羅 越，胡洋洋，張 興，王亞東，趙彩彥

(河北醫(yī)科大學第三醫(yī)院感染科，河北 石家莊 050051)

病原學診斷作為感染性疾病診斷最重要的環(huán)節(jié)之一，對感染性疾病精準診療的價值毋庸置疑，但傳統(tǒng)的病原學檢測技術(shù)存在檢測周期長、陽性率低、受抗生素使用影響，特殊病原體難于檢測等影響，不能滿足當前臨床快速、精準的病原學診斷，繼而有的放矢的指導目標治療的需求。宏基因組二代測序技術(shù)(metagenomics next generation sequencing,mNGS)簡稱二代測序，以其無偏倚、廣覆蓋、高通量、快速精準等優(yōu)勢，逐漸被臨床所重視和認可。自2014年mNGS被首次用于腦脊液檢測鉤端螺旋體感染的病例后，國內(nèi)外mNGS相關(guān)研究和文獻報道越來越多，并逐漸在臨床診斷實踐中推廣、普及。mNGS檢測包括采集感染部位樣本、提取核酸、制備文庫，以及高通量測序、分析生物信息、解讀檢測報告等關(guān)鍵環(huán)節(jié)。作為一項新的生物檢測技術(shù)，在臨床應用過程中需要規(guī)范應用范圍和診斷標準，優(yōu)化檢測流程與質(zhì)量控制等環(huán)節(jié)，以最大限度提升其臨床應用價值?！吨袊昊蚪M學第二代測序技術(shù)檢測感染病原體的臨床應用專家共識》[1]，是針對感染病原體宏基因組學檢測的第一部中國標準規(guī)范，于2020年11月由《中華傳染病雜志》編輯委員會發(fā)布，重點總結(jié)mNGS檢測技術(shù)在臨床應用范圍、樣本采集規(guī)范、科學報告解讀和診斷效能評估等方面，并制定推薦意見。筆者以臨床角度從mNGS的適用范圍與診斷效能、樣本采集與運輸質(zhì)量控制、結(jié)果判讀與驗證等方面分別進行解讀，以期加深臨床醫(yī)師對共識的認知和理解，全方位提升mNGS的臨床應用與診斷效能。

1 mNGS檢測的應用范圍與診斷效能

傳統(tǒng)病原學檢測多建立在體外分離培養(yǎng)基礎上，但由于體內(nèi)外環(huán)境差異等因素干擾，致使部分致病病原微生物難以獲取陽性結(jié)果。mNGS優(yōu)勢不僅在于能夠發(fā)現(xiàn)傳統(tǒng)方法無法檢測到的病原體[2]，更重要的是能夠在短時間內(nèi)進行覆蓋較大范圍的病原體核酸檢測[3-4]，因此對于臨床可疑、疑難復雜感染或免疫抑制患者更具有重要臨床價值，且由于檢測技術(shù)的不斷升級和完善，甚至可用于篩查病原體耐藥突變信息及毒力基因[5]，協(xié)助抗生素的合理選擇。因此對于臨床疑似急危重癥感染，或應用免疫抑制劑或存在免疫缺陷患者，在完善傳統(tǒng)病原學檢測同時，采集疑似感染部位樣本進行mNGS檢測。mNGS陰性結(jié)果同樣有助于“排除”某些感染性疾病的診斷，以及不同病原體感染的甄別。因此共識推薦對于臨床疑似感染以DNA為遺傳物質(zhì)的病原體(包括細菌、病毒、真菌或寄生蟲等)行DNA檢測，對于可疑RNA病毒感染時進行RNA檢測。

