張 倩，章越凡，李鐵軍 （1. 安徽中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，安徽 合肥 20012；2. 上海市浦東新區(qū)浦南醫(yī)院，上海 200125；. 上海大學(xué)醫(yī)學(xué)院，上海 200444）

先天性免疫是機(jī)體防御病毒感染的第一道防線也是獲得性免疫觸發(fā)的先決條件。當(dāng)病毒進(jìn)入機(jī)體細(xì)胞，胞質(zhì)內(nèi)的感受器即被活化，而胞質(zhì)感受器啟動的信號最終激活STING 受體，誘導(dǎo)產(chǎn)生Ⅰ型IFN 和促炎性因子。2012 年首次報道STING上游通路的關(guān)鍵分子是cGAMP，可由胞質(zhì)內(nèi)的cGAS 催化生成，cGAMP 作為人體內(nèi)的第二信使，在天然免疫信號通路中發(fā)揮著重要作用。cGAMP可與接頭蛋白STING 結(jié)合并活化STING，進(jìn)一步激活TANK 結(jié)合激酶1(TBK1），誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄因子干擾素調(diào)節(jié)因子3(IRF3）和NF-κB 入核，產(chǎn)生Ⅰ型IFN和細(xì)胞因子，以便機(jī)體清除入侵的病原微生物，從而防御各種病毒感染[1]，維持機(jī)體健康穩(wěn)態(tài)。cGAScGAMP-STING 通路在抗病毒藥物研發(fā)中的作用引起越來越多科學(xué)家的關(guān)注，本文就該通路的最新研究進(jìn)展及其在抗病毒中的作用進(jìn)行系統(tǒng)的梳理概括。

1 cGAS-cGAMP-STING 通路及其發(fā)現(xiàn)歷史

STING 是一種完整的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（ER）膜蛋白，可通過結(jié)合cGAS 合成的2'3'-cGAMP 形成二聚體，招募TBK1，磷酸化IRF3，從而使一系列的信號傳遞下去，最后誘導(dǎo)干擾素的產(chǎn)生。研究者早期認(rèn)為cGAMP 只存在于細(xì)菌等低等生物細(xì)胞中，直到2013 年發(fā)現(xiàn)哺乳動物細(xì)胞中也含有cGAMP[2]。cGAMP 作為第二信使，可以直接結(jié)合STING 并活化STING 及其上游關(guān)鍵合成酶cGAS。2012 年陳志堅團(tuán)隊[3]檢測到cGAS 能感知到胞質(zhì)DNA 的存在，并激活一系列炎癥反應(yīng)。胞質(zhì)DNA 與cGAS結(jié)合，誘發(fā)cGAS 的催化中心發(fā)生構(gòu)象改變，把GTP和ATP 轉(zhuǎn)化為cGAMP。 Swanson 等[4]發(fā)現(xiàn)cGAMP除了激活Ⅰ型IFN 外，還激活了炎性小體，抑制DNA病毒的感染。

有研究顯示，真核細(xì)胞中的cGAS-cGAMPSTING 信號通路的抗病毒作用有著古老的進(jìn)化起源，其進(jìn)化于微生物對噬菌體的防御機(jī)制[5]。越來越多的研究發(fā)現(xiàn)該通路在癌癥、抗病毒、抗炎癥反應(yīng)和疫苗研發(fā)等領(lǐng)域都是一個十分具有前景的醫(yī)療靶點[6-9]。

