謝靜靜，楊永壽，郝芳芳，肖培云

(1.大理大學(xué)藥學(xué)與化學(xué)學(xué)院，大理 671000；2.浙江省溫州市第七人民醫(yī)院藥劑科，溫州 325100)

美洲大蠊(PeriplanetaamericanaL.)俗稱(chēng)蟑螂，其藥用最早記載于《神農(nóng)本草經(jīng)》中[1]，近年來(lái)，美洲大蠊的藥用價(jià)值受到越來(lái)越多關(guān)注。研究表明，美洲大蠊具有廣泛的藥理活性，包括促進(jìn)組織修復(fù)、抗氧化、抗纖維化等作用[2-6]，美洲大蠊中含有多肽、黏糖氨酸、多元醇等[7]。課題組前期通過(guò)體內(nèi)外試驗(yàn)篩選得到美洲大蠊抗肝纖維化活性部位(命名為PA-B)，研究表明美洲大蠊提取物灌胃給藥對(duì)實(shí)驗(yàn)性肝纖維化大鼠具有較好的治療作用[8-9]。因此，考慮以制劑工藝簡(jiǎn)單、便于包裝、口服方便的顆粒劑作為制劑進(jìn)行研究。由于該提取物成分復(fù)雜，其中的黏糖氨酸類(lèi)物質(zhì)易吸濕結(jié)塊，不利于藥物的保存，影響藥物的穩(wěn)定性。近年來(lái)，響應(yīng)面法多應(yīng)用于制劑工藝的優(yōu)化[10-11]，因此本研究利用單因素實(shí)驗(yàn)對(duì)常用抗?jié)裥暂o料進(jìn)行初步篩選，再利用星點(diǎn)設(shè)計(jì)-響應(yīng)面法優(yōu)化美洲大蠊抗肝纖維化活性部位顆粒的成型工藝，以改善藥物的吸濕性，獲得具有一定抗?jié)裥阅艿念w粒，增強(qiáng)美洲大蠊活性部位的穩(wěn)定性，為后續(xù)制劑的進(jìn)一步研究開(kāi)發(fā)提供依據(jù)。

1 材料

1.1儀器 TEMI880綜合藥品穩(wěn)定性試驗(yàn)箱(上海藍(lán)豹試驗(yàn)設(shè)備有限公司)；DHG-9420A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海一恒科技有限公司)；AL204-IC分析天平(梅特勒-托利多儀器有限公司，感量：0.1 mg)；GB/6003.1-2012藥篩(紹興市上虞圣超儀器設(shè)備有限公司)。

1.2試劑及藥材 美洲大蠊藥材由云南京新生物科技有限公司大理巍山養(yǎng)殖場(chǎng)提供(批號(hào)：M190801)，經(jīng)大理大學(xué)云南省昆蟲(chóng)生物醫(yī)藥研發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室楊自忠鑒定為：昆蟲(chóng)綱蜚蠊科昆蟲(chóng)美洲大蠊(PeriplanetaamericanaL.)；美洲大蠊抗肝纖維化活性部位凍干粉(課題組自制，采用課題組前期提取純化工藝進(jìn)行制備[12-13]，每克凍干粉相當(dāng)于生藥137 g，批號(hào)：20180824，20180911，20180918)；乳糖(批號(hào)：180924)、微晶纖維素(microcrystalline cellulose，MCC，批號(hào)：190114)、玉米淀粉(批號(hào)：190223)、糊精(批號(hào)：190108)均購(gòu)自陜西盤(pán)龍醫(yī)藥股份有限公司(藥用級(jí)別)；乙醇(天津市福晨化學(xué)儀器廠，批號(hào)：20160712)；其余試劑均為分析純，水為雙蒸水。

2 方法與結(jié)果

2.1顆粒成型工藝單因素考察

2.1.1輔料初步篩選 乳糖、微晶纖維素、玉米淀粉、糊精4種輔料，以吸濕百分率為指標(biāo)進(jìn)行考察，初步篩選適宜輔料，方法參照《中華人民共和國(guó)藥典》2020版四部通則9103藥物引濕性指導(dǎo)原則測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表1，由表1可知，120 h各輔料吸濕平衡后，乳糖與微晶纖維素吸濕性較低，糊精吸濕性最強(qiáng)。微晶纖維素是常用的成球促進(jìn)劑，具有較好的成型性，在中成藥制劑選用較多，而乳糖價(jià)格較高，實(shí)用性差，且增加使用成本。考慮生產(chǎn)成本及吸濕性，初步選用淀粉及微晶纖維素進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)研究。

