矣文玲 巨富榮 王立平 蔚鵬飛

1(中國科學(xué)院深圳先進(jìn)技術(shù)研究院 深圳 518055)

2(中國科學(xué)院大學(xué) 北京 100049)

1 引 言

脊髓是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的重要組成結(jié)構(gòu)之一。脊髓作為連接大腦與周圍神經(jīng)系統(tǒng)的橋梁，傳送腦與外周之間的神經(jīng)信息以協(xié)調(diào)生命體正?；顒?dòng)，在軀體感覺和運(yùn)動(dòng)過程中發(fā)揮重要作用[1-2]。近年來，微型化顯微成像技術(shù)的發(fā)展，將光學(xué)顯微成像技術(shù)與鈣離子成像技術(shù)相結(jié)合，實(shí)現(xiàn)了在無束縛環(huán)境中對(duì)自由活動(dòng)的動(dòng)物大腦進(jìn)行高空間分辨率(μm)和高時(shí)間分辨率(ms)的神經(jīng)活動(dòng)圖像采集，且能容忍微米級(jí)的組織運(yùn)動(dòng)[3-4]。微型化活體成像方法的應(yīng)用使腦成像領(lǐng)域的相關(guān)研究取得了突破性進(jìn)展，但中樞神經(jīng)系統(tǒng)的另一關(guān)鍵結(jié)構(gòu)——脊髓的活體成像研究仍難以實(shí)現(xiàn)。這是因?yàn)樾∈笞陨砗粑?、心跳以及運(yùn)動(dòng)引起的脊髓組織無規(guī)則運(yùn)動(dòng)范圍較大，導(dǎo)致脊髓成像時(shí)對(duì)脊髓組織固定困難。加之雙光子顯微鏡成像速度和光學(xué)薄片有限，導(dǎo)致小鼠在體脊髓成像時(shí)出現(xiàn)焦面漂移、圖像扭曲或丟失[1,5]等問題。目前，已報(bào)道的關(guān)于脊髓光學(xué)成像的研究對(duì)象多為麻醉動(dòng)物，鮮有清醒的自由活動(dòng)狀態(tài)的動(dòng)物[2,6]。所以脊髓這一重要的神經(jīng)結(jié)構(gòu)在真實(shí)環(huán)境下如何編碼大腦下行指令和外周輸入信號(hào)尚不清楚[7-8]。

建立一套在自由活動(dòng)狀態(tài)下的動(dòng)物活體脊髓成像方法，是進(jìn)一步探索脊髓在神經(jīng)系統(tǒng)中重要功能的關(guān)鍵途徑之一。目前，自由活動(dòng)狀態(tài)下的動(dòng)物活體脊髓成像仍止步于單光子顯微成像[6]。相較而言，雙光子顯微成像不僅解決了標(biāo)記密集的組織中信號(hào)密集導(dǎo)致無法分辨甚至無法聚焦等問題，顯著提高了圖像比度和在生物體組織內(nèi)的穿透深度，而且能夠?qū)崿F(xiàn)亞細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)高清晰成像。2017 年，程和平團(tuán)隊(duì)自主研發(fā)的微型化雙光子熒光顯微鏡打破了儀器對(duì)動(dòng)物成像研究的限制，能夠在動(dòng)物自由活動(dòng)過程中實(shí)現(xiàn)快速的組織或細(xì)胞雙光子活體成像[9]。目前，高分辨率微型化雙光子熒光顯微鏡的應(yīng)用，使國內(nèi)外自由活動(dòng)的動(dòng)物在體成像領(lǐng)域的相關(guān)研究取得了突破性進(jìn)展[9-12]，也為實(shí)現(xiàn)在小鼠自由活動(dòng)狀態(tài)下的脊髓雙光子成像帶來了契機(jī)。突破脊髓活體成像的技術(shù)壁壘，建立自由活動(dòng)的動(dòng)物脊髓雙光子成像的技術(shù)方法，對(duì)推動(dòng)脊髓功能神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的研究具有重要意義。

脊髓結(jié)構(gòu)的特異性帶來的諸多問題，是實(shí)現(xiàn)自由活動(dòng)的動(dòng)物脊髓成像的一大阻礙。其中，脊髓結(jié)構(gòu)復(fù)雜[1,13]、脊髓組織運(yùn)動(dòng)幅度較大且不規(guī)則、長期成像不穩(wěn)定以及微型化顯微鏡穩(wěn)定植入困難等[14]，導(dǎo)致脊髓活體成像研究面臨一系列挑戰(zhàn)。本文研究基于微型化雙光子熒光顯微鏡，建立一套適用于自由活動(dòng)狀態(tài)下小鼠的脊髓成像技術(shù)方法，以實(shí)現(xiàn)無束縛環(huán)境中自由活動(dòng)的動(dòng)物脊髓雙光子成像。通過采用特定的脊髓固定零件以及固定方法，對(duì)無束縛環(huán)境中自由活動(dòng)的動(dòng)物脊髓前動(dòng)脈血管進(jìn)行長期成像，評(píng)估該方法是否能夠解決目前脊髓活體成像所面臨的問題——組織位移導(dǎo)致的成像抖動(dòng)、微型化顯微鏡固定困難導(dǎo)致的成像不穩(wěn)定等。此外，利用這一方法初步探究軀體感覺和運(yùn)動(dòng)過程中，脊髓的背角神經(jīng)細(xì)胞活動(dòng)對(duì)軀體感覺和運(yùn)動(dòng)信息的編碼?；谖⑿突p光子熒光顯微鏡，建立小鼠自由活動(dòng)狀態(tài)下脊髓活體成像的技術(shù)方法，有望幫助理解自然行為下脊髓神經(jīng)元的活動(dòng)模式和進(jìn)一步探究脊髓的病理變化原因。