2 cGAS-cGAMP-STING 信號通路在抗病毒中的作用

2.1 對DNA 病毒的作用

cGAS-cGAMP-STING 信號通路是被內(nèi)源性和外源性的DNA 所激活，因此，該通路主要針對DNA病毒起作用。DNA 病毒主要包含皰疹病毒（HSV）、腺病毒（ADV）、偽狂犬病毒（PRV）、痘病毒（Poxvirus）和乙肝病毒（HBV）。cGAS-cGAMP-STING 通路對DNA 病毒的影響作用取決于DNA 病毒種類，另外，相比于抑制病毒的復(fù)制，cGAS-STING 通路更傾向通過抑制旁觀者細(xì)胞（bystander cell）的傳播來發(fā)揮抗病毒作用[10]，如卡波濟(jì)肉瘤病毒（KSHV）。在人細(xì)胞模型、小鼠細(xì)胞模型和小鼠動物模型中，HSV-1 感染后， STING 促使NLRP3（ NOD-like receptor protein 3）定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，并促進(jìn)NLRP3 的脫泛素化從而激活炎性小體，使得cGAS-cGAMPSTING-NLRP3 在抗HSV-1 感染中起到了重要作用[11-12]。β-連環(huán)蛋白可以促進(jìn)cGAS-cGAMPSTING 通路中Ⅰ型IFN 的產(chǎn)生，從而更好地發(fā)揮抗HSV-1 的作用。HSV-1 的US3 是HSV-1 殼外蛋白，可作為絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，HSV-1 可通過US3 高度磷酸化β-連環(huán)蛋白以抵消β-連環(huán)蛋白的抗HSV-1 作用[13]。Li 等[14]通過IP 和nano-LCESI-MS / MS 分析進(jìn)行的公正篩選已確定三結(jié)構(gòu)域蛋白家族21（TRIM21）是泛素E3 連接酶，能促進(jìn)γ-干擾素誘導(dǎo)蛋白16（IFI16）進(jìn)出，引起IFI16 蛋白進(jìn)入泛素-蛋白酶體途徑降解，IFI16-K3 / 4 /6R 突變可延長IFI16 的半衰期，誘導(dǎo)更多STING依賴性I 型IFN 和下游干擾素刺激基因（ISGs）表達(dá)，從而使細(xì)胞對HSV-1 病毒感染更具有抵抗力。Zhou 等[15]的研究發(fā)現(xiàn)陰離子通道LRRC8/VRAC是一個跨細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運cGAMP 的轉(zhuǎn)運蛋白，能將HSV-1 感染細(xì)胞產(chǎn)生的cGAMP 轉(zhuǎn)運到非感染細(xì)胞中，激活STING 信號和干擾素應(yīng)答，從而發(fā)揮抗HSV-1 作用。

另外，cGAS-cGAMP-STING 通路在抗人類巨細(xì)胞病毒 (HCMV)中發(fā)揮著重要作用[16]。STING高表達(dá)可以顯著降低HCMV 在人成纖維細(xì)胞中的復(fù)制[17]。

Wang 等[18]研究發(fā)現(xiàn)豬干擾素誘導(dǎo)的跨膜蛋白1（pIFITM1）是宿主抑制PRV 感染的限制性因素，而PRV 誘導(dǎo)的pIFITM1 的表達(dá)依賴于cGAScGAMP-STING 先天性免疫信號通路和Ⅰ型IFN受體。Cheng 等[19]研究表明，cGAS-cGAMP-STING途徑對于感知鼠痘病毒（ECTV）感染，誘導(dǎo)Ⅰ型IFN 產(chǎn)生以及控制ECTV 復(fù)制至關(guān)重要。ECTV是一種研究宿主與正痘病毒關(guān)系的有價值模型。實驗表明，缺乏cGAS 或STING 的小鼠表現(xiàn)出較低的Ⅰ型IFN 水平和較高的病毒載量，并且對鼠痘更敏感。但是，其對ECTV 反應(yīng)的作用目前尚不清楚。

Ito 等[20]設(shè)計了STING 通路的配體cGAMP作為HBV 疫苗佐劑功效的動物實驗，使野生型（WT）和HBV 轉(zhuǎn)基因（HBV-Tg）小鼠均接種乙型肝炎表面抗原（HBsAg）和cGAMP，結(jié)果發(fā)現(xiàn)HBsAg和cGAMP 的疫苗接種顯著增強(qiáng)了WT 和HBVTg 小鼠對HBsAg 的體液免疫和細(xì)胞免疫反應(yīng)。cGAMP 誘導(dǎo)了與輔助性T 細(xì)胞1（Th1）和Th2 響應(yīng)相關(guān)的細(xì)胞因子的釋放，并誘導(dǎo)激活了淋巴組織中的抗原呈遞細(xì)胞?；谝陨蠈嶒灒琁to 等認(rèn)為cGAMP 進(jìn)行疫苗接種可以克服慢性HBV 感染患者的耐受性。

Pepin 等[21]證明cGAMP 依賴連接蛋白轉(zhuǎn)移至吞噬細(xì)胞可以調(diào)節(jié)抗DNA 病毒效應(yīng)，使上皮細(xì)胞和巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)，上皮細(xì)胞中的cGAMP 可以直接轉(zhuǎn)移至巨噬細(xì)胞胞內(nèi)，從而反式激活巨噬細(xì)胞中STING 信號通路。cGAMP 的轉(zhuǎn)移依賴于上皮細(xì)胞中連接蛋白的表達(dá)，抑制連接蛋白的表達(dá)會使該途徑的STING 通路的激活減弱。cGAMP 反式激活巨噬細(xì)胞又起到了正反饋的作用，放大了STING 通路的抗病毒作用。Wang 等[22]發(fā)現(xiàn)通過增加DNA 傳感器cGAS 及其下游銜接蛋白STING的敏感性來對抗DNA 病毒，此反應(yīng)中Mn2+是必需的。Mn2+增強(qiáng)了cGAS 對dsDNA 的敏感性及其酶促活性，Mn2+還通過增加cGAMP-STING 結(jié)合親和力來增強(qiáng)STING 活性。這些發(fā)現(xiàn)表明，Mn2+是宿主抵御DNA 病毒的關(guān)鍵物質(zhì)。

