司波，袁雯雯，賈夢瑋，顧會會，盧永翎，呂麗爽*

1(江蘇省宿遷市產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗所，江蘇 宿遷，223800) 2(南京師范大學(xué) 食品與制藥工程學(xué)院，江蘇 南京，210023)

白酒是我國傳統(tǒng)蒸餾酒，隨著我國經(jīng)濟(jì)的高速發(fā)展，白酒產(chǎn)量和銷量逐年增長。白酒發(fā)酵過程中產(chǎn)生的醛類化合物通常視為白酒中的呈香、呈味物質(zhì)[1]，近年來，其中甲醛(formaldehyde, FOR)、乙醛(acetaldehyde, ACE)[2]、乙二醛(glyoxal, GO)、丙酮醛(methylglyoxal, MGO)、丙烯醛(acrolein, ACR)、巴豆醛(crotonaldehyde, CRO)、糠醛(furfural, FUR)[3]、5-羥 甲基糠醛(5-hydroxymethylfurfural，5-HMF)、丙醛(propionaldehyde、PRO)、戊醛(valeraldehyde、VAL)、己醛(hexanal、HEX)、苯甲醛(benzaldehyde、BEN)和苯乙醛(phenylacetaldehyde、PHE)等小分子活潑羰基化合物對人體的危害引起醫(yī)藥、食品行業(yè)的高度重視[4]?；顫婔驶衔?reactive carbonyl species，RCS)能通過邁克爾加成反應(yīng)(Michael addition reaction)或席夫堿反應(yīng)(Schiff base reaction)與蛋白質(zhì)、核酸、磷脂的親核位點發(fā)生共價結(jié)合，導(dǎo)致細(xì)胞毒性和致突變性[5-6]。研究證明，RCS體內(nèi)蓄積可導(dǎo)致癌癥、神經(jīng)退行性疾病、糖尿病并發(fā)癥、阿爾茨海默癥、衰老、動脈粥樣硬化等多種疾病[7]。目前白酒中有害物質(zhì)的研究主要集中在氨基甲酸乙酯[8]、生物胺[9]、氰化物[10]等，而對醛類的研究報道主要集中在FOR[11-12]和ACE[13-14]，多種RCS檢測研究剛剛起步，如FUR[15]。因此，建立分析白酒中多種RCS檢測方法，監(jiān)控白酒加工過程及成品酒中含量，提高白酒的安全性，具有重要的現(xiàn)實意義。

目前，國外報道的酒類中RCS的檢測方法有：采用高效液相色譜-熒光檢測器檢測葡萄酒[16-17]、酒精飲料[18]中的MGO和GO；氣質(zhì)聯(lián)用技術(shù)檢測葡萄酒[19]、啤酒[20]中的MGO、GO和ACR；采用氣相色譜-氮磷檢測器測定酒精飲料[21]中的MGO和GO，蘋果酒中的ACR[22]；超高效液相質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)測定葡萄酒中5-HMF[23]；高效液相色譜-光電二極管陣列檢測器分析葡萄汁、葡萄酒中5-HMF、FUR和2-糠酸[24]以及朗姆酒中的5-HMF和CRO[25]等其他醛和酯類。白酒生產(chǎn)工藝異于啤酒、葡萄酒，其成品中各類化合物組成、含量也大不相同，方法難以直接套用。迄今除質(zhì)譜外，尚未有報道同時測定多種RCS的分析方法。采用質(zhì)譜檢測器，成本昂貴，操作難度相對較高，不易在企業(yè)和相關(guān)行業(yè)中推廣普及[26-27]。相比而言，高效液相色譜-紫外分析方法簡便、易于普及，不過衍生化試劑難以滿足多種RCS的同步衍生化，實現(xiàn)同時分析多種RCS。因此，本文擬采用氣相色譜法建立同時檢測白酒中多種RCS的分析方法。

