韓靜雯，李國輝，王道兵，鄭淼，鐘其頂

(中國食品發(fā)酵工業(yè)研究院，北京，100015)

乳制品包括液態(tài)乳、乳粉、干酪等許多種類，兼具營養(yǎng)價值和生理功能，是人類飲食的重要組成部分[1]。乳制品不但可以為人體供給營養(yǎng)和能量，還能促進(jìn)兒童及青少年骨骼的生長發(fā)育[2]。此外，由于其可能會引起過敏反應(yīng)，牛乳已經(jīng)被聯(lián)合國糧食及農(nóng)業(yè)組織和世界衛(wèi)生組織定為八大食品過敏原之一[3]。蛋白質(zhì)是乳制品中的重要成分，牛乳中蛋白質(zhì)含量約為3.0%～3.7%，其中酪蛋白約占牛乳總蛋白的80%[4]，其表型包括αS1-酪蛋白(αS1-casein，αS1-CN)、αS2-酪蛋白(αS2-casein，αS2-CN)、β-酪蛋白(β-casein，β-CN)和κ-酪蛋白(κ-casein，κ-CN)，其中β-CN中被關(guān)注較多的是A1 β-CN和A2 β-CN[5-7]。乳清蛋白約占牛乳總蛋白的20%，具有獨特的生化特性和營養(yǎng)功能，含有10%～20%的α-乳白蛋白(α-Lactalbumin, α-La)和40%～50%的β-乳球蛋白(β-Lactoglobulin, β-Lg)，除此之外，還含有乳鐵蛋白和免疫球蛋白[8-10]等。蛋白質(zhì)的種類和含量直接影響乳制品的品質(zhì)和營養(yǎng)價值，因此對乳蛋白組分進(jìn)行更加細(xì)化的檢測分析尤為重要。目前已報道的乳蛋白檢測方法有電泳法、酶聯(lián)免疫法(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)、高效液相色譜法(high performance liquid chromatography, HPLC)、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法(liquid chromatography-mass spectrometry, LC-MS)等，本文對各類方法進(jìn)行總結(jié)，旨在為相關(guān)檢測方法的研發(fā)與應(yīng)用提供參考。

1 電泳法

電泳是在不同粒子所帶電荷不同或電荷相同但荷質(zhì)比不同的情況下，在同一電場中，隨著時間的推移位移不相同來進(jìn)行分離的方法。電泳法快速簡便，在諸多方法中，聚丙烯酰胺凝膠電泳在蛋白質(zhì)分析中應(yīng)用十分廣泛，包括非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳(native-polyacrylamide gel electrophoresis, native-PAGE)和變性聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-polyacrylamide gel electrophoresis, SDS-PAGE)。二者都是通過對染色后的蛋白質(zhì)進(jìn)行掃描來實現(xiàn)定量，native-PAGE的分離效果受蛋白質(zhì)的分子質(zhì)量、形狀和帶電荷情況影響較大[11]；SDS-PAGE添加了SDS和巰基乙醇變性劑且需要加熱，其分離效果主要受蛋白質(zhì)的分子質(zhì)量影響[12]。PESIC等[13]利用native-PAGE對綿羊乳和山羊乳中的牛β-Lg和α-La進(jìn)行分析，通過2種羊乳中牛β-Lg和α-La的譜帶強(qiáng)度與牛乳在其中摻加量的線性關(guān)系，能夠快速測定羊乳中牛乳清蛋白的含量。韓奕奕等[14]等通過一系列SDS-PAGE實驗確定了乳制品中β-Lg測定的電泳條件，可對乳制品中β-Lg 的含量進(jìn)行快速測定。雖然這2種方法被廣泛用于蛋白質(zhì)的研究，但由于其著色劑和脫色劑需要現(xiàn)配現(xiàn)用導(dǎo)致方法的重現(xiàn)性難以保證。通過對PAGE條件的不斷改良，使用尿素-PAGE可在不進(jìn)行更復(fù)雜的表型鑒定的情況下鑒別牛乳中的A1 β-CN和A2 β-CN[15]。