1.1mNGS在臨床疑似血流感染患者的應用與診斷效能 血流感染是指全身感染的患者血液培養(yǎng)呈陽性，可能是繼發(fā)于原發(fā)部位明確的感染，或者來源未定。血流感染患者典型臨床特點包括畏寒、寒戰(zhàn)、發(fā)熱和全身感染中毒癥狀，實驗室檢查提示外周血白細胞、中性粒細胞計數(shù)異常，紅細胞沉降率(erythrocyte sedimentation rate,ESR)、C反應蛋白(C-reactive protein,CRP)等炎癥指標升高，部分實驗室檢測腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白細胞介素1β(interleukin-1β,IL-1β)、IL-6等促炎癥因子水平上升，如為細菌性感染，血清降鈣素原水平升高具有更佳的敏感度和特異度。上述特點對臨床疑似血流感染判定及評估m(xù)NGS檢測必要性具有重要意義。根據(jù)不同劃分標準，血流感染可以被分為不同類型，如單純性和復雜性血流感染(包括導管相關(guān)血流感染、感染性心內(nèi)膜炎等)。亦可分為原發(fā)性和局灶病變播散后的繼發(fā)性血流感染。共識推薦：對于懷疑血流感染患者在留取血培養(yǎng)樣本同時留存用于mNGS檢測血樣本。若血培養(yǎng)3 d未回報致病病原體，且抗感染經(jīng)驗治療效果不佳，可送檢標本進行mNGS檢測。必要時可重新采樣。對可疑繼發(fā)性血流感染者，若由于原發(fā)感染灶無法采集適宜樣本或病原學檢測陰性，可考慮行血樣本的mNGS檢測。由于引發(fā)血流感染的病原體大部分是以DNA作為遺傳物質(zhì)的細菌、真菌、寄生蟲、部分病毒，所以推薦血流感染患者首選DNA的mNGS檢測，但在臨床懷疑可能為病毒性肺炎、腎綜合征出血熱、登革熱等RNA病毒感染時進行RNA測序。

血流感染方面，mNGS與血培養(yǎng)保持了高度的一致性，且具有更高的檢測效能。當以血培養(yǎng)為金標準，mNGS檢測敏感度和特異度分別為72.7%和89.6%，相比單純血培養(yǎng)，聯(lián)合mNGS檢測陽性率升高近一倍(23.08%vs.12.82%)[6]。尤其在膿毒癥休克患者，相比在起病時血培養(yǎng)33%陽性率，mNGS檢測陽性率在起病3周內(nèi)波動至71%左右[7]。因此mNGS可以作為傳統(tǒng)病原學檢測的重要補充手段。雖然mNGS檢測對于血流感染具有快速、敏感等優(yōu)勢，且血液樣本mNGS檢測與血培養(yǎng)具有高度的吻合性，但由于血流感染的異質(zhì)性較大，目前針對血流感染者尚缺乏大樣本mNGS檢測診斷效能研究。

1.2mNGS在臨床疑似中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染患者的應用與診斷效能 中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染是一類以發(fā)熱、頭痛、腦膜刺激征、嘔吐、抽搐、局灶性神經(jīng)功能障礙、意識障礙等為特點的感染性疾病。行腦脊液檢查可發(fā)現(xiàn)腦脊液渾濁，實驗室檢查白細胞和(或)中性粒細胞升高、蛋白質(zhì)水平增加、腦脊液葡萄糖水平或腦脊液葡萄糖/血清葡萄糖比值降低等，影像學提示感染性改變是中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染性疾病的重要支持。某些特異性免疫檢測及特殊染色，如隱球菌莢膜抗原檢測與墨汁染色對隱球菌腦膜炎具有病原學診斷價值。因此對于可疑中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染患者，除留取腦脊液樣本進行常規(guī)涂片、生化、培養(yǎng)及免疫相關(guān)指標檢測外，同步留存腦脊液樣本，若3 d內(nèi)未明確感染病原體且抗感染經(jīng)驗性治療無效，可送檢留存腦脊液標本進行mNGS檢測，必要時可重復腰椎穿刺術(shù)采集腦脊液樣本。對于疑似中樞神經(jīng)系統(tǒng)病毒感染，同樣可以行腦脊液mNGS檢測，尤其對于傳統(tǒng)PCR檢測方法未能明確感染病原體患者。對于慢性中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染患者，mNGS檢測發(fā)現(xiàn)罕見、少見病原體的能力顯著提高，因此可首選mNGS檢測。