由于酒體中含有非常多的小分子揮發(fā)性物質(zhì)，如：醇、醛以及各種酯類風(fēng)味物質(zhì)等，造成干擾，采用常規(guī)氣相色譜分析方法難以一次性檢出多種RCS。故本文采用衍生化方法，采用氣相色譜-電子捕獲檢測器(gas chromatography-electron capture detector，GC-ECD)，旨在建立針對RCS分析的專屬方法。方法運行過程中酒體中部分風(fēng)味醛類也同時檢出，故順勢一并進(jìn)行了定量分析。而后采用該方法對國內(nèi)市場白酒12種香型，9個產(chǎn)地100多種白酒樣品進(jìn)行了檢測，統(tǒng)計學(xué)聚類分析了白酒中的7種RCS含量，本研究為檢測白酒中存在的RCS含量提供了方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

ACR(98%)，薩恩化學(xué)技術(shù)(上海)有限公司；MGO、GO(40%)美國Sigma-Aldrich公司；CRO(99%)，Adamas-beta試劑；FUR(99%)、ACE(40%)，上海展云化工有限公司；FOR(100 mg/L)，生態(tài)環(huán)境部標(biāo)準(zhǔn)樣品研究所；PRO(98%)、VAL(95%)、HEX(98%)、BEN(98%)、O-(2,3,4,5,6-五氟芐基)羥胺鹽酸鹽[O-(2,3,4,5,6-pentafluorobenzyl) hydroxylamine, PFBHA](98%)，日本TCI公司；PHE(95%)，阿法埃莎(中國)化學(xué)有限公司；1,2-二溴丙烷(98%)，上海安譜實驗科技股份有限公司；以上均為質(zhì)量分?jǐn)?shù)；正己烷(色譜純)，德國Merck公司；實驗用水為超純水；其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

實驗用成品酒均通過市售或酒廠取樣方式獲得，12種香型酒樣見表1。

表1 白酒樣品

1.2 儀器與設(shè)備

Agilent 6890 N 氣相色譜儀(配有電子捕獲檢測器)、HP-5MS色譜柱(30 m×0.32 mm，0.25 μm)，美國Agilent公司；Thermo Biofuge Stratos超速冷凍離心機(jī)、Nanopure超純水機(jī)，美國Thermo公司；Organomation N-EVAP 氮氣吹干儀，美國Organomation公司；PWC 254型分析天平，英國ADAM公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 溶液的配制

1.3.1.1 標(biāo)準(zhǔn)儲備液的配制

精確吸取適量ACR、MGO、GO、CRO、FUR、FOR、ACE、PRO、VAL、HEX、BEN和PHE標(biāo)準(zhǔn)品于100 mL棕色容量瓶中，加入乙腈溶解并定容后配制成質(zhì)量濃度分別為0.03、0.03、0.03、0.12、0.6、0.03、3.0、0.12、0.12、0.3、0.12、0.12 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品儲備液，置于4 ℃條件下避光保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.1.2 標(biāo)準(zhǔn)系列溶液的配制

精確吸取1.3.1.1中儲備液適量于容量瓶中，用乙腈逐級稀釋至標(biāo)準(zhǔn)系列溶液，其中ACR、MGO、GO和FOR質(zhì)量濃度為0.005、0.01、0.02、0.05、0.1、0.25、 0.5、0.75 μg/mL，CRO、PRO、VAL、BEN和PHE質(zhì)量濃度為0.02、0.04、0.08、0.2、0.4、1、2、3 μg/mL，HEX濃度為0.05、0.1、0.2、0.5、1、2.5、5、7.5 μg/mL，F(xiàn)UR質(zhì)量濃度為0.1、0.2、0.4、1、2、5、10、15 μg/mL，ACE質(zhì)量濃度為0.5、1、2、5、10、25、50、75 μg/mL。

