基于1H-NMR技術(shù)的2型糖尿病代謝組學(xué)研究進(jìn)展

鄭芳萍，高碧珍，陳學(xué)勤

(1.福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬廈門中醫(yī)院內(nèi)分泌科，福建 廈門 361001； 2.福建中醫(yī)藥大學(xué)，福州 350122； 3.廈門大學(xué)附屬第一醫(yī)院中醫(yī)科，福建 廈門 361003)

2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus，T2DM)是一種代謝紊亂的慢性高血糖疾病，其特征為碳水化合物、脂質(zhì)和蛋白質(zhì)代謝的改變。據(jù)統(tǒng)計(jì)，目前全世界T2DM患者達(dá)5億以上，而中國約占1/3[1]，已成為繼心腦血管疾病、腫瘤后嚴(yán)重危害人類健康的第三大慢性疾病，其導(dǎo)致的多種并發(fā)癥是糖尿病致殘、致死的主要原因[2]。T2DM患者從發(fā)病前期、患病再到出現(xiàn)各種并發(fā)癥，機(jī)體內(nèi)發(fā)生了一系列復(fù)雜的代謝變化。以往對于T2DM的研究方法主要以分子生物學(xué)和生物化學(xué)為主，易忽略整體器官中動態(tài)的代謝變化過程，對該病的發(fā)病機(jī)制研究和認(rèn)識具有一定局限性，也難以做到早期預(yù)測。而代謝組學(xué)作為一種系統(tǒng)的研究方法，可識別生物體的整體代謝變化，是系統(tǒng)生物學(xué)的重要組成部分，近年來在醫(yī)學(xué)、藥學(xué)、生物學(xué)等領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用[3-4]。其中，核磁共振氫譜(nuclear magnetic resonance hydrogen spectroscopy，1H-NMR)代謝組學(xué)能夠?qū)颖具M(jìn)行動態(tài)監(jiān)測，為T2DM及其并發(fā)癥的預(yù)測、作用機(jī)制、臨床診斷及藥物療效等的研究提供了新思路?，F(xiàn)就1H-NMR技術(shù)在T2DM發(fā)病機(jī)制、相關(guān)并發(fā)癥及中醫(yī)藥治療代謝組學(xué)研究中的應(yīng)用予以綜述，以期為深入研究提供參考。

1 基于1H-NMR技術(shù)的代謝組學(xué)概述

代謝組學(xué)興起于20世紀(jì)90年代末，是繼蛋白組學(xué)、基因組學(xué)后的一門新興學(xué)科，用于研究生物體系(細(xì)胞、組織或生物體)內(nèi)源性代謝物種類、數(shù)量及變化規(guī)律，可揭示機(jī)體生命活動代謝本質(zhì)[5]。其研究對象主要是分子量為1 000以下的小分子化合物。目前常用的代謝組學(xué)技術(shù)包括氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用和核磁共振技術(shù)，各有優(yōu)缺點(diǎn)。與質(zhì)譜相比，核磁共振具有樣品處理簡單、無損傷性、測試手段豐富，定性與定量分析、無偏向性、分析快速等獨(dú)特優(yōu)勢，是化合物定性分析中最重要的方式，近年來得到廣泛應(yīng)用，成為臨床醫(yī)藥研究領(lǐng)域的重要工具[6]。而核磁共振又以1H-NMR和核磁共振碳譜應(yīng)用最為廣泛。1H-NMR的原理主要是通過利用特定頻率的電磁波，使氫原子發(fā)生能級躍遷，產(chǎn)生的磁頻率信號經(jīng)過轉(zhuǎn)換放大在譜圖上以峰的形式體現(xiàn)。核磁定性的基本方式是利用分子中含氫基團(tuán)的化學(xué)位移和譜峰裂分情況，對化合物的分子結(jié)構(gòu)進(jìn)行判斷。然后通過一系列樣品的圖譜，可以判斷生物體的病理生理狀態(tài)、基因的功能、藥物的毒性和藥效等，并可能找出與之相關(guān)的生物標(biāo)志物和代謝途徑。近年來，采用1H-NMR發(fā)現(xiàn)T2DM潛在生物標(biāo)志物是代謝組學(xué)的研究熱點(diǎn)之一，可以極大提高對T2DM發(fā)生機(jī)制的微觀了解，監(jiān)測藥物療效及毒性，從而促進(jìn)T2DM的預(yù)測、診斷、治療等領(lǐng)域的發(fā)展。