毛細(xì)管區(qū)帶電泳(capillary zone electrophoresis, CZE)簡化了添加緩沖液的操作，縮短了樣品分析時間，可在與生理條件相近的情況下對乳蛋白組分進(jìn)行分離，避免蛋白質(zhì)在分析過程中發(fā)生降解[16]。利用CZE可對液態(tài)乳和乳粉中的酪蛋白進(jìn)行分離并對α-CN、 β-CN、κ-CN進(jìn)行定量，還可以通過對β-CN的A1和A2表型的定量檢測，得到優(yōu)質(zhì)蛋白在總酪蛋白中的占比從而對乳制品質(zhì)量進(jìn)行評價[17-18]。與PAGE相比，CZE具有更高的靈敏度，自動化程度高，所需樣品量少，可以分離不帶電荷或帶相反電荷的蛋白質(zhì)，但電滲現(xiàn)象受被測物質(zhì)組成影響較大，重現(xiàn)性差。

除此之外，等電聚焦(isoelectric focusing, IEF)是在PAGE的基礎(chǔ)上通過調(diào)整pH梯度實現(xiàn)對目標(biāo)蛋白質(zhì)的分離檢測。在不需要通過酸或酶促沉淀來消除乳清蛋白的情況下，使用IEF技術(shù)可鑒別散裝和單個牛乳樣品是否為A2 β-CN乳，簡化了檢測牛乳中β-CN不同表型相對比例的步驟[19]。將IEF凝膠圖像分析與生物分析儀定量技術(shù)相結(jié)合可以更加全面地對乳制品中的蛋白質(zhì)組分進(jìn)行鑒別，并進(jìn)一步對蛋白的多態(tài)性進(jìn)行探究，明確其蛋白表型(αS1-CN, αS2-CN, β-CN, κ-CN, β-Lg, α-La)并量化分析[20]。

電泳技術(shù)也在向著高通量和高重復(fù)性發(fā)展，將IEF和SDS-PAGE結(jié)合產(chǎn)生的雙向凝膠電泳(two-dimensional electrophoresis, 2-DE)可通過等電點和分子質(zhì)量對蛋白質(zhì)進(jìn)行分離，獲得更加全面、分辨率更高的譜圖[21]，目前在差異蛋白質(zhì)檢測中應(yīng)用十分廣泛。在不斷的實踐中對于實驗樣本的多樣性和2-DE技術(shù)的操作復(fù)雜性問題，有針對性地進(jìn)行改良和優(yōu)化將為電泳技術(shù)的進(jìn)一步發(fā)展和應(yīng)用提供更大的空間。

2 酶聯(lián)免疫法

ELISA是使與酶連接的抗原或抗體與目標(biāo)抗體或抗原產(chǎn)生反應(yīng)，再根據(jù)顯色程度進(jìn)行定性、定量的方法，具有高靈敏性、高特異性、高通量等優(yōu)點[22]，可用于檢測樣品中含量較低的目標(biāo)蛋白，在臨床化學(xué)、藥理學(xué)和生物標(biāo)志物分析等方面應(yīng)用廣泛，常見分類有間接ELISA、直接ELISA、競爭ELISA[23]。間接ELISA可使用單克隆抗體對不同品種乳制品中特定乳蛋白進(jìn)行特異性檢測，在此基礎(chǔ)上與聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)相結(jié)合可對羊乳中摻雜1%以上的牛乳進(jìn)行特異性分析，且與羊乳無交叉反應(yīng)[24]。李媛媛等[25]使用間接競爭ELISA，把兔抗αS-CN多克隆抗體作為一抗，標(biāo)記辣根過氧化物的羊抗兔免疫球蛋白作為二抗，以此放大一抗信號，增加靈敏度，成功實現(xiàn)了牛乳中的αS-CN的檢測。與間接競爭法相比，雙抗體夾心法對目標(biāo)蛋白質(zhì)的檢測靈敏度更高，識別靶向蛋白的抗體群的性質(zhì)與不同ELISA方法的特殊性影響樣品中乳蛋白的測定[26]。ELISA方法設(shè)備成本低、檢測速度快、易于使用、便于樣本批量處理，目前多數(shù)應(yīng)用于乳制品中過敏原蛋白的檢測。