1.3.1.3 衍生化試劑溶液的配制

精確稱取MOREIRA等[18]適量于干燥的容量瓶中，加入超純水溶解并定容后配制成質(zhì)量濃度為5 mg/mL 的水溶液。

1.3.1.4 1,2-二溴丙烷溶液的配制

精確吸取1,2-二溴丙烷標(biāo)準(zhǔn)品適量于容量瓶中，加入正己烷溶解并定容后配制成質(zhì)量濃度為1 mg/mL 1,2-二溴丙烷儲備液，-10 ℃保存。臨使用前精確吸取適量儲備液于100 mL容量瓶中，加入正己烷溶解并定容后配制成質(zhì)量濃度為0.5 μg/mL內(nèi)標(biāo)1,2-二溴丙烷溶液。

1.3.2 樣品前處理

參考文獻(xiàn)[28]的方法并進(jìn)行優(yōu)化，取適量白酒樣品用超純水將其酒精度(乙醇體積分?jǐn)?shù))稀釋至10%，渦旋混勻，取出3 mL加入5 mg/mL PFBHA 1 mL[29]，蓋緊試管塞，搖勻，于60 ℃搖床中避光反應(yīng)1 h，反應(yīng)結(jié)束后冷水冷卻，加入50 μL濃硫酸，然后加入4 mL正己烷，渦旋3 min，靜置5 min，取出正己烷層(上層)入10 mL玻璃管(含有3 mL0.2 mol/L 硫酸)中，渦旋30 s，靜置5 min，取出正己烷層(上層)氮氣吹干，300 μL正己烷復(fù)溶，用0.22 μm有機(jī)濾膜過濾，GC-ECD檢測。

1.3.3 色譜條件

色譜柱：HP-5MS色譜柱；升溫程序：50 ℃保持1 min， 以4 ℃/min升至220 ℃，再以20 ℃/min升溫至250 ℃，保持10 min；載氣(N2)流速1 mL/min，壓力34.2 kPa，進(jìn)樣量1 μL；不分流進(jìn)樣模式；進(jìn)樣口溫度230 ℃，ECD檢測器溫度300 ℃。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計及圖表繪制方法

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜峰確立

由圖1可知，通過對醛類物質(zhì)共衍生化條件及色譜條件的優(yōu)化，各待測物質(zhì)在氣相色譜中分離度良好，空白無雜質(zhì)峰干擾，達(dá)到分析要求。

1-1,2-二溴丙烷;2-FOR;3-PFBHA;4,4′-ACE;5,5′-ACR;6-PRO;7、7′-CRO;8、8′-VAL;9、9′-HEX;10、10′-FUR;11、11′-BEN;12、12′-PHE;13、13′-GO;14、14′-MGO

2.2 方法學(xué)考察

2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線、線性范圍、檢出限及定量限測定

取標(biāo)準(zhǔn)溶液按照1.3.2方法處理，按1.3.3條件進(jìn)行GC-ECD分析。以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)x，以醛類化合物和內(nèi)標(biāo)峰面積比值為縱坐標(biāo)y，分別繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并計算回歸方程。根據(jù)信噪比確定檢出限(limit of detection, LODs)(信噪比=3)以及定量限(limit of quantitation, LOQs)(信噪比=10)。如表2所示12種 醛類化合物呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)在0.998以上，LODs和LOQs滿足分析要求。

表2 醛類化合物的標(biāo)準(zhǔn)曲線、相關(guān)系數(shù)、線性范圍、檢出限和定量限

2.2.2 樣品穩(wěn)定性測定結(jié)果

將混合標(biāo)準(zhǔn)溶液按1.3.2中的方法處理后，分別4 ℃ 避光放置0、1、2、4、8、16、24 h后在1.3.3中的色譜條件下測定各醛類化合物和內(nèi)標(biāo)的峰面積，ACR、MGO、GO、CRO、FUR、FOR、ACE、PRO、VAL、HEX、BEN、PHE衍生物與內(nèi)標(biāo)峰面積比值的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(relative standard deviation, RSD)分別為1.18%、2.69%、 1.98%、0.47%、3.70%、1.20%、1.56%、0.61%、 1.94%、1.93%、2.94%、0.62%，結(jié)果表明衍生化后樣品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2.3 加標(biāo)回收率和精密度測定結(jié)果