2 材料和方法

2.1 動(dòng)物

本文研究中所用動(dòng)物的飼養(yǎng)條件和實(shí)驗(yàn)方案經(jīng)中國科學(xué)院深圳先進(jìn)技術(shù)研究院動(dòng)物倫理委員會(huì)審查通過(編號(hào)：SIAT-IRB-181026-NS-WLP-A0540)。實(shí)驗(yàn)選用年齡為 8～13 周的C57BL/6J 雄鼠(浙江維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司)。其中，脊髓血管成像實(shí)驗(yàn)使用 6 只小鼠，神經(jīng)元鈣信號(hào)采集實(shí)驗(yàn)使用 4 只小鼠。動(dòng)物飼養(yǎng)于無特定病原體的屏障環(huán)境中，照明周期為12 h 光照/12 h 黑暗，飼養(yǎng)溫度為 20～26 ℃。術(shù)后單籠飼養(yǎng) 3 天至基本恢復(fù)后，放回群居飼養(yǎng)籠中正常飼養(yǎng)。

2.2 脊髓手術(shù)

首先建立一種將微型化雙光子顯微鏡植入脊髓的方法，在小鼠自由活動(dòng)的過程中和接受不同外界刺激時(shí)，對(duì)脊髓前動(dòng)脈血管和神經(jīng)元鈣信號(hào)變化進(jìn)行成像觀察。手術(shù)操作步驟大致如下：

(1)脊髓固定。首先，對(duì)小鼠進(jìn)行稱重，采用異氟烷將小鼠深度麻醉，并剔除小鼠背部毛發(fā)。然后，沿著脊柱正中央剪開皮膚，采用眼科剪將脊柱緊貼腰段 3～6 節(jié)段的兩側(cè)肌肉剪開；將小鼠脊椎骨暴露后，盡可能剝離脊椎骨之間的肌肉組織，暴露出完整的脊柱。接下來，借助定制的脊髓固定裝置將脊髓固定零件——V 型槽(圖 1(a))穩(wěn)定嵌入椎骨兩側(cè)以固定脊髓：調(diào)整左右兩側(cè) V 型槽的距離，將腰段 3～5 節(jié)段固定后，調(diào)整橫突位置使完整的橫突置于兩側(cè) V 型槽中，微調(diào)并固定 V 型槽直至基本消除椎骨的抖動(dòng)；使用無菌生理鹽水沖洗創(chuàng)面至無明顯滲血后，用適量的雙氧水處理骨頭表面至表面剩余肌肉組織萎縮；再次使用無菌生理鹽水沖洗至脊椎骨表面無殘余組織碎屑后，縫合頭尾 V 型槽兩側(cè)多余剪開的皮膚。最后，采用壓縮空氣瓶吹干脊椎骨表面以及兩側(cè)縫合皮膚表面的生理鹽水，涂抹 3M 組織膠水以封閉手術(shù)創(chuàng)口周圍皮膚和肌肉，并用無塵紙吸附多余的 3M 組織膠水。

(2)脊髓暴露和 V 型槽植入。采用顱骨鉆打磨選定目標(biāo)成像節(jié)段的椎板，將其磨薄至約25～30 μm 后，輕輕掀開部分脊椎板，以暴露中央前動(dòng)脈血管和周圍脊髓白質(zhì)；清理干凈脊髓表面，隨后采用玻璃蓋玻片隔絕暴露的脊髓組織和空氣，并用牙科水泥輔助密封；同時(shí)，使用牙科水泥將已調(diào)整好位置的 V 型槽穩(wěn)定地黏附于椎骨兩側(cè)，待牙科水泥干透，完成脊髓創(chuàng)口密封和 V型槽植入后縫合周圍皮膚，涂抹適量碘伏消毒。

手術(shù)前將手術(shù)器械和零件進(jìn)行高壓滅菌處理。手術(shù)過程中使用異氟烷維持麻醉狀態(tài)，同時(shí)保持脊髓暴露位置表面濕潤，并采用生理鹽水反復(fù)沖洗暴露位置，防止病菌感染。術(shù)后連續(xù) 6 d進(jìn)行消炎和鎮(zhèn)痛處理。其中，消炎采用獸用青霉素(劑量：0.03 g/kg)，腹腔注射，每天 1 次；鎮(zhèn)痛采用鹽酸曲馬多(劑量：0.3 mL/kg)，手術(shù)當(dāng)天及術(shù)后 2 d 進(jìn)行腹腔注射，每天 1 次。飼養(yǎng) 30 d后進(jìn)行活體成像，其中術(shù)后第 1 周盡量單籠飼養(yǎng)以避免小鼠打斗影響手術(shù)效果。