傳統(tǒng)免疫分析與電化學(xué)分析相結(jié)合形成的電化學(xué)免疫法更加快速、靈敏，僅需要適當(dāng)?shù)木彌_液稀釋即可進(jìn)行測定。例如，測定β-Lg含量的三明治結(jié)構(gòu)的磁免疫傳感器[27]，將β-Lg共價固定在活化的磁珠上，磁珠被羧基修飾，用辣根過氧化物標(biāo)記β-Lg作為抗原，將抗體放置在一次性絲網(wǎng)印刷碳電極表面進(jìn)行捕獲，檢出限可達(dá)0.8 ng/mL，可以應(yīng)用于不同乳源乳制品中β-Lg的檢測。此外，基于IgE線性表位的單克隆抗體和過氧化氫酶介導(dǎo)的熒光夾心酶聯(lián)免疫法，可對嬰幼兒配方乳粉中β-Lg進(jìn)行測定，方法的檢出限為7.81 ng/mL[28]。免疫分析方法特異性極強(qiáng)，許多快速可靠的ELISA檢測試劑盒也已經(jīng)進(jìn)入市場，但該方法制備新靶點抗體的過程較為復(fù)雜，而且對樣品的要求較高[29]，其高特異性的特點也使得只能對單一蛋白質(zhì)進(jìn)行檢測。

目前，免疫法廣泛應(yīng)用于羊乳、駱駝乳、驢乳等不同奶源乳制品的牛乳摻假檢測中，能夠?qū)崿F(xiàn)乳制品相互摻假的現(xiàn)場快速檢測，確保乳制品的品質(zhì)與真實性，而更高的靈敏度和更低的檢出限在免疫法的發(fā)展與實際應(yīng)用中將成為必然要求。

3 高效液相色譜法

HPLC在乳蛋白的檢測方面應(yīng)用廣泛，對于不同研究目的和蛋白組分的測定已有大量的研究報道(表1)，通常采用熒光或紫外吸收進(jìn)行定量，方法重現(xiàn)性好[30]。FERREIRA等[31]對不同乳源混合物中同源β-Lg進(jìn)行了測定，建立了檢測乳制品和乳酪中綿羊乳、山羊乳和牛乳含量的一種非常靈敏且準(zhǔn)確的方法，檢出限為2%。研究者通過對前人的方法進(jìn)行改良開發(fā)了一種新的反相高效液相色譜法(reversed-phase HPLC,RP-HPLC)，用于分離和定量牛乳蛋白的不同表型(αS1-CN, αS2-CN, A1 β-CN, A2 β-CN, κ-CN, α-La, β-Lg)。該方法可同時分離和定量所有目標(biāo)蛋白，可有效評價乳蛋白的組成。對水牛乳中乳蛋白的分析結(jié)果顯示，水牛乳蛋白中αS1-CN, αS2-CN, β-CN, κ-CN分別占總酪蛋白含量的32.2%、15.8%、36.5%和15.5%，而β-Lg的含量約為α-La的1.3倍[32-33]。通過進(jìn)一步對RP-HPLC檢測方法的優(yōu)化，可在30 min內(nèi)對牛乳中的主要蛋白質(zhì)(α-CN, β-CN, κ-CN, α-La, β-Lg)進(jìn)行分離和定量，檢出限在0.08～0.28 g/L，可用于商品牛乳中蛋白質(zhì)含量的測定[34]。并且可以從已知基因型的單個動物乳汁樣本中提取純基因變體，在30 min內(nèi)對樣品中目標(biāo)蛋白質(zhì)的不同基因變異體進(jìn)行分離和定量，以評價目標(biāo)蛋白質(zhì)多態(tài)性對蛋白含量的影響[35]。盡管目前通過不斷的改良和發(fā)展，在一定程度上縮短了檢測時間，但大多數(shù)方法仍需要至少15 min清洗和平衡色譜柱[30-35]。

表1 高效液相色譜法檢測乳品中乳蛋白

在傳統(tǒng)HPLC的基礎(chǔ)上，超高效液相色譜(ultra-performance liquid chromatography，UPLC)技術(shù)無論檢測速度、分離效果都得到了進(jìn)一步的提升。BOITZ 等[36]運(yùn)用UPLC技術(shù)快速地測定了牛乳中的β-Lg含量，并通過β-Lg含量來區(qū)分液態(tài)牛乳的不同熱處理方式，方法檢出限和定量限分別為7 mg/L和23 mg/L， 總運(yùn)行時間為3 min，比以往的方法更加迅捷。

HPLC在蛋白質(zhì)分離純化中的優(yōu)異性使得這項技術(shù)在蛋白質(zhì)組學(xué)研究中發(fā)揮著重要作用，同時，復(fù)雜多樣的實驗樣品也對其提出了更高的要求，推動了HPLC的進(jìn)一步發(fā)展。作為蛋白質(zhì)檢測中不可或缺的關(guān)鍵技術(shù)手段，通過與質(zhì)譜等其他技術(shù)相結(jié)合，在保證準(zhǔn)確性的基礎(chǔ)上縮短檢測時間，實現(xiàn)對蛋白質(zhì)定性和定量的目的。