向已知12種醛類化合物的白酒樣品中分別加入高、中、低3個質(zhì)量濃度水平的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，混合均勻后將樣品酒精度稀釋至10%，取3 mL按1.3.2方法處理，每個加標(biāo)水平平行做6次實驗，計算相應(yīng)組分的加標(biāo)回收率和RSD，結(jié)果見表3。12種醛類化合物平均加標(biāo)回收率為86.98%～109.55%，RSD均<5%，表明該方法精密度良好，準(zhǔn)確度高。

表3 加標(biāo)回收率和精密度結(jié)果(n=6)

綜上所述，我們采用常用色譜GC-ECD，通過衍生化，建立一種同時定量測定多種RCS (ACR/MGO/GO/CRO/FUR/FRO/ACE)以及風(fēng)味醛類物質(zhì)(PRO/VAL/HEX/BEN/PHE)共12種醛類的方法，由此，在沒有質(zhì)譜條件下，采用GC同樣可以一次性檢測白酒中的風(fēng)險因子和風(fēng)味物質(zhì)等多種醛類。GC成本低，方法簡單，穩(wěn)定性高，能達(dá)到較高的精密度和準(zhǔn)確度，易于在行業(yè)中推廣使用。在此基礎(chǔ)上，我們對不同香型不同產(chǎn)地的白酒進(jìn)行了全面分析。

2.3 不同香型成品酒中醛類化合物的分析

不同香型的白酒配料、酒曲、生產(chǎn)工藝、發(fā)酵溫度、產(chǎn)地等各不相同，根據(jù)主體香氣成分可分為醬香型、濃香型、清香型、兼香型、米香型、鳳香型、芝麻香型、豉香型、特香型、藥香型、老白干香型、馥郁香型共12種香型[30]。每種香型選取5種酒樣，共定量檢測出FRO、ACE、GO、MGO、ACR、CRO、FUR、5-HMF、PRO、VAL、HEX、BEN、PHE 12種醛類物質(zhì)，與之前的報道相似[31]。由表4可知，醬香型白酒中12種醛類物質(zhì)總含量最高，芝麻香型次之，豉香型最少；丁醛、VAL、HEX的含量均處于國家標(biāo)準(zhǔn)允許的安全范圍[32]，其余醛類無國家標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定。

表4 不同香型成品酒中醛類物質(zhì)含量(n=3) 單位：μg/mL

基于ACR、MGO、GO、CRO、FUR、FOR和ACE 7種RCS含量繪制熱圖，并對12個香型進(jìn)行聚類分析。如圖2所示，12個香型可歸為兩大類，第Ⅰ大類包括醬香型和芝麻香型，ACR、MGO、GO、CRO、FUR、FOR和ACE均相對較高，其中GO、CRO、FUR和ACE含量最高，國內(nèi)已有文獻(xiàn)報道芝麻香型酒中ACE含量最高，醬香型次之[13-14]；可能是醬香型白酒和芝麻香型白酒均采用高溫發(fā)酵的生產(chǎn)工藝，醬香型采用高溫制曲、高溫堆積、高溫發(fā)酵、高溫餾酒，其生產(chǎn)周期長，貯藏時間長；芝麻香型白酒采用高氮配料、高溫堆積、高溫發(fā)酵、高溫餾酒[33-34]，而較高的溫度和高氮配料均有利于美拉德反應(yīng)進(jìn)行，已有大量文獻(xiàn)報道RCS來源于美拉德反應(yīng)或部分微生物發(fā)酵過程。因此，有必要對酒配料和發(fā)酵過程中RCS的形成進(jìn)一步研究。其余香型可歸為第Ⅱ大類。其中，藥香型因其ACR含量較高而聚集，藥香型白酒采用百草入曲，大、小曲發(fā)酵，雙醅串蒸，偏堿性筑窯材料，究竟是哪種因素導(dǎo)致ACR含量增高尚需對各種因素綜合分析研究。相比而言藥香型的其他醛類含量明顯較低。鳳香型因其FOR含量較高而聚集。豉香型因其GO，ACR含量高而聚集，豉香型白酒在加工工藝會將酒泵入浸肉池，肥肉醞浸多天，而肥肉富含油脂。大量文獻(xiàn)報道油脂氧化過程中會產(chǎn)生GO、ACR等[35]，這可能是導(dǎo)致酒體中RCS含量增高的原因。老白干香型白酒3種聚類中，7種RCS含量均較低。清香型和特香型白酒中，RCS含量均較低，其中ACR含量最低。馥郁香型白酒除FUR略高，其他RCS含量均較低。濃香型白酒未能聚類，不同樣品中7種RCS含量各不相同，反復(fù)抽取多種樣品實驗均未果。酒廠內(nèi)容調(diào)研發(fā)現(xiàn)，濃香型白酒基酒存在異地采購勾兌而成現(xiàn)象。是否由于基酒不同造成的影響而不能聚類，有待進(jìn)一步研究。

