王悅，王樹葉

(哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院血液內(nèi)科，哈爾濱 150001)

彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤(diffuse large B-cell lymphoma，DLBCL)是危及生命的、有顯著生物學(xué)異質(zhì)性的非霍奇金B(yǎng)細(xì)胞淋巴瘤，占所有非霍奇金淋巴瘤的30%～35%[1-2]。雖然它是一種潛在的可治愈的惡性腫瘤，但大多數(shù)患者無法通過補(bǔ)救療法(包括自體干細(xì)胞移植)治愈，約1/3的患者會(huì)發(fā)展成復(fù)發(fā)性/難治性DLBCL(relapsed/refractory diffuse large B-cell lymphoma，R/R DLBCL)[3-4]。DLBCL的預(yù)后由患者特征、腫瘤負(fù)荷、生物學(xué)行為、腫瘤微環(huán)境和治療效果共同決定[5]。因此，對(duì)患者結(jié)果的準(zhǔn)確預(yù)估有助于DLBCL的個(gè)體化治療，既往對(duì)DLBCL患者預(yù)后及治療效果的評(píng)估通常采用國(guó)際預(yù)后指數(shù)(international prognostic index，IPI)[6]。但隨著免疫治療時(shí)代(利妥昔單抗的出現(xiàn))的到來，IPI已不再具有絕對(duì)權(quán)威性，同時(shí)由于腫瘤異質(zhì)性的存在，IPI相似患者的預(yù)后也可能不同。近年來，外泌體作為一種“液體活組織檢查”物質(zhì)被廣泛研究，尤其在血液系統(tǒng)惡性腫瘤DLBCL方面，可通過檢測(cè)患者外周血甚至體液外泌體的含量評(píng)估患者的治療反應(yīng)及預(yù)后，具有較好的臨床應(yīng)用價(jià)值。對(duì)于R/R DLBCL患者，外泌體在免疫治療以及作為藥物載體遞送抗腫瘤藥物方面的應(yīng)用顯示出巨大潛力。外泌體在評(píng)估患者治療反應(yīng)、預(yù)后以及探索R/R DLBCL新的治療方法方面均有重要意義?，F(xiàn)對(duì)DLBCL中外泌體的研究與應(yīng)用進(jìn)展予以綜述。

1 外泌體的概述

1.1外泌體的結(jié)構(gòu) 外泌體是幾乎所有生物活性細(xì)胞均可產(chǎn)生的微小囊泡，是細(xì)胞與細(xì)胞之間通訊的關(guān)鍵信使[7]。外泌體是一種存在于多囊體中的分泌小泡，直徑30～100 nm，能與細(xì)胞膜融合釋放到微環(huán)境中[8]。在腫瘤微環(huán)境中，腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生的外泌體稱為腫瘤細(xì)胞衍生外泌體(exosomes derived from tumor cell，TEX)或腫瘤源性外泌體，同時(shí)腫瘤相關(guān)抗原也在外泌體上。TEX是腫瘤細(xì)胞與微環(huán)境相互作用的重要媒介，通過共享遺傳信息或功能蛋白改變細(xì)胞生物學(xué)功能。TEX由腫瘤細(xì)胞、免疫細(xì)胞、基質(zhì)細(xì)胞、血管和細(xì)胞外基質(zhì)構(gòu)成，其功能隨自身構(gòu)成的動(dòng)態(tài)變化而變化。因此，外泌體可作為細(xì)胞排泄無用或有害RNA和蛋白質(zhì)的主要途徑，并可作為重要信使和載體，改變其他細(xì)胞在正常生理和疾病狀態(tài)下的功能。

1.2外泌體的功能 血液系統(tǒng)惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程長(zhǎng)期且復(fù)雜，受到多種機(jī)制、多種因素的共同影響，腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生的外泌體在該過程中發(fā)揮重要作用，尤其在DLBCL中。