4 液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法

質(zhì)譜已發(fā)展成為分離科學(xué)中最流行和最實用的檢測技術(shù)之一，質(zhì)譜檢測技術(shù)的引入使得蛋白質(zhì)分析得到重大改進(jìn)，它具有獨特的選擇性，并且能夠獲得高度結(jié)構(gòu)特異性的信息[37]。LC-MS可以在蛋白質(zhì)水平或者肽段水平實現(xiàn)對蛋白質(zhì)的絕對定量，即可以對完整的蛋白質(zhì)或者酶解產(chǎn)生的特征肽段進(jìn)行定量分析，測定時間短，檢出限低，動態(tài)范圍寬，在乳蛋白檢測鑒別中的應(yīng)用越來越廣泛(表2)。現(xiàn)有研究提出了一種快速制樣(有機(jī)溶劑提取、酸沉淀、離心)與LC-MS分析相結(jié)合的檢測方法，用于檢測牛乳摻入水牛乳和馬蘇里拉奶酪的問題，該方法能夠在15 min內(nèi)完成樣品分析，同時能夠在每次運(yùn)行中完全識別β-Lg的變體，對乳蛋白定量也可應(yīng)用于摻假鑒別中[38]。MIRANDA等[39]用RP-HPLC-MS對6種乳蛋白(αS1-CN, αS2-CN, β-CN, κ-CN, α-La, β-Lg)進(jìn)行了測定，旨在建立乳制品特征蛋白的質(zhì)量數(shù)據(jù)庫，方法對主要亞型的觀測質(zhì)量和理論質(zhì)量之間的差異非常小，平均低于0.35 Da?？赏ㄟ^LC-MS的方法鑒定牛乳中3種β-CN變異體A1、A2和I，使得蛋白表型的分析更加細(xì)化，其中A2 β-CN在幾種被發(fā)現(xiàn)的表型中比例最高，占β-CN的48.2%[40]。

表2 液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法檢測乳制品中乳蛋白

盡管LC-MS具有高靈敏度和高選擇性，但基質(zhì)效應(yīng)可能會影響方法的準(zhǔn)確性。加入內(nèi)標(biāo)可適當(dāng)消除基質(zhì)效應(yīng)的影響，理論上，最優(yōu)的內(nèi)標(biāo)是被同位素標(biāo)記的目標(biāo)蛋白或類似物。CZERWENKA等[41]使用LC-MS定量分析牛乳中的β-Lg，在樣品制備過程中，先后引入山羊β-Lg和水牛β-Lg作為內(nèi)標(biāo)，來補(bǔ)償整個實驗中前處理損失和基質(zhì)效應(yīng)。REN等[42]以人乳清蛋白作為內(nèi)標(biāo)建立了同時對牛乳中α-La和β-Lg定量的超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(UPLC-MS/MS)，在6 min(總運(yùn)行時間8 min)內(nèi)完成了對乳清蛋白的分離檢測，提高了測量精度、準(zhǔn)確性和重現(xiàn)性，回收率為94.9%～98.7%，可用于鑒別和定量生物基質(zhì)中天然形式的蛋白質(zhì)。

目前，使用LC-MS檢測乳制品蛋白的方法越來越成熟，從對完整蛋白質(zhì)的檢測發(fā)展為對酶解后特征肽段的檢測，并以此為依據(jù)進(jìn)行定量[43]。ANSARI等[37]建立了一種基于固相微萃取的LC-MS方法，重點對α-CN、β-CN、α-La和β-Lg用胰蛋白酶消化后獲得的肽段(5～12個氨基酸)進(jìn)行分析，考慮了摻假混合物中不同濃度的乳蛋白，此方法對不同食品樣品中天然乳蛋白進(jìn)行定性、定量分析。KE等[44]建立了一種針對牛乳制品和羊乳制品中4種酪蛋白(αS1-CN, αS2-CN, β-CN, κ-CN)和2種主要乳清蛋白(α-La, β-Lg)的UPLC-MS/MS方法，分析了6種乳蛋白的特征性多肽，并用同位素標(biāo)記的特征肽段作為內(nèi)標(biāo)補(bǔ)償基質(zhì)效應(yīng)，方法重現(xiàn)性良好。