2.3 活體內(nèi)雙光子熒光顯微成像

采用成像視野為 420 μm×420 μm 的大視場微型化雙光子熒光顯微鏡，在自由活動(dòng)的小鼠中進(jìn)行脊髓前動(dòng)脈血管成像，以評(píng)估無束縛條件下脊髓血管活體成像的圖像穩(wěn)定性與圖像清晰程度。此外，對(duì)不同運(yùn)動(dòng)狀態(tài)下自由活動(dòng)的小鼠的脊髓背角神經(jīng)元鈣信號(hào)活動(dòng)進(jìn)行成像記錄，初步分析小鼠在運(yùn)動(dòng)過程中脊髓如何編碼簡單的運(yùn)動(dòng)和感覺信息。

小鼠術(shù)后恢復(fù) 30 d，將其清醒固定，通過眼窩竇注射 20 μL 濃度為 10 mg/mL 的 FITC-dextran標(biāo)記血管。采用微型化雙光子顯微成像系統(tǒng)對(duì)FITC-dextran 標(biāo)記的脊髓前動(dòng)脈血管進(jìn)行成像位點(diǎn)定位后，在脊髓相應(yīng)位置放置成像套件，并將其和小鼠背部的 V 型槽進(jìn)行穩(wěn)定黏附以固定成像窗口(圖 1(b))；在確定具體成像區(qū)域后，將重量僅 2.8 g 的大視場微型化雙光子顯微鏡鏡頭用螺絲固定在成像套件中(圖 1(c))，對(duì)脊髓內(nèi)同一血管結(jié)構(gòu)進(jìn)行觀察和圖像采集。直至所有成像測試結(jié)束后取下成像套件進(jìn)行回收。

脊髓前動(dòng)脈血管長期成像實(shí)驗(yàn)中，以植入成像套件當(dāng)天為起始記錄日期(Day 1)，每天成像前將微型化雙光子顯微鏡鏡頭重新放入已經(jīng)固定好的成像套件中。脊髓背角神經(jīng)元鈣信號(hào)記錄實(shí)驗(yàn)中，將攜帶遺傳編碼鈣離子指示蛋白基因序列片段GCaMP6s的重組腺病毒注射到脊髓中對(duì)脊髓神經(jīng)元進(jìn)行標(biāo)記。待病毒表達(dá)和手術(shù)恢復(fù) 30 d后，同樣采用上述方法對(duì)脊髓神經(jīng)元鈣信號(hào)活動(dòng)進(jìn)行成像。

2.4 行為學(xué)測試

測試前半小時(shí)將小鼠放入行為學(xué)測試房間中以適應(yīng)測試環(huán)境，測試均在直徑 50 cm×高 50 cm的圓形曠場中進(jìn)行。其中，每項(xiàng)行為學(xué)測試前均讓小鼠先適應(yīng)曠場環(huán)境 1～2 min；所有血管圖像和行為學(xué)視頻均為同步記錄。

自由活動(dòng)：將脊髓已植入大視場微型化雙光子熒光顯微鏡探頭的小鼠放入圓形曠場中，同時(shí)記錄小鼠運(yùn)動(dòng)狀態(tài)和脊髓成像共 5 min 用于數(shù)據(jù)分析。

氣流處理：采用壓縮空氣對(duì)小鼠進(jìn)行急性氣流刺激。在氣流處理前同時(shí)記錄小鼠自由活動(dòng)行為狀態(tài)和脊髓前動(dòng)脈血管圖像；采用壓縮空氣氣流處理 10 s，該時(shí)間段內(nèi)給小鼠 1～3 次氣流處理，每次持續(xù) 1～2 s，以小鼠出現(xiàn)瞬時(shí)速度變化為氣流刺激成功標(biāo)志；在氣流處理后同樣記錄小鼠運(yùn)動(dòng)視頻和血管圖像。以氣流處理的 10 s 時(shí)間窗為中點(diǎn)，截取氣流處理前-中-后各 10 s，連續(xù) 30 s的行為學(xué)視頻和對(duì)應(yīng)的同步血管圖像用于分析。

夾尾處理：用定制的夾子(P＝340 g)[15]夾住小鼠尾巴根部持續(xù) 10 s。以夾尾處理的 10 s 時(shí)間窗為中點(diǎn)，截取夾尾處理前-中-后各 10 s，連續(xù)30 s 的行為學(xué)視頻和對(duì)應(yīng)的同步血管圖像作為分析對(duì)象。

2.5 病毒標(biāo)記

按照“2.2 脊髓手術(shù)”中的操作暴露脊髓上表面后，首先采用滅菌的生理鹽水清理干凈脊髓表面；接下來，借助微量病毒注射泵進(jìn)行病毒注射，以中央動(dòng)脈血管為坐標(biāo)零點(diǎn)，將注射位點(diǎn)調(diào)整至距中央前動(dòng)脈血管左側(cè) 300～400 μm(灰質(zhì)區(qū)間)、深度 250 μm，在 20 min 內(nèi)緩緩?fù)迫?300 nL AAV9-CaMKIIα-GCaMP6s 病毒[16]；最后，采用玻璃蓋玻片以及牙科水泥密封暴露的脊髓，并縫合周圍皮膚，待病毒表達(dá) 21 d 后進(jìn)行活體成像。