1.2.1介導(dǎo)細(xì)胞通訊 外泌體是生物活性細(xì)胞分泌的納米大小的囊泡，其周圍環(huán)繞脂質(zhì)雙層，攜帶多種生物分子(蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、核酸等)。當(dāng)外泌體被其他細(xì)胞吸收時(shí)，其所攜帶的多種生物分子被轉(zhuǎn)運(yùn)并影響受體細(xì)胞的表型，因此，外泌體被認(rèn)為是細(xì)胞間通訊的重要媒介，主要通過下述3種方式發(fā)揮通訊介導(dǎo)作用：①不同細(xì)胞表面受體與外泌體攜帶的配體結(jié)合，與兩個(gè)細(xì)胞相互作用時(shí)情況相似，但細(xì)胞間不直接接觸。②外泌體與靶細(xì)胞膜結(jié)合，攜帶“新的”表面分子，獲得新的黏附特性。③外泌體與靶細(xì)胞融合，交換膜蛋白和胞質(zhì)溶膠。細(xì)胞間通訊是腫瘤發(fā)展和轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵，T細(xì)胞產(chǎn)生的γ干擾素能上調(diào)腫瘤細(xì)胞表達(dá)程序性細(xì)胞死亡配體1(programmed cell death-ligand 1，PD-L1)，而PD-L1鑲嵌于內(nèi)吞途徑產(chǎn)生的外泌體上，并與細(xì)胞膜融合釋放至微環(huán)境。含有PD-L1的較大微泡可以從細(xì)胞表面以出芽方式產(chǎn)生，外泌體可與腫瘤微環(huán)境中的部分細(xì)胞相互作用，也可以進(jìn)入血液循環(huán)與遠(yuǎn)處細(xì)胞相互作用。值得注意的是，外泌體不僅有原發(fā)性腫瘤微環(huán)境中的局部信號(hào)，還有腫瘤向轉(zhuǎn)移部位發(fā)出遠(yuǎn)程信號(hào)，以促進(jìn)適宜的轉(zhuǎn)移前生態(tài)位的形成，該生態(tài)位能夠運(yùn)輸和轉(zhuǎn)移生物活性分子，將在播散性腫瘤細(xì)胞到達(dá)時(shí)促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)[9-10]。雖然外泌體可通過細(xì)胞與細(xì)胞間的交流、胞膜與胞膜的融合以及表達(dá)相應(yīng)蛋白等促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展，但其在DLBCL上介導(dǎo)細(xì)胞間通訊的具體機(jī)制尚不清楚。

1.2.2外泌體重編輯骨髓 骨髓造血微環(huán)境是血液系統(tǒng)惡性腫瘤發(fā)病機(jī)制的重要因素之一，腫瘤細(xì)胞可利用外泌體作為生長(zhǎng)因子、細(xì)胞因子、酶、血管生成分子和遺傳物質(zhì)的載體來重新改造骨髓微環(huán)境，以促進(jìn)血液系統(tǒng)惡性腫瘤的發(fā)生。Peinado等[10]首次證實(shí)，TEX可作為破壞造血干細(xì)胞以及正常細(xì)胞造血功能的新的生物因子，而黑色素瘤衍生的外泌體可通過介導(dǎo)MET癌蛋白的轉(zhuǎn)移“指引”骨髓造血干細(xì)胞支持黑色素瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。Kumar等[11]的研究表明，急性髓系白血病源性外泌體通過上調(diào)DKK1(一種正常造血和成骨的抑制劑)將骨髓培養(yǎng)成適合白血病細(xì)胞生長(zhǎng)和抑制正常造血的微環(huán)境。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞可以接收成人T細(xì)胞白血病/淋巴瘤源性外泌體的相關(guān)基因，激活核因子κB通路，從而造成白血病細(xì)胞增殖、遷移和血管生成。此外，慢性髓系白血病患者外周血還可釋放雙調(diào)蛋白的外泌體，并通過其激活表面生長(zhǎng)因子受體進(jìn)而重編輯骨髓，導(dǎo)致慢性髓系白血病的發(fā)生。因此，外泌體通過其產(chǎn)生的基質(zhì)直接或間接地抑制骨髓微環(huán)境、重新編輯骨髓微環(huán)境，進(jìn)而抑制正常造血功能，并為腫瘤細(xì)胞提供生長(zhǎng)、增殖、轉(zhuǎn)移的有利環(huán)境。