將藥物與初步篩選的輔料按1：1混勻，加適量70%乙醇為潤(rùn)濕劑，20目(孔徑為0.85 mm)篩制粒，烘箱干燥，以成型率為評(píng)價(jià)指標(biāo)考察單一輔料及混合后與藥物配伍情況。研究發(fā)現(xiàn)微晶纖維素顆粒成粉性較強(qiáng)，單獨(dú)與藥物配伍使用時(shí)顆粒平均成型率43.84%；而單獨(dú)使用淀粉時(shí)平均成型率79.21%，但制得的軟材過(guò)篩時(shí)黏篩情況嚴(yán)重，過(guò)篩困難導(dǎo)致物料浪費(fèi)嚴(yán)重。因此最終確定輔料混合使用，可改善黏篩情況且成型率較好。

顆粒成型率(%)=成型顆粒質(zhì)量/總顆粒質(zhì)量。

2.1.2藥輔比例考察 先將淀粉和MCC按1：1混勻，得混合輔料，再將藥物與混合輔料按1：1，1：2，1：3，1：4混勻，測(cè)定吸濕率及成型率，兩者綜合評(píng)分為評(píng)價(jià)指標(biāo)，得出最終選用藥輔比例，吸濕率與成型率評(píng)分系數(shù)分別為60%和40%，見(jiàn)公式(1)。測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表2，當(dāng)藥輔比為1：1時(shí)，由于藥物比例較大，成團(tuán)性較強(qiáng)，黏篩導(dǎo)致物料浪費(fèi)嚴(yán)重，故綜合評(píng)分未列入比較?？紤]適當(dāng)增加輔料的比例，當(dāng)藥輔比例為1：3時(shí)綜合評(píng)分最高，暫定藥輔比1：3進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)，后續(xù)通過(guò)響應(yīng)面分析優(yōu)化得到最優(yōu)藥輔比例。

公式(1)

2.1.3輔料比例考察 在藥輔比例為1：3條件下，將藥物與不同比例的MCC與淀粉(MCC：淀粉分別為3：1，2：1，1：1，1：2，1：3)，以吸濕率及成型率為評(píng)價(jià)指標(biāo)得出最終選用的藥輔比例，由考察結(jié)果見(jiàn)表3可知，綜合評(píng)分無(wú)顯著性差異，但淀粉比例升高，制粒時(shí)軟材粘性較大，而凍干粉本身具有一定粘性，二者混合后黏篩較嚴(yán)重，因此最終選用比例1：1進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)優(yōu)化。

2.1.4潤(rùn)濕劑濃度考察 在藥輔比例及輔料比例考察的基礎(chǔ)上，按表4加入適量乙醇為潤(rùn)濕劑，濕顆粒于60 ℃干燥4 h后整粒，以綜合評(píng)分為考察指標(biāo)篩選最優(yōu)潤(rùn)濕劑濃度。由表4可知，乙醇濃度在60%～90%范圍內(nèi)，綜合評(píng)分無(wú)顯著差異，但70%與80%濃度時(shí)評(píng)分較高，醇的濃度升高，制軟材時(shí)不易誘發(fā)藥物本身的粘性而粘連在一起，同時(shí)醇的濃度會(huì)影響成型率。因此選用60%～90%濃度范圍進(jìn)行響應(yīng)面設(shè)計(jì)優(yōu)化，優(yōu)選最佳乙醇濃度。

表1 輔料吸濕率考察結(jié)果

表2 藥輔比例考察結(jié)果

表3 輔料比例考察結(jié)果

表4 潤(rùn)濕劑濃度考察結(jié)果

2.2響應(yīng)面法優(yōu)化顆粒成型工藝

2.2.1試驗(yàn)設(shè)計(jì) 以輔料-凍干粉用量比例(A)、MCC-淀粉用量比例(B)、潤(rùn)濕劑濃度(C)為影響因素，顆粒吸濕率及成型率的總評(píng)“歸一值”為評(píng)價(jià)指標(biāo)，采用中心組合(CCD)三因素五水平設(shè)計(jì)(+1、-α、0、+α、-1)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，因素水平表見(jiàn)表5。數(shù)據(jù)采用Hassan法轉(zhuǎn)化為對(duì)應(yīng)的歸一值，吸濕率采用公式d1，成型率采用公式d2計(jì)算，總評(píng)OD=(d1×d2)0.5，測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表6。

