高效液相色譜法測定磷脂復(fù)合物中硫酸特布他林的含量

李薔薇,雷 瑩,劉 婧,李 維*,李 強

(1.成都大學(xué) 藥學(xué)院 四川抗菌素工業(yè)研究所 抗生素研究與再評價四川省重點實驗室,成都 610052;2.國藥集團川抗制藥有限公司,成都 610052)

硫酸特布他林,化學(xué)名為[(叔丁氨基)甲基]-3,5-二羥基苯甲醇硫酸鹽(2∶1),又名博利康尼,其結(jié)構(gòu)式見圖1。硫酸特布他林為白色或類白色結(jié)晶性粉末,無臭,或微有乙酸味,遇光逐漸變色,在水中易溶,在甲醇中微溶,在三氯甲烷中幾乎不溶[1]。硫酸特布他林對腎上腺素β2受體具有高度選擇性,適用于支氣管哮喘、慢性支氣管炎、肺氣腫和其他伴有支氣管痙攣的肺部疾病的治療,在國內(nèi)外已得到廣泛的應(yīng)用[2]。

硫酸特布他林目前常見的劑型是霧化液和片劑,但其生物利用度較低。本課題組前期采用硫酸特布他林原料和大豆磷脂制備了一種生物利用度較高的磷脂復(fù)合物,該復(fù)合物可增加藥物分子的親脂性,促進藥物吸收,從而提高了磷酸特布他林的生物利用度。

目前,磷酸特布他林的測定方法主要有高效液相色譜法(HPLC)[1-7]和紫外-可見分光光度法(UVVis)[8]。UV-Vis簡單快捷,但選擇性和靈敏度較差,不能將硫酸特布他林與大豆磷脂及其他物質(zhì)有效分離,具有一定的局限性;HPLC選擇性和靈敏度高,可將硫酸特布他林與大豆磷脂及其他物質(zhì)較好地分離,并測定其含量[8]。本工作在前期制備好的硫酸特布他林磷脂復(fù)合物的基礎(chǔ)上,參考《中華人民共和國藥典》2020年版,通過優(yōu)化色譜條件,建立了HPLC測定磷脂復(fù)合物中硫酸特布他林含量的方法。

1 試驗部分

1.1 儀器與試劑

1200型高效液相色譜儀,配紫外吸收檢測器;UV-2450型紫外-可見分光光度計;XSE105 Dual-Range型電子天平;FE28型p H計;DF-101S型集熱式恒溫加熱磁力攪拌器;Rotavapor R-114型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀。

辛烷磺酸鈉溶液:6.5 mmol·L－1,稱取辛烷磺酸鈉1.522 9 g,用水溶解并定容至1 L容量瓶中,配制成濃度為6.5 mmol·L－1的辛烷磺酸鈉溶液。

硫酸特布他林對照品儲備溶液:1.042 9 g·L－1,稱取硫酸特布他林對照品10.429 mg,加入1 mL水溶解,再用體積比為35∶65的乙腈-6.5 mmol·L－1辛烷磺酸鈉溶液的混合液(p H 3.4)定容至10 mL容量瓶中,搖勻,避光保存。

硫酸特布他林對照品溶液:104.3 mg·L－1,移取1 mL硫酸特布他林對照品儲備溶液于10 mL容量瓶中,用體積比為35∶65的乙腈-6.5 mmol·L－1辛烷磺酸鈉溶液的混合液(p H 3.4)稀釋至刻度,搖勻,避光保存。

大豆磷脂溶液:2.0 g·L－1,稱取大豆磷脂200 mg于10 mL容量瓶中,用甲醇溶解并稀釋至刻度,搖勻,再移取上述溶液1 mL于10 mL容量瓶中,用體積比為35∶65的乙腈-6.5 mmol·L－1辛烷磺酸鈉溶液的混合液(p H 3.4)稀釋至刻度,搖勻,避光保存。