2.6 數(shù)據(jù)處理

圖像位移統(tǒng)計(jì)：基于同步記錄的行為學(xué)視頻，選取目標(biāo)時(shí)間段內(nèi)的血管圖像，采用 ImageJ對(duì)圖像進(jìn)行分析。具體步驟如下：(1)采用“Image”→“Z-projector”→“Average intensity”，獲取目標(biāo)時(shí)間段內(nèi)連續(xù)圖像的平均投影；(2)將不同時(shí)間的圖像采用“Image”→“Merge Channels”進(jìn)行處理，并對(duì)不同時(shí)間段的圖像進(jìn)行標(biāo)記和重疊，通過測量圖像中血管同一位置之間的距離，評(píng)估不同時(shí)段內(nèi)圖像間位移。在比較不同時(shí)段內(nèi)圖像間位移時(shí)，對(duì)頭尾軸和左右軸分別選取 8 個(gè)血管位點(diǎn)進(jìn)行位移統(tǒng)計(jì)，并分別取平均值作為目標(biāo)圖像之間的頭尾軸圖像位移和左右軸圖像位移。其中，在自由活動(dòng)狀態(tài)下的血管圖像位移，則選取整個(gè)分析時(shí)段內(nèi)前 20 張血管圖像與剩余圖像進(jìn)行對(duì)比，來估算活動(dòng)期間血管圖像的位移情況。

鈣成像數(shù)據(jù)分析：采用大視場微型化雙光子顯微鏡對(duì)脊髓背角神經(jīng)元進(jìn)行成像，激發(fā)光波長為 920 nm。成像視野：420 μm×420 μm；成像XY像素：512×512；采集幀率：4.84 Hz，單向掃描。收集鈣成像圖像后，采用 ImageJ 軟件對(duì)單個(gè)神經(jīng)元鈣信號(hào)進(jìn)行分析。具體步驟如下：首先，采用“Plugin”→“Process”→“Running z-projector”對(duì)圖像進(jìn)行預(yù)處理，隨后采用插件“Plot z-axis profile”分析選定細(xì)胞的熒光變化強(qiáng)度，分析后收集脊髓背角神經(jīng)元鈣活動(dòng)變化規(guī)律。熒光信號(hào)變化計(jì)算公式為 ΔF/F0＝(F－F0)/F0×100%，其中F0指目標(biāo)行為事件發(fā)生前 10 s時(shí)間窗內(nèi)的平均熒光信號(hào)基線。

行為學(xué)數(shù)據(jù)分析：小鼠行為學(xué)視頻片段使用Anymaze 動(dòng)物行為學(xué)分析軟件和 Matlab 進(jìn)行分析。提取分析的時(shí)段內(nèi)小鼠運(yùn)動(dòng)距離以及運(yùn)動(dòng)速度作為運(yùn)動(dòng)能力評(píng)估指標(biāo)。

2.7 統(tǒng)計(jì)與分析

使用 GraphPad Prism 或 Microsoft Excel 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行繪圖。所有的數(shù)據(jù)分析均在 GraphPad Prism9.0 中完成，圖中均表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差。長期成像的圖像位移比較采用雙因素方差分析，運(yùn)動(dòng)能力評(píng)估采用單因素方差分析，其余實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用非配對(duì) t 檢驗(yàn)。其中，統(tǒng)計(jì)顯著性表示為：*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001，“ns”表示無顯著性差異。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 自由活動(dòng)的小鼠脊髓前動(dòng)脈血管的雙光子成像

在小鼠背部脊髓植入大視場微型化雙光子熒光顯微鏡探頭，對(duì)自由活動(dòng)小鼠的脊髓淺層組織進(jìn)行成像，同步采集圓形曠場中小鼠實(shí)時(shí)行為學(xué)視頻和血管圖像(圖 1(d))。其中，脊髓固定裝置的設(shè)計(jì)，是實(shí)現(xiàn)微型化雙光子顯微鏡植入脊髓中的前提。借助定制的脊髓固定裝置(圖 1(a))，通過手術(shù)將小鼠脊髓暴露并將目標(biāo)成像區(qū)與 V 型槽相對(duì)固定。為評(píng)估該方法應(yīng)用于自由活動(dòng)的小鼠脊髓成像時(shí)的穩(wěn)定性以及圖像質(zhì)量，本文將脊髓中央最為明顯的前動(dòng)脈血管作為成像目標(biāo)，采用FITC-dextran 標(biāo)記之后進(jìn)行實(shí)時(shí)脊髓血管圖像和行為學(xué)視頻同步采集。