mNGS相比傳統(tǒng)病原學檢測在中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染診斷方面具有更高的敏感度、特異度和預測效能，通過對腦脊液和(或)腦組織檢測，有助于發(fā)現(xiàn)多種致病細菌、真菌、病毒、寄生蟲[8-9]，但在不同的疾病背景有所差異[10-11]。一篇對25篇論文44例經(jīng)mNGS診斷疑似腦炎患者的Meta分析顯示，除16例與傳統(tǒng)PCR檢測陽性結(jié)果一致，另外28例傳統(tǒng)檢測方法未能明確診斷的患者均被mNGS證實，提示mNGS對于新發(fā)或少見/罕見病原體感染診斷具有重要優(yōu)勢[4]。與傳統(tǒng)培養(yǎng)技術(shù)相比，mNGS敏感度高達90%，且陽性率較培養(yǎng)提高近25%[12]。國內(nèi)學者Guo等[9]通過對以細菌為主的中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染患兒研究顯示，55.56%的mNGS結(jié)果與傳統(tǒng)檢測結(jié)果一致。雖然mNGS檢測細菌、病毒、寄生蟲的效果較好，且確實提升對多種新發(fā)及少見病原體的檢出率，協(xié)助臨床診斷疑難復雜感染病例，但在不同研究中其診斷率也僅0%～30%[13-17]，尤其對于真菌感染檢測效能仍需更大樣本量的臨床試驗來驗證。另一方面，由于腦脊液病原體含量較低，對腦脊液上清液檢測可能僅發(fā)現(xiàn)無細胞病毒或無細胞微生物核酸，明顯降低檢測的陽性率及臨床指導價值，因此建議進行全腦脊液檢測[4]。

1.3mNGS在臨床疑似呼吸道感染患者的應用與診斷效能 呼吸道感染表現(xiàn)為以鼻塞、流涕、噴嚏、咽痛等為主要特點的上呼吸道感染，也可表現(xiàn)為以咳嗽、咳痰、咯血、氣短、胸痛等為癥狀，查體示雙肺不同程度干濕啰音和(或)肺實變體征為突出特點的下呼吸道感染，重者甚至可出現(xiàn)呼吸衰竭。實驗室檢查常可見血液白細胞和(或)中性粒細胞計數(shù)升高、炎癥細胞因子升高；肺部影像學檢查提示特征性炎癥改變等。肺部感染病原學構(gòu)成復雜，包括細菌、病毒、真菌、支原體、衣原體等多種病原體。傳統(tǒng)病原學檢查以痰/支氣管肺泡灌洗液涂片、染色和培養(yǎng)為主，針對特殊感染可輔助免疫學檢測，或針對特定病原體核酸PCR檢測。目前，對于呼吸道檢測樣本，由于mNGS檢測成本較高，且其數(shù)據(jù)覆蓋度相對固定和局限，因此其檢測敏感度并不高于傳統(tǒng)特異性PCR核酸測序。因此，推薦mNGS僅作為傳統(tǒng)方法無法明確感染病原體的補充。3 d內(nèi)傳統(tǒng)病原學檢測未發(fā)現(xiàn)病原體，且抗感染經(jīng)驗性治療效果不佳，推薦送檢呼吸道樣本行mNGS檢測。如存在病毒高發(fā)季節(jié)急性起病、血白細胞計數(shù)正常或偏低等高度懷疑病毒性肺炎征象，且病情進展快的患者，先完善呼吸道病毒多重PCR檢測，若結(jié)果為陰性則再進行mNGS檢測，并同時進行核酸RNA反轉(zhuǎn)錄檢測。對于免疫抑制患者出現(xiàn)呼吸道感染或病情危重患者，在進行傳統(tǒng)病原學檢測同時，應盡快送檢呼吸道樣本行mNGS檢測，以盡早明確罕見病原體或混合感染可能。

mNGS在肺部感染病原體診斷，尤其對于病毒、非典型病原體、混合感染等方面具有一定優(yōu)勢，利于發(fā)現(xiàn)常規(guī)檢測無法鑒定的罕見病原體、病毒，并有助于多重感染鑒定[18-19]，但由于其無法有效區(qū)分呼吸道定植菌和病原菌，因此對于檢測結(jié)果需要結(jié)合患者病情綜合分析決策。雖然在針對厭氧菌、結(jié)核分枝桿菌、真菌、肺孢子菌等方面mNGS檢測敏感度相比培養(yǎng)具有明顯優(yōu)勢(50.7%vs.35.2%)，但mNGS對于結(jié)核分枝桿菌、布魯菌等胞內(nèi)菌，以及具有細胞壁的真菌的檢測效能仍相對較低[19-21]。根據(jù)目前發(fā)表的多篇研究顯示[22-25]，當應用mNGS技術(shù)進行呼吸道病原體檢測時，在樣本中病原微生物載量較高情況下，mNGS檢測總體效能近似于PCR檢測；但當樣本中病原微生物載量較低時，其在敏感度方面不如PCR。因此，mNGS可作為傳統(tǒng)病原學診斷的一種有效補充，兩者聯(lián)合應用可提高整體病原體的檢出率。