硫酸特布他林對照品溶液系列:分別移取0.5,1.0,2.5,5.0,10.0,25.0,50.0 mL硫酸特布他林對照品儲備溶液,用體積比為35∶65的乙腈-6.5 mmol·L－1辛烷磺酸鈉溶液的混合液(p H 3.4)稀釋,并定容至100 mL容量瓶中,配制成質(zhì)量濃度為 5.2,10.4,26.1,52.1,104.3,260.7,521.4 mg·L－1的硫酸特布他林對照品溶液系列。

硫酸特布他林對照品的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為99.8%;硫酸特布他林原料的純度為99.2%;辛烷磺酸鈉為分析純;乙腈、甲醇為色譜純;大豆磷脂為化學(xué)純;試驗用水為超純水。

1.2 儀器工作條件

AQUASIL?-C18色譜柱(250 mm×4.6 mm,5μm);柱溫30℃;流量1.0 mL·min－1;進樣量20μL;流動相為體積比為35∶65的乙腈-6.5 mmol·L－1辛 烷 磺 酸 鈉 溶 液 的 混 合 液(p H 3.4),等度洗脫;檢測波長280 nm。

1.3 試驗方法

稱取自制的硫酸特布他林磷脂復(fù)合物210 mg,用甲醇溶解并定容至10 mL容量瓶中,搖勻,再移取上述溶液1 mL于10 mL容量瓶中,用體積比為35∶65的乙腈-6.5 mmol·L－1辛烷磺酸鈉溶液的混合液(p H 3.4)稀釋至刻度,搖勻,避光保存,得到硫酸特布他林供試品溶液,按照儀器工作條件進行測定[4-10],外標(biāo)法定量。

2 結(jié)果與討論

2.1 檢測波長的選擇

采用紫外-可見分光光度計,在檢測波長190～400 nm內(nèi)對硫酸特布他林對照品溶液、硫酸特布他林供試品溶液和大豆磷脂溶液進行掃描,以確定硫酸特布他林磷脂復(fù)合物的最大吸收波長,結(jié)果見圖2。

圖2 紫外-可見吸收光譜Fig.2 UV-Vis absorption spectrum

由圖2可知,大豆磷脂溶液在210～220 nm內(nèi)有干擾,并且211 nm附近屬于末端吸收,容易產(chǎn)生雜峰;硫酸特布他林對照品溶液和硫酸特布他林供試品溶液在280 nm處均有紫外吸收,而大豆磷脂溶液在280 nm處無紫外吸收,因此試驗選擇檢測波長為280 nm。

2.2 流動相的選擇

當(dāng)流動相p H大于4.4時,目標(biāo)物開始出現(xiàn)肩峰,可能是硫酸特布他林在堿性條件下被氧化所致;當(dāng)流動相p H調(diào)整至3.4時,目標(biāo)物的肩峰消失。因此,試驗選擇流動相p H為3.4。

由于流動相的酸度與辛烷磺酸鈉濃度的變化對磷酸特布他林保留時間的影響較小,而乙腈用量變化1%則會引起硫酸特布他林保留時間變化約10%[3],進而影響硫酸特布他林與大豆磷脂的分離,因此在流動相p H 3.4條件下,試驗考察了不同體積比(10∶90,15∶85,20∶80,25∶75,30∶70,35∶65)的乙腈-6.5 mmol·L－1辛烷磺酸鈉溶液的混合液對硫酸特布他林分離效果的影響。結(jié)果顯示,當(dāng)乙腈-6.5 mmol·L－1辛烷磺酸鈉溶液的混合液體積比為35∶65時,硫酸特布他林的峰形較好,與大豆磷脂的分離度較高,因此試驗選擇流動相體積比為35∶65。