2 基于1H-NMR技術(shù)的T2DM發(fā)病機(jī)制研究

T2DM與體內(nèi)多種物質(zhì)代謝紊亂有關(guān)，如脂質(zhì)、氨基酸、碳水化合物等，通過1H-NMR技術(shù)有助于了解患者體內(nèi)代謝物的異常特征，對于進(jìn)一步認(rèn)識T2DM的發(fā)病機(jī)制，預(yù)測疾病發(fā)生發(fā)展至關(guān)重要，同時也可為臨床診斷提供新途徑。紅細(xì)胞是一種獨(dú)特的機(jī)體細(xì)胞，參與氨基酸等營養(yǎng)物質(zhì)的運(yùn)輸和傳遞，而血糖是成熟紅細(xì)胞代謝的唯一能源，因此紅細(xì)胞的代謝物運(yùn)輸在T2DM中容易受到損害[7]。Palomino-Sch?tzlein等[8]通過1H-NMR技術(shù)研究T2DM患者紅細(xì)胞代謝譜，發(fā)現(xiàn)與健康人群不同的代謝產(chǎn)物包括谷胱甘肽、2,3-雙磷酸甘油酸、肌苷酸等氨基酸。但由于血細(xì)胞不容易提取分離，而血清代謝組學(xué)更容易操作和檢測，因此血清成為代謝組學(xué)中最常用的樣本。Del Coco等[9]采用1H-NMR技術(shù)區(qū)分了T2DM和T2DM并發(fā)癥之間的血清代謝特征，從T2DM患者中檢測出8種生物標(biāo)志物，包括丙氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、亮氨酸、賴氨酸、蛋氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸，而異亮氨酸、亮氨酸、賴氨酸、酪氨酸和纈氨酸這5種代謝物可作為T2DM并發(fā)癥患者的生物標(biāo)志物?？梢姡琓2DM無并發(fā)癥與有并發(fā)癥患者體內(nèi)的代謝途徑存在差異。此外，由于尿液中含有的化學(xué)物種類較多，可以反映代謝紊亂，因此尿液在代謝物譜研究中也是一種關(guān)鍵的生物基質(zhì)。Guan等[10]研究發(fā)現(xiàn)，糖尿病大鼠的尿代謝產(chǎn)物與正常大鼠明顯不同，包括與能量代謝、三羧酸循環(huán)和甲胺代謝有關(guān)的尿代謝產(chǎn)物。張志軍等[11]應(yīng)用1H-NMR技術(shù)檢測T2DM患者尿液的代謝輪廓，圖譜顯示與T2DM有關(guān)的代謝物包括乙酸、牛磺酸、乙酰乙酸、檸檬酸、三甲胺等，表明T2DM的發(fā)生發(fā)展與糖代謝紊亂、氧化應(yīng)激、氨基酸及脂類代謝異常、維生素缺乏密切相關(guān)。Ahola-Olli等[12]用1H-NMR代謝組學(xué)測量4個芬蘭人群共11 896人中的229種循環(huán)代謝指標(biāo)，對基線代謝物與8～15年隨訪期間(392例)糖尿病風(fēng)險的關(guān)聯(lián)進(jìn)行了調(diào)整，結(jié)果發(fā)現(xiàn)有113項(xiàng)代謝物與糖尿病有關(guān)。

以上研究表明，T2DM患者無論是血清、紅細(xì)胞還是人體排泄物中，均可檢測出多種與T2DM發(fā)生發(fā)展相關(guān)代謝途徑的生物標(biāo)志物，這些代謝物可以預(yù)示人們患糖尿病風(fēng)險的趨勢，有助于研究者尋找可預(yù)測T2DM致病機(jī)制的標(biāo)志物，同時也擴(kuò)展了更多了解T2DM代謝途徑的渠道。而全方位的代謝譜分析不僅使疾病發(fā)病機(jī)制更加客觀化、可視化、微觀化，還有助于針對風(fēng)險較高的無癥狀個體進(jìn)行預(yù)防性干預(yù)。