1.4mNGS在臨床疑似局灶性感染患者的應用與診斷效能 局灶性感染是一類以局部組織出現(xiàn)紅、腫、熱、痛、膿液滲出等為特征性表現(xiàn)的感染性疾病。皮膚軟組織感染可形成膿腫；骨關(guān)節(jié)感染可伴隨功能障礙；尿路感染可有尿頻、尿急、尿痛等尿道刺激征；眼部感染可出現(xiàn)程度不同的畏光、流淚、視力下降、分泌物增多等。部分嚴重局灶性感染亦可伴有乏力、消瘦、消化道癥狀等非特異性表現(xiàn)，或伴隨發(fā)熱、畏寒、寒戰(zhàn)，甚至休克等全身感染中毒癥狀。不同研究顯示mNGS可提高皮膚軟組織、骨關(guān)節(jié)、眼內(nèi)、尿路、漿膜腔等局灶性感染的病原學檢測能力[26-27]，對創(chuàng)傷弧菌、結(jié)核及非結(jié)核分枝桿菌等均有較強的診斷價值[28-29]，還可用于發(fā)現(xiàn)風疹病毒、阿米巴原蟲、弓形蟲、隱球菌等特殊感染的病原體[30-31]，甚至可用于尿路感染的耐藥細菌檢測[32]。

對于局灶組織感染甚至膿腫患者，mNGS對細菌檢測的敏感度優(yōu)于真菌，且總體敏感度和特異度均優(yōu)于傳統(tǒng)病原學及免疫學檢測手段。針對骨關(guān)節(jié)感染患者，常規(guī)培養(yǎng)陰性的樣本通過mNGS可額外發(fā)現(xiàn)49.3%～93.0%的致病病原體[33-34]。

2 mNGS樣本處理質(zhì)量控制要求與結(jié)果解讀建議

2.1mNGS對樣本采集、運輸與處理的質(zhì)量控制要求 mNGS檢測樣本根據(jù)可疑感染部位不同，包括組織樣本、血液、腦脊液、胸腹部積液、漿膜腔液、肺泡灌洗液、痰液、咽拭子、分泌物及膿液等。檢測所需樣本量與測序要求及核酸數(shù)量級有關(guān)。為提高檢測結(jié)果的陽性率和可信度，應根據(jù)患者的病情，進行選擇與病灶最相關(guān)的樣本類型送檢。如可直接采集患者感染部位的組織或體液樣本，并注明樣本類型和采集部位。而對于感染部位樣本采集困難、病情不能耐受有創(chuàng)操作，或暫無明確感染部位的患者，可選擇患者血液樣本進行送檢，但檢測結(jié)果的準確性和陽性率可能降低[35]。采集樣本過程必須嚴格遵循無菌原則：對于無菌體液，應嚴格按照無菌操作采集樣本，包括采集前的嚴格無菌消毒、采集后的無菌處理與運輸，為避免污染，一般建議將采集的第2管樣本送檢。對于有菌部位的樣本，同樣需要無菌理念，避免混入正常菌群及定植菌，干擾后續(xù)檢測結(jié)果的判讀。采集后的樣本應及時送檢，送檢過程中嚴格無菌原則，并遵守相應測序廠商的運輸標準作業(yè)程序。需遠距離運輸?shù)臉颖緫捎美滏溈焖龠\輸，并盡可能避免因反復凍融導致核酸不同程度降解，最終影響檢驗效能。如不能及時送檢，應嚴格按照標準程序?qū)颖具M行儲存。

2.2mNGS檢測結(jié)果的臨床判讀與應用建議 mNGS檢測流程質(zhì)控體系雖然不在本文討論范疇，但臨床醫(yī)師在解讀報告過程仍需關(guān)注mNGS檢測報告單中涉及到的實驗內(nèi)參照、陰性與陽性對照結(jié)果，以及相關(guān)質(zhì)控標準，如測序深度、基因組覆蓋度、檢出病原體序列數(shù)、相對豐度等信息。