截取 30 s 自由活動(dòng)的小鼠行為視頻進(jìn)行分析，對(duì)運(yùn)動(dòng)速度的變化進(jìn)行可視化(圖 1(e))，并對(duì)不同速度狀態(tài)對(duì)應(yīng)的血管成像進(jìn)行觀察(圖 1(f))。實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)：在小鼠運(yùn)動(dòng)前、減速運(yùn)動(dòng)、最大瞬時(shí)速度運(yùn)動(dòng)、加速運(yùn)動(dòng) 4 個(gè)運(yùn)動(dòng)區(qū)間的代表性位置點(diǎn)對(duì)應(yīng)的血管圖像在小鼠身體頭-尾方向(頭尾軸)和水平方向(左右軸)均無明顯位移且圖像清晰(圖 1(e))。上述結(jié)果表明，應(yīng)用微型化雙光子顯微鏡結(jié)合脊髓固定裝置(圖 1(a))、脊髓手術(shù)，可實(shí)現(xiàn)對(duì)自由活動(dòng)的小鼠脊髓前動(dòng)脈血管的穩(wěn)定成像。

圖1 自由活動(dòng)的小鼠脊髓前動(dòng)脈血管雙光子成像Fig.1 Fluorescence imaging of the anterior spinal artery vessels in freely behaving mice

3.2 不同行為狀態(tài)下的脊髓前動(dòng)脈血管雙光子成像評(píng)估

在正常的運(yùn)動(dòng)下，本研究實(shí)現(xiàn)了活體脊髓血管的清晰、穩(wěn)定成像，但一些劇烈運(yùn)動(dòng)往往伴隨較大幅度的脊髓無規(guī)則運(yùn)動(dòng)，可能導(dǎo)致成像目標(biāo)劇烈晃動(dòng)而干擾成像質(zhì)量。為進(jìn)一步對(duì)不同運(yùn)動(dòng)狀態(tài)下活體內(nèi)脊髓成像質(zhì)量進(jìn)行評(píng)估，以檢驗(yàn)該成像方法結(jié)合不同行為學(xué)應(yīng)用的有效性，本研究對(duì)小鼠的活動(dòng)狀態(tài)進(jìn)行干預(yù)。通過對(duì)自由活動(dòng)的小鼠施加外界刺激使其運(yùn)動(dòng)更加劇烈和運(yùn)動(dòng)表現(xiàn)多樣化(圖 2)，從而實(shí)現(xiàn)在不同條件下的脊髓血管圖像采集。此外，為量化成像過程中的圖像質(zhì)量，對(duì)小鼠身體頭-尾方向(頭尾軸)，水平方向(左右軸)的血管圖像位移進(jìn)行對(duì)比和分析。

通過給自由活動(dòng)的小鼠尾巴根部突然施加1～2 s 氣流，誘發(fā)小鼠自發(fā)運(yùn)動(dòng)速度短時(shí)間內(nèi)發(fā)生明顯變化(圖 2(a))。選取 4 個(gè)運(yùn)動(dòng)區(qū)間(運(yùn)動(dòng)前、加速運(yùn)動(dòng)、最大瞬時(shí)速度運(yùn)動(dòng)以及減速運(yùn)動(dòng))的代表性位置點(diǎn)對(duì)應(yīng)的血管圖像進(jìn)行觀察比較，發(fā)現(xiàn)脊髓血管清晰，圖像無明顯晃動(dòng)和內(nèi)容丟失(圖 2(b))。同時(shí)量化結(jié)果顯示，氣流處理前-中和前-后，頭尾軸和左右軸的圖像位移均無顯著差異，說明氣流刺激使血管圖像產(chǎn)生了一定的位移。其中，頭尾軸圖像位移＜18 μm、左右軸圖像位移＜5 μm，位移范圍較小且在圖像可校正范圍內(nèi)(圖 2(c～d))。

采用夾子對(duì)自由活動(dòng)的老鼠尾巴施加壓力持續(xù) 10 s，導(dǎo)致其疼痛以誘發(fā)蜷縮及舔尾等軀干發(fā)生較大幅度的扭動(dòng)行為，對(duì)夾尾前后的脊髓血管圖像位移進(jìn)行量化比較，以評(píng)估該條件下血管位移偏差(圖 2(g))。結(jié)果表明，在夾尾過程中，盡管小鼠出現(xiàn)劇烈的掙扎以及舔尾行為，但血管圖像依然穩(wěn)定，僅有微小范圍位移?；诖耍瑢?duì)夾尾前和夾尾過程中，以及夾尾前和夾尾后的血管圖像進(jìn)行頭尾軸、左右軸位移變化統(tǒng)計(jì)，以檢驗(yàn)在劇烈運(yùn)動(dòng)狀態(tài)下該成像方法的可行性。統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，夾尾刺激過程中頭尾軸最大圖像位移＜30 μm，左右軸最大圖像位移＜8 μm(圖 2(f))。

圖2 外界刺激干預(yù)下的小鼠脊髓前動(dòng)脈血管雙光子成像位移偏差Fig.2 Two-photon imaging displacement of the anterior spinal artery vessels under the intervention of external stimuli

以上結(jié)果表明，在小鼠劇烈運(yùn)動(dòng)中，盡管部分行為會(huì)導(dǎo)致脊髓血管圖像出現(xiàn)一定的位移，但圖像采樣依然具備高質(zhì)量以及分析性，能物理矯正多種極端行為下的脊髓無規(guī)則扭曲，滿足實(shí)時(shí)成像要求。