3 基于1H-NMR技術(shù)的T2DM相關(guān)并發(fā)癥研究

T2DM后期可引起一系列并發(fā)癥，易造成器官組織毀損，具有致殘、致死性。由于T2DM的預(yù)后高度依賴于并發(fā)癥的發(fā)展，1H-NMR可以輔助疾病進(jìn)行診斷、分型、分級和分階段，因此用微創(chuàng)技術(shù)鑒定T2DM并發(fā)癥進(jìn)展的生物標(biāo)志物具有重要的臨床價值。目前臨床多將糖化血紅蛋白作為糖尿病控制的監(jiān)測指標(biāo)，糖化血紅蛋白水平越高，提示患者發(fā)生糖尿病相關(guān)并發(fā)癥的風(fēng)險越大。然而，糖化血紅蛋白在預(yù)測糖尿病相關(guān)慢性并發(fā)癥方面無特異性，且不能捕捉到與血糖本身無關(guān)的葡萄糖變異性和其他代謝變化，這使得探索新的生物標(biāo)志物成為預(yù)測糖尿病進(jìn)展的一個重要領(lǐng)域[8]。有研究證實(shí)，有糖尿病相關(guān)并發(fā)癥患者血漿中的三羧酸循環(huán)、甲胺代謝、能量代謝物和氨基酸受到顯著干擾[13]。近年來，1H-NMR技術(shù)在糖尿病視網(wǎng)膜病變(diabetic retinopathy，DR)、糖尿病腎病(diabetic nephropathy，DN)及腦血管神經(jīng)病變研究中取得較大進(jìn)展，成為監(jiān)測代謝物變化和預(yù)測疾病發(fā)生發(fā)展的重要手段。

3.1DR DR早期無任何癥狀，隨著病程進(jìn)展，可導(dǎo)致失明。Santiago等[14]采用1H-NMR技術(shù)研究糖尿病對大鼠視網(wǎng)膜中間代謝產(chǎn)物水平的影響，發(fā)現(xiàn)糖尿病大鼠視網(wǎng)膜中葡萄糖顯著增加，乳酸鹽顯著減少，表明糖尿病可能會顯著降低視網(wǎng)膜的糖酵解，從而導(dǎo)致患者視力下降。Jin等[15]對糖尿病伴白內(nèi)障、DR伴白內(nèi)障和老年性白內(nèi)障患者的房水進(jìn)行了基于1H-NMR的代謝組學(xué)研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，乳酸、2-羥基丁酸、琥珀酸等代謝物可能在DR的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮作用。Barba等[16]通過1H-NMR的代謝組學(xué)分析糖尿病伴視網(wǎng)膜病變患者玻璃體液的代謝特征，結(jié)果顯示乳酸是最豐富的代謝產(chǎn)物，具體表現(xiàn)為乳酸和葡萄糖水平升高，半乳糖醇和抗壞血酸水平顯著降低。由于視網(wǎng)膜、房水、玻璃體等樣本在臨床較難獲得，在研究上存在一定的困難，目前研究較少且不成熟，未來仍需要更多大樣本、多中心研究來支持。但以上基于1H-NMR代謝組學(xué)的研究仍可在一定程度上說明DR患者的能量代謝和氨基酸的代謝途徑發(fā)生了改變，這有助于探索DR患者新的發(fā)病機(jī)制。

3.2DN DN是糖尿病嚴(yán)重的微血管并發(fā)癥之一，也是終末期腎病最主要的原因，嚴(yán)重影響患者的生命健康和生活質(zhì)量。孫立業(yè)等[17]研究認(rèn)為，DN小鼠體內(nèi)存在氨基酸代謝和能量代謝異常，從而導(dǎo)致腎臟受損。廖成彬等[18]通過1H-NMR技術(shù)檢測尿液代謝組學(xué)特征，發(fā)現(xiàn)隨著DN病程的進(jìn)展，體內(nèi)能量代謝、氨基酸代謝、脂代謝、三羧酸循環(huán)及腸道菌群會發(fā)生顯著變化。Tian等[19]對從糖尿病大鼠獲得的尿液和腎臟組織樣本進(jìn)行了基于1H-NMR的代謝組學(xué)分析，共篩選出9種與腎功能密切相關(guān)的差異代謝產(chǎn)物，它們主要與酮體的合成和降解，甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸的代謝以及丁酸酯的代謝3個代謝途徑相關(guān)，涉及甲胺代謝、能量代謝和氨基酸代謝。魏婷婷等[20]研究認(rèn)為，DN的發(fā)病與三羧酸循環(huán)、糖酵解途徑和脂類代謝途徑受到不同程度抑制以及糖異生作用增強(qiáng)有關(guān)，異常代謝產(chǎn)物包括丙酮酸、乳酸、檸檬酸等，并提出膽堿可能是與DN相關(guān)的潛在生物標(biāo)志物。目前通過1H-NMR技術(shù)已識別出影響DN發(fā)生發(fā)展的某些代謝產(chǎn)物，而這些顯著差異的代謝產(chǎn)物能否作為判斷其進(jìn)展的生物標(biāo)志物尚未明確，但仍可為未來DN的早期診斷和探索發(fā)病機(jī)制提供新方向。

