰島運送到區(qū)域中心進行移植。

從已故的供者胰腺中分離出胰島，在通過微創(chuàng)切開或經(jīng)皮肝穿刺門靜脈插管，然后通過1型糖尿病患者門靜脈注入分離的胰島以輸送至肝臟[11]，常規(guī)抗凝預(yù)防血栓，可能需要輸注2～3個胰島制劑(胰島素目標是受體體重至少9 000 U/kg)，盡管一些中心報告說，當(dāng)從單個供體胰腺移植胰島時，獲得胰島素獨立性的患者比例很高，至少要移植胰島6 000 U/kg。胰島移植需要國家監(jiān)管機構(gòu)，器官采購組織，組織分型實驗室，胰島分離設(shè)施以及移植手術(shù)，內(nèi)分泌科和放射介入科之間密切合作。

隨著全球應(yīng)用干細胞治療疾病已經(jīng)積累了大量成功有效案例，干細胞也成為了繼手術(shù)和藥物之后，新的糖尿病治療方向。胰島內(nèi)灌注干細胞治療，結(jié)果導(dǎo)致糖尿病患者代謝控制增強，胰島素需求減少[12]。亦有研究表明：干細胞治療治療與Th1、Th17細胞的增殖和功能下降有關(guān)，效果優(yōu)于傳統(tǒng)的胰島素強化治療[13]。目前為止，在世界范圍內(nèi)間充質(zhì)干細胞治療糖尿病的臨床案例確實已經(jīng)有了數(shù)千例，而這些公開的案例表明干細胞治療糖尿病這一療法確實能夠使糖尿病患者的病情得到一定程度上的逆轉(zhuǎn)，同時對胰島素的依賴也是大大的降低。經(jīng)后期隨訪，采用了干細胞療法的糖尿病患者，胰島功能有了明顯的恢復(fù)，對胰島素的依賴大幅度降低，且能很好地控制體內(nèi)的血糖。在長期隨訪中發(fā)現(xiàn)，接受干細胞療法的糖尿病患者最長能夠連續(xù)3年不再依賴胰島素。并且在臨床上這一療法沒有任何不良反應(yīng)。相信干細胞治療糖尿病及其并發(fā)癥的實現(xiàn)轉(zhuǎn)化應(yīng)用不會太遙遠。

2 β細胞替代治療后的免疫抑制

免疫抑制包括在每次輸注胰島時的誘導(dǎo)階段，然后是在胰島移植整個生命周期中的維持階段，通常不使用糖皮質(zhì)激素。胰島移植的第一個臨床上成功的方案，即所謂的埃德蒙頓方案，包括在每次輸注胰島之前聯(lián)合應(yīng)用抗白細胞介素 2(IL-2)受體抗體(一種T細胞激活抑制劑)、西羅莫司(一種mTOR抑制劑)和小劑量他克莫司(一種鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶抑制劑)[1]。 自2000年首次應(yīng)用以來，該方案的衍生方案相繼發(fā)布。這些方案的變體包括使用不同的誘導(dǎo)劑，例如T細胞耗竭劑(抗淋巴細胞免疫球蛋白，阿倫單抗、抗-CD3單克隆抗體teplizumab)或淋巴細胞追蹤抑制劑(依法利珠單抗)[14-15], 以及使用其他維持治療組合方案：抗胸腺球蛋白聯(lián)合阿那白滯素抗炎藥誘導(dǎo)，以及他克莫司聯(lián)合霉酚酸酯維持治療(T細胞耗竭伴抗炎方案：TCD-AI)[16]。

3 β細胞替代治療移植監(jiān)測

移植監(jiān)測的目的是使用最小限度的免疫抑制藥物，監(jiān)測移植排斥反應(yīng)和自身免疫的復(fù)發(fā)，篩查與糖尿病或免疫抑制有關(guān)的并發(fā)癥，尤其是機會性感染和腫瘤形成，并評估胰島移植恢復(fù)代謝平衡的有效性。始終如一的移植后監(jiān)測是必不可少的，早期每周1次，以后每月1次，隨后定期探訪或與患者預(yù)約門診監(jiān)測，與胰腺移植相比，胰島無法進行活檢。因此，胰島排斥反應(yīng)主要通過降低C肽濃度來表示，這與代謝控制的惡化有關(guān)。盡管已經(jīng)嘗試了類固醇和利妥昔單抗的治療，但急性排斥反應(yīng)的治療仍然困難。利用多功能液相芯片分析系統(tǒng)技術(shù)密切監(jiān)測胰島移植患者的循環(huán)人類白細胞抗原(human leucocyte antigen, HLA)抗體，可以及時發(fā)現(xiàn)和有效治療胰島移植排斥反應(yīng)。監(jiān)測細胞免疫反應(yīng)性可用于確定影響移植物存活的因素，并評估免疫抑制的有效性[17]。移植胰島組織外體平臺可作為監(jiān)測胰島細胞移植患者臨床標準的輔助手段，可為胰島損傷的早期診斷提供幫助，并有助于區(qū)分損傷類型(復(fù)發(fā)性自身免疫或免疫排斥反應(yīng))，從而為治療干預(yù)提供了一個更早的窗口。

4 β細胞替代治療局限性和未來的方向

4.1替代胰島來源 盡管β細胞替代治療-同種異體胰島移植是公認的替代方法，但由于胰島分離的供者胰腺的可用性以及區(qū)域分離設(shè)施對移植計劃的可及性，限制了胰島移植的發(fā)展。胰島來源的發(fā)展使按需、無限量生產(chǎn)細胞產(chǎn)品成為可能，這將極大地擴展獲得β細胞替代療法的機會。盡管如此，這種胰島來源仍必須克服重要的安全問題和生產(chǎn)效率低下的問題。