2.2 對RNA 病毒的作用

雖然登革熱病毒（DENV）是一種生命周期中沒有DNA 階段的RNA 病毒，它也可以通過STING的蛋白水解作用來操縱cGAS-STING 介導(dǎo)的先天性免疫。Su 等[23]進(jìn)行的共培養(yǎng)細(xì)胞模型發(fā)現(xiàn)，隨著人STING 單倍型的不同，STING 對DENV 蛋白酶的敏感性也不同，在DENV 感染后控制細(xì)胞因子的產(chǎn)生和病毒復(fù)制的效果也不同。外源重新激活的病毒DNA 進(jìn)一步增強(qiáng)了DENV 蛋白酶與STING 相互作用和裂解的能力。DENV 感染會降低具有蛋白酶敏感性STING 單倍型細(xì)胞的宿主先天性免疫。然而，研究者在鼠類和非人靈長類動物中也發(fā)現(xiàn)了對登革熱蛋白酶耐受的STING，揭示STING 可能是不同物種限制登革熱病毒復(fù)制的一種宿主因子。

Gutjahr 等[24]通過在鼻內(nèi)單獨給HIV-1 Gag p24納米顆粒（NP-p24）或與2'3'-cGAMP 合用一起接種于CB6F1 小鼠，發(fā)現(xiàn)相對于單獨接種NP-p24 的小鼠，用NP-p24 加2'3'-cGAMP 接種的小鼠的病毒復(fù)制得到了更為有效的控制，且小鼠的黏膜和全身性HIV-1 Gag p24 特異性IgA 和IgG 滴度非常高，但是，在單獨接種NP-p24 的小鼠中并未檢測到。cGAMP 并行引發(fā)體液免疫反應(yīng)的能力，包括在黏膜表面分泌IgA，可能對某些病毒感染（如HIV-1）有作用。

3 cGAS-cGAMP-STING 信號通路調(diào)節(jié)劑在抗病毒中的作用

3.1 正反饋調(diào)節(jié)劑在抗病毒中的作用

Hou 團(tuán)隊[25]基于細(xì)胞分析，從合成的小分子中鑒定出具有吖啶酮骨架的化合物2g、9g 和12b 是STING 激動劑，它們在整個物種中均是STING 的激動劑。其中，12b 活性最好，并且其對人和鼠STING 依賴性信號的誘導(dǎo)均與2'，3'-cGAMP 相似。蛋白質(zhì)分析表明2g、9g 和12b 可以通過直接與STING 結(jié)合從而激活STING 通路，而12b 與STING 的親和力更強(qiáng)。而且與2'，3'-cGAMP 相比，12b 可以誘導(dǎo)各種細(xì)胞因子產(chǎn)生更快，更強(qiáng)勁和更持久的免疫應(yīng)答。基于此，團(tuán)隊首次成功修飾鼠STING 激動劑以獲得人類敏感性，這些結(jié)果表明，12b 是有效的人STING 激動劑。此外，吖啶酮類似物顯示出巨大的抗病毒或抗腫瘤治療潛力。Zhang 等[26]報道了基于細(xì)胞的高通量篩選測定法，該測定法可用于鑒定小分子cGAS-cGAMP -STING途徑激動劑，發(fā)現(xiàn)6-溴-N-（萘-1-基）苯并[d][1,3]二唑-5-羧酰胺（BNBC）是cGAS-cGAMP -STING途徑的激動劑，不僅可以誘導(dǎo)針對多種病毒的先天抗病毒免疫力，而且還可以刺激適應(yīng)性免疫應(yīng)答的激活。Lian 等[27]的研究發(fā)現(xiàn)CCHC 型鋅指蛋白3（ZCCHC3）缺乏抑制dsDNA 和DNA 病毒觸發(fā)的下游效應(yīng)基因的誘導(dǎo)，ZCCHC3 直接與dsDNA 結(jié)合，增強(qiáng)cGAS 與dsDNA 的結(jié)合，這對病毒感染后cGAS 的激活很重要。Ku 等[28]發(fā)現(xiàn)了類鼻疽桿菌T6SS5 依賴性細(xì)胞融合觸發(fā)宿主中的Ⅰ型IFN基因表達(dá)，并導(dǎo)致cGAS-STING 通路激活，cGAS和STING 的激活導(dǎo)致自噬細(xì)胞死亡。他們提出：cGAS-STING 途徑通過微核形成將異常的細(xì)胞融合感知為危險信號，并因此通過自噬死亡的誘導(dǎo)限制異常的被病毒感染的細(xì)胞分裂和限制潛在的細(xì)胞轉(zhuǎn)化。Palermo 等[29]的研究發(fā)現(xiàn)，STING 激動劑cGAMP 與FDA 批準(zhǔn)的組蛋白脫乙酰基酶抑制劑（resminostat）的組合可顯著增加HIV 感染前細(xì)胞的HIV 前病毒激活率和特異性凋亡，降低HIV感染細(xì)胞的比例并在CD4（+）中央記憶T（TCM）細(xì)胞中觀察到了HIV DNA 的總量，該研究通過減少病毒庫并誘導(dǎo)HIV 感染細(xì)胞的特異性死亡，代表了一種消除HIV 的新策略。