N-濃香型;Q-清香型;J-醬香型;M-米香型;F-香型;NJ-兼香型;Z-芝麻香型;T-特香型;L-老白干香型;C-豉香型;Y-藥香型;NQ-馥郁香型

2.4 不同產(chǎn)地成品酒中醛類化合物的分析

各類白酒差異性不僅歸因于不同的加工工藝，其地域差異性導(dǎo)致氣候、溫濕度、水質(zhì)、發(fā)酵微生物等因素也會影響白酒質(zhì)量。白酒按產(chǎn)區(qū)可大致分為6大板塊，分別為川黔板塊、蘇皖板塊、魯豫板塊、兩湖板塊、東北板塊和華北板塊。本實驗初步考察了9個產(chǎn)地的不同成品酒含量，其中RCS采用統(tǒng)計學(xué)方法，如表5所示?；贏CR、MGO、GO、CRO、FUR、FOR和ACE 7種RCS含量繪制熱圖，并對9個產(chǎn)地進(jìn)行聚類分析。如圖3所示，9個產(chǎn)地可歸為2大類。貴州單獨為Ⅰ類，7種RCS含量均較高，MGO、GO、CRO、FUR和ACE含量最高。四川、湖南、河北、廣東，7種RCS含量總和略低，除少數(shù)GO含量較高，其余幾種RCS含量均較低。江蘇和陜西FOR含量較高，其余幾種RCS含量略高。此外，貴州、湖南、河北、廣東、陜西3個樣品完全聚類，四川、山西、江蘇其2個樣品也能聚類，安徽3個樣品各不相同，無法聚類。

表5 不同產(chǎn)地成品酒中醛類物質(zhì)含量(n=3) 單位：μg/mL

JS-江蘇;GZ-貴州;SC-四川;SX-山西;AH-安徽;HN-湖南;HB-河北;GD-廣東;SsX-陜西

3 結(jié)論

本文建立了一種同時檢測白酒中ACR、MGO、GO、CRO、FUR、FOR、ACE、PRO、VAL、HEX、BEN和PHE共12種醛類的GC-ECD分析方法。該方法LODs為0.3～2.0 ng/mL，LOQs為0.9～6.0 ng/mL，回收率86.98%～109.55%，方法的精密度高、穩(wěn)定性好，靈敏度高，操作簡便易行。采用統(tǒng)計學(xué)聚類分析法分析了12種香型、9個產(chǎn)地白酒中RCS含量。結(jié)果表明，不同香型白酒中7種RCS差異明顯，其中醬香型和芝麻香型白酒中RCS含量較高。不同產(chǎn)地對RCS的影響也較為明顯。貴州地區(qū)生產(chǎn)的白酒中RCS含量較高。而由于白酒配方迥異、加工工藝復(fù)雜，水質(zhì)、氣候、微生物等影響因素眾多，導(dǎo)致酒體RCS含量高的原因尚需針對具體加工工藝進(jìn)一步深入研究。