1.2.3外泌體參與免疫逃逸 腫瘤患者體內(nèi)的腫瘤細(xì)胞需要經(jīng)歷各種轉(zhuǎn)化，以躲避機(jī)體的免疫監(jiān)測(cè)。由于TEX中含有腫瘤特異性抗原等物質(zhì)，能夠參與腫瘤細(xì)胞的免疫逃逸[12]，外泌體在免疫系統(tǒng)中發(fā)揮信號(hào)作用，可將未成熟樹突狀細(xì)胞上的主要組織相容性復(fù)合體分子轉(zhuǎn)移到其他樹突狀細(xì)胞，從而激活免疫反應(yīng)。TEX介導(dǎo)免疫抑制可通過結(jié)合受體細(xì)胞膜表面分子激活或抑制相關(guān)蛋白受體發(fā)出信號(hào)并啟動(dòng)下游通路。TEX上有較多自然殺傷細(xì)胞活化型受體NKG2D的配體，故可通過降低自然殺傷細(xì)胞活化型受體NKG2D的數(shù)量影響自然殺傷細(xì)胞、自然殺傷T細(xì)胞和細(xì)胞毒性T細(xì)胞的功能[13]。TEX還可以導(dǎo)致T細(xì)胞功能受損，使受外泌體影響的T細(xì)胞在腫瘤抗原的持續(xù)刺激下上調(diào)程序性細(xì)胞死亡受體-1、細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞相關(guān)抗原4和B/T淋巴細(xì)胞弱化因子，并激活Fas/FasL途徑誘導(dǎo)T細(xì)胞凋亡，引起DLBCL[14]。外泌體表面的PD-L1與腫瘤進(jìn)展有關(guān)，攜帶免疫抑制蛋白PD-L1的TEX，可使免疫細(xì)胞喪失活性，使其不能識(shí)別和殺傷腫瘤細(xì)胞。此外，致癌病毒也可以利用外泌體調(diào)節(jié)細(xì)胞微環(huán)境，逃避免疫系統(tǒng)的識(shí)別并加速腫瘤進(jìn)展，從而使病毒誘導(dǎo)的淋巴細(xì)胞瘤復(fù)雜化[15-16]。免疫監(jiān)控是人體避免腫瘤發(fā)生的關(guān)鍵調(diào)控機(jī)制，目前外泌體可通過自身特性調(diào)節(jié)自身囊泡表面所分泌的物質(zhì)，使腫瘤細(xì)胞逃避人體正常的免疫監(jiān)控及免疫清除機(jī)制，這有助于尋找免疫逃逸過程的關(guān)鍵點(diǎn)，針對(duì)其研發(fā)出特定的靶向藥物，以避免腫瘤的進(jìn)一步發(fā)展。