2.3 專屬性試驗

按照儀器工作條件對硫酸特布他林供試品溶液、硫酸特布他林對照品溶液、大豆磷脂溶液和流動相進行測定,所得色譜圖見圖3。

圖3 專屬性試驗結(jié)果Fig.3 Results of specificity test

由圖3可知,大豆磷脂溶液和流動相對硫酸特布他林色譜峰均無干擾,說明該方法的專屬性較好。大豆磷脂和硫酸特布他林的保留時間分別為3.150,5.798 min,分離度為4.6,硫酸特布他林的峰形較好,理論塔板數(shù)大于3 000。

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線與檢出限

按照儀器工作條件對硫酸特布他林對照品溶液系列進行測定,以硫酸特布他林的質(zhì)量為橫坐標(biāo),其對應(yīng)的峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果顯示,硫酸特布他林的質(zhì)量在0.104 3～10.429 0μg內(nèi)與其對應(yīng)的峰面積呈線性關(guān)系,線性回歸方程為y＝392.6 x,相關(guān)系數(shù)為0.999 9。

以3倍信噪比(S/N)和10倍信噪比計算方法的檢出限(3S/N)和測定下限(10S/N),結(jié)果得硫酸特布他林的檢出限為1.565 9 ng,測定下限為5.219 7 ng。

2.5 精密度和回收試驗

按照試驗方法對質(zhì)量濃度為104.3 mg·L－1的硫酸特布他林對照品溶液連續(xù)測定5次,計算得峰面積的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為0.18%,表明該方法精密度良好。

配制3個濃度水平的硫酸特布他林供試品加標(biāo)溶液,并將其稀釋至線性范圍內(nèi),按儀器工作條件進行測定,計算回收率,結(jié)果見表1。

2.6 重復(fù)性和穩(wěn)定性試驗

按照儀器工作條件對硫酸特布他林供試品溶液重復(fù)測定5次,記錄色譜峰,計算峰面積的RSD。結(jié)果顯示,峰面積RSD為0.91%,表明本方法重復(fù)性良好。

按照儀器工作條件對放置0,1,2,4,24 h的硫酸特布他林對照品溶液和供試品溶液進行測定。結(jié)果表明,24 h內(nèi)硫酸特布他林對照品溶液和硫酸特布他林磷供試品溶液的峰面積RSD分別為0.52%,1.27%,說明上述兩種溶液在24 h內(nèi)均較穩(wěn)定。

2.7 耐用性試驗

采用UltiMate 3000型高效液相色譜儀(配VWD-3100型紫外檢測器)和PLATISILTMODS色譜柱(250 mm×4.6 mm,5μm)對硫酸特布他林供試品溶液進行測定,結(jié)果見圖4。

結(jié)果顯示,在該系統(tǒng)下大豆磷脂和硫酸特布他林的保留時間分別為2.891,5.110 min,分離度為4.8,與本試驗分離度無明顯差別,并且硫酸特布他林的峰形較好,理論塔板數(shù)大于3 000,表明方法耐用,可靠性高。

2.8 樣品分析

按照試驗方法對自制的3種硫酸特布他林磷脂復(fù)合物SPC-1、SPC-2、SPC-3進行測定,根據(jù)公式(復(fù)合率＝硫酸特布他林的測定值/硫酸特布他林原料的投料量×100%)計算樣品的復(fù)合率,結(jié)果見表2。

復(fù)合率是反映母體藥物(硫酸特布他林)與大豆磷脂結(jié)合率的指標(biāo),一般復(fù)合率越高說明藥物與大豆磷脂結(jié)合越多,游離藥物越少。由表2可知,自制的3種硫酸特布他林磷脂復(fù)合物的復(fù)合率均較好。

本工作建立了HPLC測定自制硫酸特布他林磷脂復(fù)合物中硫酸特布他林含量的方法。該方法分離度好、回收率高、檢出限低,可高效、準(zhǔn)確地實現(xiàn)對硫酸特布他林磷脂復(fù)合物中硫酸特布他林的測定,為硫酸特布他林磷脂復(fù)合物的質(zhì)量控制提供了一定的參考。