3.3 脊髓前動(dòng)脈血管的長期雙光子成像

為評(píng)估在長期成像過程中，脊髓適應(yīng)成像固定零件的過程中所產(chǎn)生的微小位置變化對(duì)成像清晰程度和成像穩(wěn)定性的影響，對(duì)自由活動(dòng)的小鼠脊髓前動(dòng)脈血管動(dòng)態(tài)變化進(jìn)行為期 7 d 的成像。實(shí)驗(yàn)采集測試開始的第 1 天、第 3 天、第 5 天和第 7 天的脊髓血管圖像，進(jìn)行觀察比較和位移量化。結(jié)果表明，在連續(xù)成像測試過程中，血管結(jié)構(gòu)清晰可見(圖 3(a))；圖像頭尾軸和左右軸的位移偏差均無顯著差異，頭尾軸圖像位移＜35 μm，左右軸圖像位移＜10 μm(圖 3(b))，位移范圍較小且均在圖像可校正范圍內(nèi)。這表明該方法適用于長期成像，且成像效果較為穩(wěn)定。此外，對(duì)測試期間小鼠運(yùn)動(dòng)能力進(jìn)行評(píng)估，結(jié)果表明，第 1 天、第 3 天、第 5 天和第 7 天小鼠運(yùn)動(dòng)距離和平均運(yùn)動(dòng)速度均無顯著差異(圖 3(c))，說明手術(shù)方式以及成像過程不影響小鼠的基礎(chǔ)運(yùn)動(dòng)狀態(tài)。

圖3 自由活動(dòng)小鼠脊髓前動(dòng)脈血管的長期雙光子成像Fig.3 Long-term two-photon imaging of the anterior spinal artery vesselsin freely behaving mice

3.4 行為干預(yù)下的脊髓前動(dòng)脈血管的長期雙光子成像

為評(píng)估長期成像過程中，小鼠在劇烈運(yùn)動(dòng)時(shí)脊髓血管圖像所產(chǎn)生的位移偏差能否被有效控制在可接受范圍內(nèi)，在植入成像套件后的第 1 天、第 3 天、第 5 天和第 7 天對(duì)自由活動(dòng)的小鼠先后進(jìn)行氣流和夾尾處理。實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，血管結(jié)構(gòu)成像依然清晰，圖像質(zhì)量較為穩(wěn)定(圖 4)。

氣流處理改變小鼠瞬時(shí)運(yùn)動(dòng)速度，吹氣前、中、后的脊髓血管圖像高度重疊(圖 4(a))，且在不同的時(shí)間點(diǎn)(第 3 天和第 7 天)血管結(jié)構(gòu)成像清晰。進(jìn)一步統(tǒng)計(jì)位移偏差，量化結(jié)果表明，每天氣流處理前-中和前-后血管圖像位移在頭尾軸和左右軸均無明顯差異，表明氣流刺激使血管圖像產(chǎn)生了一定的位移(圖 4(b))。其中，頭尾軸圖像位移為 10～20 μm，左右軸為 4～8 μm，位移范圍較小且在圖像可校正范圍內(nèi)(圖 4(c))。

夾尾處理能使小鼠身體產(chǎn)生較大程度的彎曲，自然狀態(tài)下會(huì)伴隨脊髓較大程度的形態(tài)變化。為進(jìn)一步評(píng)估在此過程中本文成像方法是否將血管圖像位移控制在理想成像允許范圍內(nèi)，在植入成像套件后的第 1 天、第 3 天、第 5 天和第7 天分別對(duì)小鼠實(shí)施夾尾處理。脊髓血管成像結(jié)果顯示，血管結(jié)構(gòu)依然清晰完整，無明顯的圖像扭曲和丟失現(xiàn)象圖 4(d)。統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，每天夾尾前-中和前-后血管圖像位移在頭尾軸和左右軸均無顯著差異(圖 4(e))，頭尾軸圖像位移范圍保持在 14～28 μm，左右軸在 4～8 μm(圖 4(f))。

圖4 行為干預(yù)下的小鼠脊髓前動(dòng)脈血管的長期雙光子成像Fig.4 Long-term two-photon imaging of the anterior spinal artery vessels in mice under behavioral intervention

以上結(jié)果表明，行為干預(yù)下的小鼠脊髓圖像位移主要集中在頭尾軸，與自由活動(dòng)的小鼠脊髓位移主要集中在頭尾軸一致。此外，在劇烈的刺激引發(fā)動(dòng)物劇烈活動(dòng)的前提下，脊髓圖像會(huì)產(chǎn)生在可糾正范圍內(nèi)的位移，但是相較于之前已報(bào)道的有關(guān)自由活動(dòng)的動(dòng)物體內(nèi)脊髓成像方法(左右軸≤13 μm，頭尾軸≤50 μm)，圖像位移已有非常顯著的減小[6]，較大程度提升了成像質(zhì)量。