1.2.4外泌體參與重塑微環(huán)境 微環(huán)境是生物體細(xì)胞生存的基本環(huán)境，其穩(wěn)態(tài)是維持細(xì)胞正常生長(zhǎng)、增殖、分化和代謝的正常條件，微環(huán)境的重塑是腫瘤發(fā)生發(fā)展的一個(gè)關(guān)鍵因素。淋巴瘤源性外泌體含有參與抗原呈遞的蛋白質(zhì)，腫瘤細(xì)胞可將外泌體作為細(xì)胞因子、血管生成因子和遺傳物質(zhì)等載體重塑腫瘤微環(huán)境。外泌體與靶細(xì)胞質(zhì)膜融合后，以不同方式促進(jìn)功能和表型改變，重塑適應(yīng)疾病進(jìn)展的微環(huán)境。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞內(nèi)吞淋巴瘤外泌體后，產(chǎn)生CC趨化因子受體2招募大量巨噬細(xì)胞，進(jìn)而促進(jìn)淋巴瘤的生長(zhǎng)[17]。MYD88突變的淋巴瘤B細(xì)胞衍生的外泌體能夠觸發(fā)肥大細(xì)胞和巨噬細(xì)胞中促炎信號(hào)的激活，將腫瘤微環(huán)境重新編程為腫瘤促進(jìn)子，改變微環(huán)境導(dǎo)致腫瘤發(fā)生。在EB病毒陽性DLBCL中，TEX攜帶的EB病毒來源的非編碼RNA能夠被單核巨噬細(xì)胞吞噬，促進(jìn)腫瘤壞死因子-α、白細(xì)胞介素-10、Arg1基因的表達(dá)，導(dǎo)致巨噬細(xì)胞變化，淋巴增生性疾病的加重[18]。同時(shí)，腫瘤可通過其所分泌的外泌體改變其自身代謝，使其重編程，并向腫瘤細(xì)胞提供存活所需的物質(zhì)，以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)。TEX通過抑制抗腫瘤免疫反應(yīng)，或通過促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移過程中血管生成或腫瘤向身體其他部位的遷移促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)。綜上，外泌體可通過釋放、誘導(dǎo)產(chǎn)生與DLBCL相關(guān)的炎癥介質(zhì)等細(xì)胞因子促進(jìn)間充質(zhì)干細(xì)胞增殖，進(jìn)而促進(jìn)DLBCL進(jìn)展。

1.2.5外泌體抵抗化療藥物 在接受一系列治療后，DLBCL患者短期內(nèi)進(jìn)入復(fù)發(fā)/難治階段，這在很大程度上源于腫瘤對(duì)化療藥物的耐藥。研究表明，DLBCL來源外泌體可通過轉(zhuǎn)移多藥耐藥蛋白和微RNA(microRNA，miRNA/miR)、輸出殺腫瘤藥物及中和抗體藥物來影響耐藥性，在前列腺癌治療上，外泌體可誘導(dǎo)腫瘤對(duì)多西他賽等化療藥物產(chǎn)生耐藥，導(dǎo)致腫瘤進(jìn)展[19-20]。在Qin等[21]的研究中，順鉑耐藥的肺癌細(xì)胞釋放的外泌體，通過下調(diào)miR-1005p誘導(dǎo)受體細(xì)胞耐藥，進(jìn)而增加哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白表達(dá)，表明外泌體可通過調(diào)節(jié)細(xì)胞因子等誘導(dǎo)腫瘤對(duì)化學(xué)藥物的耐受性。一項(xiàng)關(guān)于B細(xì)胞淋巴瘤的研究表明，外泌體可能參與細(xì)胞中阿霉素和像素酮的輸出，且吲哚美辛對(duì)ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)體A3的消耗抑制了外泌體的生物發(fā)生，并增強(qiáng)了藥物的核捕獲，增加了其對(duì)DLBCL細(xì)胞系的細(xì)胞抑制功效，提示可通過靶向外源性生物合成來克服化療耐藥性并提高藥物療效[22]。TEX使癌細(xì)胞能夠調(diào)節(jié)自身周圍環(huán)境，其攜帶生存和增殖信號(hào)分子，協(xié)助腫瘤免疫逃避并獲得耐藥性，外泌體介導(dǎo)藥物外排減少并減緩抗癌藥物的滲透，進(jìn)而影響疾病的發(fā)生發(fā)展。由此可見，在DLBCL治療上，可通過減少外泌體釋放降低腫瘤對(duì)化療藥物的抗性，盡可能發(fā)揮化療藥物的療效，以延長(zhǎng)DLBCL患者的無進(jìn)展生存期，并提高治療的總有效率。