3.3糖尿病腦病(diabetic encephalopathy，DE) 糖尿病可引起認(rèn)知、記憶等大腦功能障礙以及大腦的神經(jīng)生理改變，進(jìn)展為DE，但其潛在代謝機(jī)制仍不清楚。有研究顯示，腦病的發(fā)生發(fā)展與腦能量代謝紊亂密切相關(guān)[21]，1H-NMR代謝組學(xué)可以通過監(jiān)測血清、血漿甚至腦組織、腦脊液的代謝變化特征，揭示疾病病理生理機(jī)制。王丹等[22]基于1H-NMR技術(shù)發(fā)現(xiàn)，糖尿病大鼠不同發(fā)病階段額葉和枕葉兩個腦區(qū)的代謝變化主要涉及能量代謝紊亂、谷氨酸-谷氨酰胺-氨基丁酸循環(huán)抑制、滲透壓調(diào)節(jié)增強(qiáng)3個方面。Zheng等[23]認(rèn)為，糖尿病大鼠的認(rèn)知功能障礙可能與大腦區(qū)域特定的代謝改變有關(guān)，基于代謝通路分析發(fā)現(xiàn)，這些變化涉及能量代謝、神經(jīng)遞質(zhì)、膜代謝和滲透壓調(diào)節(jié)。DE較輕者會出現(xiàn)反應(yīng)遲鈍、記憶力下降及認(rèn)知功能障礙等，但嚴(yán)重者會出現(xiàn)腦血栓、腦卒中及老年癡呆等，這可能與機(jī)體的代謝發(fā)生改變有關(guān)。馬紅等[24]在T2DM合并腦梗死的患者血清中檢測出極低密度脂蛋白、葡萄糖、丙酮酸等特征代謝物，說明脂類代謝、糖代謝、氨基酸代謝的紊亂可能在DE中發(fā)揮作用。一項(xiàng)前瞻性代謝組學(xué)研究指出，T2DM患者腦循環(huán)中有氧代謝降低，無氧糖酵解增加，其中T2DM患者腦脊液中的丙氨酸、亮氨酸、纈氨酸、酪氨酸、乳酸、丙酮酸水平顯著升高，組氨酸水平顯著降低，這可為T2DM患者中樞神經(jīng)病變的代謝紊亂提供臨床參考價值[25]。另有研究表明，慢性應(yīng)激暴露可介導(dǎo)糖尿病大鼠杏仁核中一些主要的神經(jīng)遞質(zhì)和能量代謝相關(guān)的神經(jīng)化學(xué)發(fā)生改變，包括乳酸、谷氨酸、谷氨酰胺等[26]。以上研究說明，DE患者不同的大腦區(qū)域呈現(xiàn)不同的代謝特征，表現(xiàn)出特定區(qū)域的糖尿病性腦損傷，這些發(fā)現(xiàn)為T2DM慢性應(yīng)激相關(guān)神經(jīng)功能障礙的潛在代謝機(jī)制提供了新見解。