豬胰島是可移植的胰島中的異種來源，并且在生理上保持與人類相似度。但是，異種組織的移植比同種異體組織的移植具有更大的免疫學(xué)障礙，存在超急性排斥反應(yīng)的風(fēng)險，需要加強免疫抑制。異種移植還引入了傳播人畜共患病感染(如豬內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒)的隱患。新的基因組編輯方法正在嘗試改造具有比目前更低的免疫原性和逆轉(zhuǎn)錄病毒負擔(dān)的豬胰島，以增強該細胞來源的潛在功效和安全性。人類干細胞分化為產(chǎn)生胰島素的胰島，為胰島移植提供了另一個潛在的細胞來源，人胚胎干細胞可以在體外分化為胰腺內(nèi)胚層祖細胞。在小鼠模型中移植后，胚胎干細胞進一步分化為胰腺內(nèi)胚層祖細胞階段，體內(nèi)分化為胰島組織及β細胞[18]。聯(lián)合移植的脂肪間充質(zhì)干細胞具有改善胰島移植物功能, 延長移植物存活時間及促進移植物血管再生的作用[19]，從干細胞中獲得的胰島也已經(jīng)從1型糖尿病患者中分化出來，使用可誘導(dǎo)的多潛能干細胞誘導(dǎo)產(chǎn)生β細胞[20]和體細胞核移植[21]，這可能會消除同種免疫。然而，自身免疫性復(fù)發(fā)是任何人類組織來源所面臨的障礙。

4.2替代植入部位 肝是同種異體胰島移植已建立的最有效的胰島植入部位，并且該部位在臨床大動物模型的豬胰島移植中非常成功。對于這種成熟的胰島細胞產(chǎn)品，不需要用于監(jiān)視細胞身份的通道，1型糖尿病患者將胰島成功植入肝外的唯一案例是使用生物人工凝血酶支架制成的網(wǎng)膜袋，這對于門靜脈內(nèi)胰島輸送禁忌證的患者可能有用。然而，大網(wǎng)膜的位置并不比肝臟更容易進入，而肝臟對于活檢監(jiān)測或提取可能需要干細胞來源的胰島。利用前臂肱二頭肌進行肌內(nèi)移植的病例顯示自體胰島的存活率。 動物實驗結(jié)果顯示：胰島移植的部位可選擇腸系膜下、腎被膜下[22-23]、以及胃漿膜下層[24]，骨髓移植[25]。為更有效的治療，需要發(fā)明出能夠抑制缺氧導(dǎo)致的胰島細胞死亡并促進快速血運重建的生物支架。

4.3免疫抑制的替代方法 慢性免疫抑制的限制了目前胰島移植的適應(yīng)證，主要是患有嚴重低血糖事件并伴有低血糖意識障礙的患者，在1型糖尿病患者中此類患者占比不到10%。胸腺球蛋白誘導(dǎo)的免疫抑制方案、以及鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶抑制劑/類固醇保留胰島方案導(dǎo)致長期胰島素獨立，這種新的免疫抑制方案是有效的，且耐受性好，可能是改善移植胰島功能和壽命的有效替代方案，同時最小化腎細胞毒性[26]。胰島素的獨立性的長期維持僅需很少的免疫抑制藥物，在此種情況下，沒有維持免疫抑制的藥物可支持實現(xiàn)對胰島移植的耐受性。

持續(xù)建立對同種抗原和自身抗原的免疫耐受誘導(dǎo)，以用于治療1型糖尿病的細胞療法，在此之前，一直用封裝設(shè)備進行胰島細胞產(chǎn)物的免疫分離。源自人類胚胎干細胞的胰腺內(nèi)胚層細胞，皮下放置在1型糖尿病患者的細胞不可滲透裝置中，表明這些細胞的存活由于纖維化異物反應(yīng)而大大降低，通過大囊化免疫隔離具有在設(shè)備中裝有可再填充的氧氣室后，才能維持1型糖尿病患者的胰島生存。有研究報道：在無任何免疫抑制的情況下，用生物人工胰腺裝置在糖尿病靈長類動物中成功和安全地移植豬胰島[27]。動物實驗表明，γδT細胞在胰島移植后保持移植胰島的存活，維持血糖穩(wěn)定起到重要作用，給胰島移植后免疫誘導(dǎo)免疫耐受奠定基礎(chǔ)[28]。

β細胞替代治療1型糖尿病已經(jīng)證明長期有效，胰島移植作為β細胞替代治療1型糖尿病主要方法之一，既可以減輕1型糖尿病患者不穩(wěn)定的糖尿病的血糖負擔(dān)，又可以預(yù)防長期的糖尿病相關(guān)并發(fā)癥的發(fā)生。對于患有嚴重低血糖事件并發(fā)低血糖意識障礙的1型糖尿病患者，同種異體胰島移植是一種安全的治療選擇。胰島移植的途徑受到胰腺細胞供者的數(shù)量、胰島分離的可用性和免疫抑制的限制。β細胞替代治療1型糖尿病的未來的方法可能包括胰島的替代來源，肝外植入部位以及誘導(dǎo)免疫耐受或免疫隔離，但這些方法仍需要更高級別的臨床試驗得以證實。