表5 因素水平表

2.2.2模型擬合 應(yīng)用 Design Expert 8.0.6版軟件分析，多元線性回歸、二項(xiàng)式和三項(xiàng)式擬合，并以相關(guān)系數(shù)(r)和置信度(P)為模型判定標(biāo)準(zhǔn)，選擇有較大r值和較優(yōu)P值對(duì)方程進(jìn)行優(yōu)化。多元線性回歸的復(fù)相關(guān)系數(shù)較低，三項(xiàng)式擬合方程失擬項(xiàng)顯著(P=0.009 3)，表示模型擬合度不高，存在失擬情況，所以不宜用線性和三次項(xiàng)模型。而多元二項(xiàng)式回歸各擬合方程復(fù)相關(guān)系數(shù)均較高，表明具體實(shí)驗(yàn)因素對(duì)效應(yīng)值的影響不是簡(jiǎn)單的線性關(guān)系，最后選擇多元二項(xiàng)式擬合模型為成功模型。

二項(xiàng)式方程：Y=0.601 62-0.190 20A+0.058 319B+0.095 048C-0.072 250AB-0.0341 00AC-0.080 775BC-0.085 614A2-0.051 001B2-0.123 37C2(r=0.928 9，P=0.000 1)。

二項(xiàng)式方差分析結(jié)果見(jiàn)表7，模型中A、C、A2、C2極顯著(P<0.01)，B、AB、BC顯著(P<0.05)，其他不顯著。各因素對(duì)成型工藝的影響程度依次為A>C>B，相關(guān)系數(shù)r為0.928 9，二次項(xiàng)模型P<0.05，失擬項(xiàng)P>0.05，擬合性較好，結(jié)果具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.2.3響應(yīng)面分析 通過(guò)響應(yīng)面分析，考察因素對(duì)于響應(yīng)值的殘差正態(tài)分布散點(diǎn)成較好的直線分布，殘差服從正態(tài)分布，說(shuō)明對(duì)隨機(jī)誤差具有較好的擬合。殘差與方程預(yù)測(cè)值對(duì)應(yīng)散點(diǎn)分布分析，殘差與方程預(yù)測(cè)值對(duì)應(yīng)散點(diǎn)分布分散，無(wú)規(guī)律，說(shuō)明殘差在-4～4之間可以解釋大部分預(yù)測(cè)值，證明回歸方程是有效的。圖1，2，3分別為不同的響應(yīng)因素對(duì)于響應(yīng)值的3D響應(yīng)面圖。實(shí)驗(yàn)因素所構(gòu)成的三維空間曲面圖反映兩變量間交互作用的顯著程度，其中3D響應(yīng)面的曲線陡峭程度反映了該因素下對(duì)響應(yīng)值的影響大小。對(duì)于響應(yīng)值總評(píng)歸一值來(lái)說(shuō)，藥輔比(A)較輔料比(B)和乙醇濃度(C)的曲面陡峭，說(shuō)明藥輔比對(duì)響應(yīng)值影響最大。輔料比(B)乙醇濃度(C)交互作用時(shí)，等高線排列趨于橢圓形，對(duì)響應(yīng)值影響較大，乙醇濃度等高線密集，比較輔料比例對(duì)響應(yīng)值影響較大，因此，綜合各因素對(duì)成型工藝響應(yīng)值的影響程度依次為藥輔比(A)>乙醇濃度(C)>輔料比(B)。

表6 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

表7 二項(xiàng)式方差分析結(jié)果

圖1 輔料比例與藥輔比例對(duì)響應(yīng)值的影響

圖2 藥輔比例與乙醇濃度對(duì)響應(yīng)值的影響

2.2.4驗(yàn)證實(shí)驗(yàn) 軟件擬合最佳工藝條件為輔料-凍干粉質(zhì)量比2.84：1，MCC-淀粉質(zhì)量比1.37：1，乙醇體積分?jǐn)?shù)77.4%，預(yù)測(cè)總評(píng)“歸一值”0.676 6。按最優(yōu)條件制備3批抗?jié)裥灶w粒，批號(hào)為：20190302，20190313，20190324，測(cè)得的成型率為60.48%，吸濕率為5.84%，總評(píng)歸一值為0.683 5，偏差為1.02%，表明該模型具備較高的準(zhǔn)確性和精密性。

2.3顆粒物理性能考察

2.3.1流動(dòng)性考察 取顆粒適量，測(cè)定休止角，休止角<40°表明制得的顆粒流動(dòng)性符合要求。休止角測(cè)定儀測(cè)定顆粒休止角，使漏斗最下端與坐標(biāo)紙保持1 cm高度，沿著漏斗壁倒入適量藥粉，根據(jù)坐標(biāo)紙上形成圓錐體的半徑r，計(jì)算休止角。一般認(rèn)為休止角小于30°時(shí)，流動(dòng)性好，小于40°時(shí)可以滿(mǎn)足生產(chǎn)對(duì)流動(dòng)性的需求[10]。由表8可知，制備的3批顆粒休止角26.09°，流動(dòng)性符合要求。