4 基于1H-NMR技術(shù)在T2DM中醫(yī)藥治療中的研究

1H-NMR技術(shù)不僅可用于疾病預(yù)測、疾病診斷、了解發(fā)病機(jī)制，還可以識別藥物作用靶點(diǎn)、監(jiān)測藥物療效以及指導(dǎo)藥物治療等。T2DM是一種可防可控的疾病，在了解其代謝紊亂機(jī)制的基礎(chǔ)上，可通過1H-NMR技術(shù)針對性監(jiān)測藥物在患者體內(nèi)發(fā)揮作用的途徑，這對于精準(zhǔn)化藥物治療具有重要意義，特別是近年來該技術(shù)在T2DM中醫(yī)藥治療方面也有十分重要的應(yīng)用和突破[27]。Guo等[28]采用基于1H-NMR的代謝組學(xué)和網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究黃芪-山藥對T2DM大鼠的降糖作用，代謝譜分析發(fā)現(xiàn)T2DM的調(diào)控主要與黃芪-山藥中的18種活性物質(zhì)有關(guān)，其作用靶點(diǎn)有135個，其中有4個靶蛋白可能是黃芪-山藥治療T2DM最相關(guān)的靶點(diǎn)。一項(xiàng)研究采用1H-NMR評價不同品種三角蕨的降糖作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)治療30 d后糖尿病大鼠的血糖恢復(fù)至正常水平，同時生化指標(biāo)也顯著改善[29]。現(xiàn)代“微生物-腸-腦”學(xué)說認(rèn)為，T2DM發(fā)病與腸道菌群失調(diào)密切相關(guān)，通過飲食、藥物干預(yù)調(diào)節(jié)腸道菌群可以改善高血糖狀態(tài)[30]。而通過1H-NMR技術(shù)分析腸道代謝狀況，可以間接監(jiān)測藥物對腸道菌群的影響，這對于尋找治療糖尿病的中藥以及療效評價十分重要。有研究通過16S核糖體DNA測序和1H-NMR分析靈芝多糖對T2DM大鼠腸道微生物群和糞便代謝物的影響，結(jié)果顯示靈芝多糖能夠恢復(fù)T2DM大鼠腸道細(xì)菌群落紊亂的氨基酸代謝、碳水化合物代謝、炎癥物質(zhì)代謝和核酸代謝，從而顯著降低空腹血糖和胰島素水平[31]。另有研究基于1H-NMR技術(shù)探討中藥人參煎對T2DM模型大鼠血清和尿液代謝組學(xué)的影響，干預(yù)后發(fā)現(xiàn)糖尿病大鼠的代謝表型恢復(fù)至正常范圍，表明人參煎對T2DM胰島素抵抗大鼠具有治療作用[32]?？傊?H-NMR技術(shù)的代謝組學(xué)研究可將藥物在T2DM患者體內(nèi)的作用進(jìn)行微觀化、可視化、簡單化，未來該技術(shù)可用于挖掘具有降糖作用的中藥及中藥成分，可能成為闡明藥物作用機(jī)制的有力工具。

5 結(jié) 語

T2DM雖以高血糖為特征，但機(jī)體的整體代謝，如糖、脂類、核苷酸、氨基酸、有機(jī)酸等以及與之相關(guān)的代謝通路均受到嚴(yán)重干擾。而基于1H-NMR技術(shù)的代謝組學(xué)在T2DM及相關(guān)并發(fā)癥的防治研究中展現(xiàn)出巨大潛力與應(yīng)用價值，隨著1H-NMR代謝組學(xué)方法的檢測水平不斷提高，目前已經(jīng)識別了大量與T2DM發(fā)展密切相關(guān)的新型潛在的生物標(biāo)志物，對T2DM的早期診斷、監(jiān)測病程發(fā)展、預(yù)測疾病以及尋找特定藥物產(chǎn)生深遠(yuǎn)影響。但現(xiàn)有研究仍存在一些不足：①當(dāng)前關(guān)于1H-NMR在T2DM并發(fā)癥中應(yīng)用的研究較少，論據(jù)不足，未來仍需更多研究證實(shí)該技術(shù)的價值。②由于代謝譜數(shù)據(jù)范圍較大，目前尚沒有公認(rèn)的可作為T2DM及其并發(fā)癥早期預(yù)測的生物標(biāo)志物數(shù)據(jù)庫，若能進(jìn)一步驗(yàn)證這些特異性代謝標(biāo)志物在T2DM及其并發(fā)癥的發(fā)生發(fā)展過程中產(chǎn)生的影響，盡可能明確統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，可為T2DM的早期診治提供有力參考，從而有利于降低T2DM的發(fā)病率和致死率。③現(xiàn)有研究多以疾病某個靜態(tài)代謝狀態(tài)進(jìn)行研究，而T2DM的發(fā)生發(fā)展是一個動態(tài)過程，有些代謝異常貫穿于整個疾病的始終，因此監(jiān)測整個T2DM發(fā)生發(fā)展過程中的內(nèi)源性代謝變化顯得尤為重要，對T2DM的預(yù)防、診斷和治療具有重要意義。