2 外泌體在DLBCL中的應(yīng)用

2.1DLBCL生物標(biāo)志物 外泌體被認(rèn)為是“液體活組織檢查”的成熟形式，富含各種生物流體，可實(shí)現(xiàn)腫瘤的無創(chuàng)性早期診斷、預(yù)后及治療反應(yīng)評(píng)估。外泌體miRNA和蛋白質(zhì)是一種有效方法[23]。有證據(jù)表明，外泌體可作為血液系統(tǒng)腫瘤的監(jiān)測(cè)指標(biāo)[24]。R/R DLBCL患者、對(duì)化療藥物有良好反應(yīng)性患者、健康成人之間的外周血外泌體含量有顯著差異[25]。Zare等[26]的研究發(fā)現(xiàn)，外泌體miR-155、let-7g和let-7i可能作為評(píng)估接受標(biāo)準(zhǔn)化療DLBCL患者治療反應(yīng)的潛在預(yù)后指標(biāo)。Higuchi等[18]的研究認(rèn)為，BamHI片段miRNA或可成為EB病毒陽性DLBCL的一種診斷標(biāo)志物，含有BamHI片段miRNA的外泌體可能成為一種有前途的診斷工具和B細(xì)胞淋巴瘤治療的新靶點(diǎn)。一項(xiàng)研究報(bào)道，包括血漿囊泡在內(nèi)的miRNA水平可反映單個(gè)經(jīng)典型霍奇金淋巴瘤患者的存在、治療反應(yīng)和復(fù)發(fā)[27]。Hong等[28]報(bào)道，與健康對(duì)照組相比，確診且未治療急性髓系白血病患者血漿中衍生的外泌體蛋白質(zhì)和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1水平顯著增高，并在誘導(dǎo)治療后下降，鞏固治療期間有所上升，患者達(dá)到長(zhǎng)期緩解后恢復(fù)正常。Peng等[29]發(fā)現(xiàn)，急性髓系白血病患者的治療反應(yīng)和預(yù)后與外泌體表達(dá)的miR-34c-5p水平顯著相關(guān)。Allenson等[30]證實(shí)，血漿外泌體DNA可用于早期檢測(cè)惡性腫瘤患者的特異性突變?？梢?，外周血以及患者腫瘤組織中的外泌體均可能成為預(yù)測(cè)患者疾病進(jìn)展、評(píng)估藥物療效及患者生存的生物標(biāo)志物，但其臨床應(yīng)用還有待深入探索。

2.2DLBCL靶向藥物新載體 在循環(huán)穩(wěn)定性、免疫逃逸、毒性等方面，外泌體較其他合成藥物遞送載體(如脂質(zhì)體、合成納米顆粒和重組病毒載體)更適用于藥物遞送。外泌體的“天然”特征使其成為囊泡傳遞載體的理想替代品:①外泌體的微小體積有助其在細(xì)胞間轉(zhuǎn)移；②外泌體結(jié)構(gòu)和組成保護(hù)分子免受核酸酶和蛋白酶的作用；③外泌體的免疫原性和毒性相對(duì)較低；④特定表面蛋白質(zhì)和脂質(zhì)的存在使循環(huán)中的外泌體趨于穩(wěn)定，并使其細(xì)胞和組織特異性具有趨向性[31]。外泌體能夠?qū)ⅰ柏浳铩边\(yùn)送到其他細(xì)胞，并可改變靶細(xì)胞的基因表達(dá)、信號(hào)傳遞等功能；外泌體能夠裝載特異物質(zhì)，并成為細(xì)胞間遺傳物質(zhì)交換和通訊的載體。通過外泌體轉(zhuǎn)運(yùn)的核糖核酸物種可轉(zhuǎn)錄成互補(bǔ)DNA或在受體細(xì)胞內(nèi)翻譯。將外泌體作為載體的藥物可以提高特定“貨物”治療疾病的靶向性，如裝載多柔比星的外泌體用于抑制乳腺癌和結(jié)腸癌的生長(zhǎng)，效果較為顯著。外泌體的存在可能為DLBCL患者提供一種新的治療方案，且外泌體作為藥物載體的給藥方式多樣，可靜脈注射、直接注射于瘤體內(nèi)、鼻腔給藥，有利于藥物的臨床應(yīng)用。新的藥物載體應(yīng)較現(xiàn)有藥物載體具有更強(qiáng)的靶向性，由于外泌體的天然靶向性不強(qiáng)，需要通過基因工程等修飾作用增強(qiáng)外泌體的靶向性，以使外泌體成為新一代靶向藥物。