2.3.2堆密度測(cè)定 分別取適量顆粒，置10 mL量筒中，輕敲量筒壁直至體積不再改變，讀出顆粒的體積，共測(cè)定3次，計(jì)算堆密度，即顆粒質(zhì)量與體積之比[14]。堆密度反應(yīng)物料粉體學(xué)性質(zhì)，可為后續(xù)顆粒的保存及裝填膠囊提供參考。測(cè)得3批顆粒堆密度均值為0.267 2 g·mL-1，結(jié)果見(jiàn)表9。

圖3 輔料比例與乙醇濃度對(duì)響應(yīng)值的影響

表8 休止角考察結(jié)果

表9 堆密度考察結(jié)果

2.3.3顆粒水分測(cè)定 參照《中華人民共和國(guó)藥典》2020年版四部通則0104顆粒劑項(xiàng)下規(guī)定測(cè)定水分，根據(jù)減失的重量，計(jì)算供試品中含水量(%)，水分含量應(yīng)小于8.0%。由表10可知，測(cè)定3批顆粒含水量為5.79%，符合相關(guān)規(guī)定。

表10 水分測(cè)定結(jié)果

3 討論

中藥制劑的吸濕問(wèn)題直接影響中藥的后續(xù)開(kāi)發(fā)，中藥吸濕后含水量較高，易發(fā)生霉變，不僅影響藥物的成型，而且影響藥物的穩(wěn)定。美洲大蠊抗肝纖維化活性部位凍干粉具有較強(qiáng)的粘性和吸濕性[15]，無(wú)法保持良好的粉體性質(zhì)。本研究通過(guò)加入抗?jié)裥缘妮o料，輔料與藥物混勻結(jié)合形成致密的防水屏障，可改善藥物易吸濕的特性，以保證制劑的順利研制。本實(shí)驗(yàn)初步對(duì)乳糖、MCC、玉米淀粉、糊精的吸濕性進(jìn)行了考察，篩選出適宜輔料，再將藥物與篩選得到的微晶纖維素及淀粉單獨(dú)配伍及混合輔料配伍，可知混合輔料與藥物配伍時(shí)，過(guò)篩情況及成型率較好。響應(yīng)面法相較于正交設(shè)計(jì)優(yōu)化工藝，可對(duì)結(jié)果進(jìn)行連續(xù)的預(yù)測(cè)分析，而后者僅對(duì)單一組合進(jìn)行篩選，響應(yīng)面分析是當(dāng)前對(duì)結(jié)果進(jìn)行模型預(yù)測(cè)分析的熱點(diǎn)。因此，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)合星點(diǎn)設(shè)計(jì)-響應(yīng)面法優(yōu)化美洲大蠊抗肝纖維化活性部位的制粒工藝，工藝參數(shù)中藥輔質(zhì)量比、輔料比例及乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)影響所制軟材手捏成團(tuán)輕壓即散的性狀，最終直接影響顆粒的成型率及吸濕率，將二者數(shù)值的歸一值作為最終響應(yīng)指標(biāo)進(jìn)行擬合優(yōu)化，得到最佳條件為輔料：凍干粉質(zhì)量比2.84：1，MCC：淀粉質(zhì)量比1.37：1，乙醇體積分?jǐn)?shù)77.4%，各因素對(duì)響應(yīng)值的影響大小為藥輔質(zhì)量比(A)>乙醇體積分?jǐn)?shù)(C)>輔料質(zhì)量比(B)，通過(guò)響應(yīng)面優(yōu)化輔料與藥物配比工藝，可改善藥物吸濕易成團(tuán)的性質(zhì)。對(duì)優(yōu)化所得的工藝進(jìn)行了驗(yàn)證，并對(duì)所得顆粒的物理性能考察，測(cè)得3批顆粒物理性能指標(biāo)休止角為26.09°，堆密度為0.267 2 g·mL-1，水分含量5.79%，結(jié)果顯示顆粒流動(dòng)性較好，含水量符合規(guī)定，明顯改善美洲大蠊活性部位易成團(tuán)結(jié)塊的性質(zhì)。同時(shí)對(duì)顆粒堆密度進(jìn)行測(cè)定，可為后續(xù)顆粒裝填于膠囊，或與適宜輔料混勻壓片提供依據(jù)。