3.2 負(fù)反饋調(diào)節(jié)劑在抗病毒中的作用

Kawasaki 等[30]發(fā)現(xiàn)STING 轉(zhuǎn)運受到肌管蛋白相關(guān)蛋白（MTMR）3 和MTMR4 的調(diào)節(jié)，而MTMR3 和MTMR4 可以調(diào)節(jié)PtdIns3P（磷脂酰肌醇）的產(chǎn)生，PtdIns3P 可通過調(diào)節(jié)STING 轉(zhuǎn)運來抑制DNA 介導(dǎo)的先天免疫應(yīng)答，并發(fā)揮關(guān)鍵作用。Ghosh 等[31]研究發(fā)現(xiàn)I 型干擾素誘導(dǎo)型人寡腺苷酸合成酶樣蛋白（OASL）是cGAS-cGAMP-STING途徑的負(fù)反饋調(diào)節(jié)劑，OASL 獨立于雙鏈DNA，直接且特異性地與cGAS 結(jié)合，從而與第二信使cGAMP 產(chǎn)生非競爭性抑制，起到負(fù)反饋調(diào)節(jié)cGAScGAMP-STING 通路的作用。Jia 等[32]的研究發(fā)現(xiàn)，病毒感染導(dǎo)致胞內(nèi)脂質(zhì)過氧化水平升高，產(chǎn)生4-羥基壬烯酸（4-HNE）等脂質(zhì)過氧化代謝產(chǎn)物，促進(jìn)STING 羰基化、抑制STING 活化。谷胱甘肽過氧化物酶（GPX4）通過將高反應(yīng)性脂質(zhì)過氧化物(L-OOH)轉(zhuǎn)化為低反應(yīng)性脂質(zhì)醇(L-OH)，保護(hù)細(xì)胞免受脂質(zhì)過氧化作用并維持胞漿內(nèi)氧化還原平衡。而GPX4 缺陷通過增強(qiáng)脂質(zhì)過氧化可進(jìn)一步促進(jìn)4-HNE 產(chǎn)生、特異性抑制cGAS-STING 介導(dǎo)的DNA 識別通路，從而抑制抗DNA 病毒免疫反應(yīng)。Huang 等[33]確定HCMV 蛋白UL31 作為cGAS的抑制劑。UL31 直接與cGAS 相互作用，并使DNA 與cGAS 分離，從而抑制cGAS 的酶功能并降低cGAMP 的產(chǎn)生。UL31 的過表達(dá)有效抑制抗病毒應(yīng)答，而敲低或敲除UL31 則明顯增強(qiáng)了HCMV 誘導(dǎo)Ⅰ型IFN 和下游抗病毒基因的生成。Fu 等[34]的研究結(jié)果表明HCMV UL42 也是cGAS依賴性抗病毒反應(yīng)的抑制劑。

4 總結(jié)與展望

近幾年，人們在理解胞質(zhì)DNA 傳感和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)方面取得顯著進(jìn)步，尤其是在cGAS 和cGAMP鑒定方面取得重大突破。大量證據(jù)清楚地表明cGAS-cGAMP-STING 途徑在抗病毒中的作用，這歸因于胞漿DNA 的識別和Ⅰ型IFN 的產(chǎn)生。cGAMP可有效抗病毒復(fù)制，延長病毒滯留時間，延長生存周期，因此，可用于制備治療HBV、HCV 等病毒的藥物。cGAS 激活典型的模式識別受體（PRRs）通路，通過STING 上調(diào)IFNs 的表達(dá)，進(jìn)而誘發(fā)抗病毒的活性。最近報道，該通路的激動劑具有良好的抗病毒作用，有望進(jìn)一步開發(fā)為抗病毒新藥。

盡管cGAS-cGAMP-STNG 通路被發(fā)現(xiàn)和研究多年，但是STNG 信號相關(guān)的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)并不完善，其與其他通路如caspase 1/9、STAT、NF-κB 等的交互作用并不是完全清楚，接下來的工作需要完善該信號網(wǎng)絡(luò)，為基于靶點的藥物設(shè)計提供藥理機(jī)制基礎(chǔ)。