2.3DLBCL免疫治療新方法 腫瘤免疫治療依賴于人體自身免疫系統(tǒng)的功能，是一種理想的治療方式，不良反應(yīng)小。腫瘤來源的外泌體含有內(nèi)源性腫瘤抗原，它們與免疫系統(tǒng)相互作用，可為開發(fā)新的免疫治療策略提供幫助?；诖?，外泌體的抗腫瘤免疫作用已用于抗癌疫苗的研發(fā)。同時(shí)，外泌體也是一種有價(jià)值的免疫治療劑，在腫瘤免疫治療的臨床前研究中有重要意義，由于B細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞源性的外泌體負(fù)載肽或全蛋白抗原，具有誘導(dǎo)抗原特異性T細(xì)胞和B細(xì)胞反應(yīng)的能力。Chen等[32]的研究評(píng)估了熱休克小鼠B淋巴瘤細(xì)胞源性的外泌體在誘導(dǎo)抗腫瘤免疫反應(yīng)中的功效，證明HS-Exo可通過激活T細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞誘導(dǎo)強(qiáng)抗腫瘤免疫應(yīng)答。此外，通過激活腫瘤特異性CD4+和CD8+的γ干擾素細(xì)胞，從攜帶T細(xì)胞淋巴瘤的小鼠腹水中分離的外泌體能表達(dá)CD24和熱激蛋白90誘導(dǎo)腫瘤特異性體液和細(xì)胞免疫應(yīng)答[33]。外泌體免疫的T細(xì)胞顯示出特異性的抗淋巴瘤細(xì)胞特點(diǎn)。傳統(tǒng)的免疫治療往往基于腫瘤組織進(jìn)行，而DLBCL患者腫瘤組織取材相對(duì)困難，且局部取材可能存在腫瘤異質(zhì)性，但基于外泌體而產(chǎn)生的免疫治療的取材可極大程度上避免局部取材異質(zhì)性，因此外泌體有望成為一種新的免疫治療標(biāo)志物。隨著對(duì)外泌體研究的不斷深入，針對(duì)淋巴瘤來源的相關(guān)抗原免疫治療具有可觀前景，且外泌體來源的免疫治療“新生物”具有潛在優(yōu)勢(shì)。

3 展 望

在液體活組織檢查時(shí)代，TEX在DLBCL的診斷和治療等方面有巨大的應(yīng)用前景。在淋巴瘤病程進(jìn)展中，DLBCL源性外泌體通過改變腫瘤微環(huán)境、拮抗化療藥物、重編輯骨髓等方式影響DLBCL的進(jìn)程及患者預(yù)后，并可作為淋巴瘤患者的生物標(biāo)志物，預(yù)測(cè)疾病發(fā)展變化趨勢(shì)。目前，對(duì)外泌體的相關(guān)研究較多，但對(duì)其運(yùn)載藥物、靶向治療以及相關(guān)機(jī)制的研究較少。此外，由于缺乏標(biāo)準(zhǔn)化的分離和定量方法，外泌體的臨床應(yīng)用尚未充分開發(fā)。未來，可致力于外泌體及其相關(guān)蛋白、miRNA等在免疫治療方面的研究。