3.5 脊髓背角神經(jīng)元編碼運(yùn)動(dòng)信息

脊髓在軀體感覺和運(yùn)動(dòng)過程中發(fā)揮重要的作用，傳送腦與外周之間的神經(jīng)信息以協(xié)調(diào)生命體正常活動(dòng)，但目前對(duì)相關(guān)的神經(jīng)元功能的研究較少。在小鼠自由活動(dòng)過程中，對(duì)脊髓背角神經(jīng)元檢測發(fā)現(xiàn)，即使在小鼠劇烈的活動(dòng)過程中依然能采集到高分辨的單個(gè)神經(jīng)元鈣活動(dòng)信息(圖 5(a))：當(dāng)小鼠處于清醒固定狀態(tài)時(shí)，脊髓背角淺層神經(jīng)元幾乎沒有發(fā)放；當(dāng)小鼠在無束縛環(huán)境中處于靜息狀態(tài)時(shí)，神經(jīng)元活動(dòng)水平也較低；當(dāng)小鼠在自由運(yùn)動(dòng)狀態(tài)時(shí)，少量細(xì)胞有微弱的活動(dòng)；而當(dāng)小鼠在原地梳理毛發(fā)時(shí)，明顯觀察到更多的神經(jīng)元活動(dòng)。

隨機(jī)選取小鼠連續(xù) 60 s 運(yùn)動(dòng)過程中的神經(jīng)元發(fā)放情況進(jìn)行分析，對(duì)檢測到的 5 個(gè)神經(jīng)元進(jìn)行示蹤。分析發(fā)現(xiàn)，小鼠活動(dòng)過程中神經(jīng)元存在較低幅度的短暫自發(fā)放現(xiàn)象，其中 2 號(hào)、3 號(hào)和 5號(hào)神經(jīng)元在 50～60 s 內(nèi)部分時(shí)間點(diǎn)的鈣離子活動(dòng)顯著增加，鈣信號(hào)高于基線約 3 倍(圖 5(b)左)；在梳理毛發(fā)時(shí)神經(jīng)元有強(qiáng)烈且持續(xù)的發(fā)放，其中1 號(hào)、2 號(hào)和 5 號(hào)神經(jīng)元在 0～30 s 內(nèi)部分時(shí)間點(diǎn)鈣離子活動(dòng)大幅度增加，神經(jīng)元鈣信號(hào)高于基線的 6 倍(圖 5(b)右)。此外，通過比較脊髓背角神經(jīng)元在不同行為下的活動(dòng)細(xì)胞比例發(fā)現(xiàn)，小鼠運(yùn)動(dòng)時(shí)的神經(jīng)元發(fā)放比例為 2.56%；而梳理毛發(fā)時(shí)的神經(jīng)元發(fā)放比例為 15.73%，顯著高于運(yùn)動(dòng)時(shí)的發(fā)放比率(圖 5(c))。

圖5 脊髓背角淺層神經(jīng)元雙光子鈣成像Fig.5 Two-photon calcium imaging of neurons in the superficial spinal dorsal horn

4 討論與分析

脊髓活體成像技術(shù)是進(jìn)一步在生理或病理?xiàng)l件下探究脊髓功能和結(jié)構(gòu)的關(guān)鍵瓶頸之一[6,13]。隨著研究水平的不斷深入，很多實(shí)驗(yàn)需要在無束縛環(huán)境的小鼠模型中進(jìn)行，但由于技術(shù)水平的限制，目前很難在自由活動(dòng)的動(dòng)物模型中實(shí)現(xiàn)脊髓成像[2,17]。本文借助微型化雙光子顯微鏡，開發(fā)出一套適于自由活動(dòng)的動(dòng)物脊髓雙光子成像方法。同時(shí)，利用這一技術(shù)在自由活動(dòng)的小鼠中實(shí)現(xiàn)了長期穩(wěn)定的脊髓前動(dòng)脈血管成像，并進(jìn)一步在細(xì)胞層面上實(shí)現(xiàn)了對(duì)單個(gè)脊髓背角神經(jīng)元功能的初步探究。

在實(shí)現(xiàn)小鼠脊髓活體成像的過程中，由于脊髓結(jié)構(gòu)的特殊性使得無論是麻醉狀態(tài)下的成像還是自由活動(dòng)狀態(tài)下的成像，均面臨如何穩(wěn)定植入光學(xué)成像套件的問題[1]?，F(xiàn)有的脊髓長期成像主要是在麻醉或清醒固定的小鼠上實(shí)現(xiàn)，且多數(shù)以脊髓結(jié)構(gòu)成像為主，因此手術(shù)只需要暴露少部分脊髓[18-19]，而本文則更關(guān)注自由活動(dòng)的小鼠中脊髓神經(jīng)元的功能，成像目標(biāo)以神經(jīng)元胞體為主。但是由于脊髓淺層存在的大量白質(zhì)結(jié)構(gòu)，可成像的灰質(zhì)區(qū)域分布于脊髓的兩側(cè)遠(yuǎn)端，因此進(jìn)行脊髓背角淺層神經(jīng)元成像需要更大的成像窗口[1]。雖然本文采用的植入式玻璃成像窗口增加了手術(shù)難度，但并沒有影響小鼠的基本行為，鮮有出現(xiàn)小鼠后肢無力甚至癱瘓等一些常見的脊髓手術(shù)后遺癥。更為重要的是，已報(bào)道的脊髓成像方法中由于動(dòng)物呼吸、心跳以及自發(fā)活動(dòng)常會(huì)引發(fā)明顯的脊髓組織劇烈晃動(dòng)，導(dǎo)致圖像質(zhì)量較差[14,20-21]。盡管在麻醉的小鼠中有很多改進(jìn)的策略，但在清醒固定后，依然發(fā)現(xiàn)成像時(shí)有大幅度的組織位移，導(dǎo)致成像圖像的丟失[6]。因此，本文進(jìn)一步改進(jìn)現(xiàn)有的脊髓植嵌體，采用新的手術(shù)固定方式，從成像的物理層面盡可能地削弱了脊髓的無規(guī)則運(yùn)動(dòng)，大幅度消除成像采集過程中圖像的丟失或偽影，顯著提高成像質(zhì)量，為后期的圖像處理簡化了流程，實(shí)現(xiàn)了在自由活動(dòng)的小鼠中長期穩(wěn)定的脊髓雙光子成像。