mNGS最大優(yōu)勢在于快速精準、高通量檢測，為早期目標抗感染治療提供證據(jù)支持，正確的解讀同樣是保證mNGS優(yōu)勢的關(guān)鍵。由于mNGS操作流程復雜，各個環(huán)節(jié)均易引入污染，干擾檢測結(jié)果，且檢出的病原體無法具體確定是定植菌、背景菌還是致病菌，因此對于測序結(jié)果為陽性的報告應根據(jù)患者臨床特點、實驗室及輔助檢查結(jié)果系統(tǒng)分析、解讀和驗證[10]。對于呼吸道病毒感染，由于受測序數(shù)據(jù)覆蓋度影響，相比反轉(zhuǎn)錄PCR，低覆蓋度mNGS并不具備優(yōu)勢，但在明確病毒分型[22]，及縮短診斷時長方面具有一定優(yōu)勢[36]，因此可以輔助早期病原學診斷，指導抗感染藥物選擇，實現(xiàn)早期目標治療、降低患者的病死率[23]。陽性結(jié)果固然有助于明確感染病原體，陰性結(jié)果亦可用于排除感染性疾病可能[17]。mNGS檢測結(jié)果需與臨床表現(xiàn)及其他輔助檢查結(jié)果相結(jié)合作出解讀，根據(jù)不同情況可分為以下幾種類型：當mNGS檢測結(jié)果與患者臨床表現(xiàn)及相關(guān)實驗室結(jié)果相符合，可根據(jù)結(jié)果指導臨床抗感染決策。當患者mNGS檢測結(jié)果陽性，且具有與之吻合的臨床表現(xiàn)，但未獲得其他實驗室檢查結(jié)果證據(jù)支持，可通過PCR方法驗證，并進一步完善或重復傳統(tǒng)病原學檢測。若患者僅獲得mNGS陽性檢測結(jié)果，但與臨床表現(xiàn)和(或)其他實驗室檢查結(jié)果不相符，不能僅根據(jù)mNGS檢測結(jié)果進行病原學診斷，建議結(jié)合患者臨床特點綜合分析、鑒別各檢查結(jié)果的準確度。對于mNGS檢測結(jié)果陰性，而其他實驗室檢查結(jié)果為陽性(尤其是培養(yǎng)結(jié)果為陽性)，需結(jié)合患者臨床表現(xiàn)及其他輔助檢查綜合分析，在必要情況下可考慮重復mNGS檢測。

綜上所述，mNGS已經(jīng)逐步成為對臨床感染性疾病精準診斷及抗感染目標治療的一項有重要價值的檢測技術(shù)。對新發(fā)的、疑難的感染病能夠指明方向，進而幫助臨床進行判斷，并在病原學診斷、減少不必要抗生素使用等方面成為傳統(tǒng)病原學檢測的有效補充手段[3]。但mNGS的推廣應用仍存在許多問題需要解決，包括檢測成本較高、缺乏驗證其可靠性和優(yōu)越性的規(guī)范化大樣本研究、缺乏統(tǒng)一的質(zhì)控標準和規(guī)范的測序流程、致病原與背景菌鑒別困難、高質(zhì)量的樣本儲存和運輸條件要求等。共識并不推薦將mNGS作為臨床輕癥感染性疾病的一線檢測手段。另外，由于目前耐藥基因庫尚未完全建立，mNGS對微生物耐藥性的評價作用有限，需要臨床醫(yī)生結(jié)合患者臨床特征及傳統(tǒng)藥敏結(jié)果指導目標性抗感染方案。當然，隨著mNGS技術(shù)的進一步發(fā)展與完善，未來將在規(guī)范診斷標準、優(yōu)化質(zhì)量控制、提高測序準確度、優(yōu)化分析報告、降低成本等方面逐步得到提升，成為精準抗感染治療的關(guān)鍵技術(shù)。共識在匯總最新國際、國內(nèi)權(quán)威文獻的基礎上，結(jié)合臨床實際問題詳細介紹了mNGS在檢測感染病原體臨床應用方面的種種事項，為臨床醫(yī)師規(guī)范應用提供了科學指導。盡管如此，感染性疾病的病原學診斷仍要求綜合臨床與病原微生物特點、流行病學與最佳診斷證據(jù)等多方面信息，堅持以患者為核心，以臨床特征、組織病理、影像學、微生物學、mNGS等重要輔助檢查為一體的綜合理念，因此在臨床解讀報告結(jié)果時需要緊密結(jié)合臨床實踐，以審慎的態(tài)度分析決策，以更好地指導臨床工作。