基于質(zhì)譜技術(shù)的蛋白組學(xué)對乳蛋白的定量分析通常包括樣品前處理、蛋白質(zhì)提取、蛋白酶酶解、質(zhì)譜儀檢測和數(shù)據(jù)分析五部分。其中蛋白質(zhì)定量方法常用的有同位素標(biāo)記相對和絕對定量技術(shù) (isobaric tags for relative and absolute quantification, iTRAQ)，串聯(lián)質(zhì)譜標(biāo)簽技術(shù)(tandem mass tag, TMT)和無標(biāo)定量技術(shù)(label-free quantification)[45-46]。iTRAQ 可用于乳蛋白質(zhì)組差異分析[47-48]，TMT和其原理相近但通量更高，二者被廣泛應(yīng)用于乳蛋白定量。相較于有標(biāo)定量昂貴的試劑盒，無標(biāo)定量只需要分析大量質(zhì)譜數(shù)據(jù)，比較相應(yīng)肽段在不同樣品中的信號強(qiáng)度即可實現(xiàn)相對定量。但無標(biāo)定量要求儀器保證較高的重復(fù)性，為保證結(jié)果的可靠性需要進(jìn)行足夠的技術(shù)重復(fù)。數(shù)據(jù)非依賴型的質(zhì)譜采集技術(shù)結(jié)合傳統(tǒng)鳥槍法，在數(shù)據(jù)依賴型采集的基礎(chǔ)上建立成為當(dāng)下最熱門的質(zhì)譜技術(shù)之一[49]，可以實現(xiàn)良好的重復(fù)性、高通量、高準(zhǔn)確性，并在逐漸發(fā)展中出現(xiàn)了一種新興技術(shù)——全碎片離子順序窗口化獲取質(zhì)譜，將蛋白質(zhì)組深度覆蓋能力與定量一致性和準(zhǔn)確性相結(jié)合[50]。但這2種技術(shù)對于分析算法要求高，需要結(jié)合相應(yīng)的分析軟件對質(zhì)譜圖進(jìn)行解析。

通過將不同技術(shù)方法應(yīng)用于不同種類質(zhì)譜儀，并結(jié)合生物信息學(xué)數(shù)據(jù)分析方法，將幫助研究者們更加深入全面地實現(xiàn)對乳制品蛋白組學(xué)的研究。

5 小結(jié)

明確乳制品中蛋白質(zhì)的組分和含量是評價乳制品的營養(yǎng)價值、過敏特性以及真實性的基礎(chǔ)。世界各國都十分重視如何強(qiáng)化乳制品的營養(yǎng)成分和如何降低其致敏性，尤其在“健康中國2030”的背景下，國家大力倡導(dǎo)乳制品的消費(fèi)，都使得諸多學(xué)者將目光著眼于如何更快、更簡潔地分離檢測更多種類的乳蛋白。由總蛋白含量檢測逐步過渡到蛋白組分的分析，利于完善乳制品的品質(zhì)科學(xué)評價與表達(dá)，并可預(yù)防乳制品真實性問題的出現(xiàn)，保障消費(fèi)者和誠信企業(yè)的合法權(quán)益。對于乳蛋白的檢測分析，ELISA法雖然方便快捷、特異性好，但是卻存在交叉反應(yīng)和無法同時對多種乳蛋白進(jìn)行檢測的問題；電泳法和HPLC法可獲得較多的成分信息，但部分電泳法的重復(fù)性有待進(jìn)一步提升，HPLC法單次分析時間長，且需花費(fèi)較長的時間對色譜柱進(jìn)行維護(hù)。LC-MS法在蛋白組學(xué)研究領(lǐng)域發(fā)揮著自身的優(yōu)勢，相較于以上幾種檢測方法，LC-MS法的靈敏度更高，檢出限低，能夠在較短的時間內(nèi)獲得大量的信息，但儀器設(shè)備價格昂貴對其推廣造成了一定的阻礙。在乳蛋白檢測分析的實際應(yīng)用中可根據(jù)檢測需求將不同的檢測方法進(jìn)行整合優(yōu)化，開發(fā)更加快捷、穩(wěn)定、靈敏的檢測技術(shù)，提升方法的適用性和時效性，支撐乳蛋白組分的精細(xì)化分析。