通過脊髓血管成像，本文評(píng)估了無束縛環(huán)境中自由活動(dòng)的動(dòng)物活體脊髓圖像位移的范圍。與現(xiàn)有的熒光成像技術(shù)相比，不僅在圖像質(zhì)量上體現(xiàn)了雙光子成像的優(yōu)越性，而且大幅度降低了成像過程中的組織位移，遠(yuǎn)低于現(xiàn)有的基于微型化單光子顯微鏡的活體脊髓成像技術(shù)[6]。此外，高質(zhì)量的圖像信息降低了圖像處理以及分析難度，能夠很好地匹配現(xiàn)有的圖像處理軟件。由于脊髓的組織位移與運(yùn)動(dòng)狀態(tài)密切相關(guān)，在小鼠劇烈活動(dòng)時(shí)(如加速運(yùn)動(dòng)、梳理毛發(fā)和舔舐傷口等過程中)，脊髓往往存在大幅度的扭曲[22]。本文通過氣流刺激以及夾尾實(shí)驗(yàn)，分別誘發(fā)小鼠突然加速和舔舐傷口等行為[22-23]，該過程的成像質(zhì)量評(píng)估結(jié)果表明，圖像在頭尾軸存在相對(duì)顯著的位移，但圖像仍舊清晰且無明顯圖像丟失或圖像偽影等問題出現(xiàn)。此外，長期的成像結(jié)果表明，圖像相對(duì)位移穩(wěn)定，并沒有隨著時(shí)間的延長、脊髓自身的恢復(fù)、術(shù)后組織增生等，產(chǎn)生累積效應(yīng)而影響圖像質(zhì)量。

脊髓對(duì)于感知和區(qū)分不同類型的環(huán)境因素以協(xié)調(diào)自身變化和外部環(huán)境變化，從而防止軀體損傷是至關(guān)重要的[24-25]。當(dāng)皮膚受到不同的化學(xué)、熱或機(jī)械刺激時(shí)，不同傷害性程度的感覺信息傳到位于脊髓背角的神經(jīng)元，但這些神經(jīng)元如何編碼這些信息，目前尚不完全清楚[26-29]，已有的研究也局限于麻醉的小鼠或清醒固定的小鼠[1,30]，鮮有自由活動(dòng)的動(dòng)物。通過使用基于微型化雙光子熒光顯微鏡的自由活動(dòng)小鼠脊髓成像方法，本文實(shí)現(xiàn)了對(duì)自由狀態(tài)下小鼠脊髓神經(jīng)元的雙光子成像。這將為進(jìn)一步解析參與感覺信息處理的背角神經(jīng)元如何編碼來自皮膚和其他組織、器官的信號(hào)，以及這些神經(jīng)元在多大程度上編碼小鼠的感覺、運(yùn)動(dòng)等信息，提供一定的技術(shù)支持。

5 結(jié) 論

本文工作首次將微型化雙光子活體成像技術(shù)應(yīng)用到自由活動(dòng)的小鼠脊髓研究中。通過評(píng)估脊髓前動(dòng)脈血管在正常行為和劇烈運(yùn)動(dòng)過程中的圖像質(zhì)量，驗(yàn)證了基于微型化雙光子熒光顯微鏡的自由活動(dòng)的小鼠脊髓成像方法的可行性。此外，利用這一技術(shù)優(yōu)勢，實(shí)現(xiàn)了脊髓背角淺層神經(jīng)元活動(dòng)中單個(gè)神經(jīng)元鈣信號(hào)的延時(shí)成像，突破了傳統(tǒng)固定以及清醒成像束縛的限制，解決了活體脊髓成像研究中一個(gè)關(guān)鍵的技術(shù)難題。自由活動(dòng)小鼠脊髓成像的實(shí)現(xiàn)，使得從真實(shí)的場景中研究感知覺信息輸入和大腦指令輸出在脊髓中的編碼過程成為可能，將為進(jìn)一步探究脊髓在軀體感覺和運(yùn)動(dòng)過程中神經(jīng)元活動(dòng)模式對(duì)神經(jīng)信息的編碼提供技術(shù)支持。