許蕊蕊，陳金素，李越，邱仁杰，王秀麗*，鄒博林，陳培

1.北京中醫(yī)藥大學(xué)，北京 102488；2.云南省中醫(yī)醫(yī)院，云南 昆明 650021；3.艾天羊生物科技有限公司，四川 綿陽 622659

中藥復(fù)方制劑因為成分極其復(fù)雜，往往需要添加大量的輔料以促進成型。輔料在制劑中發(fā)揮重要作用，如成型、促進主藥發(fā)揮藥效等。然而，高比例輔料不僅增加患者服藥量及心理和經(jīng)濟負(fù)擔(dān)，降低患者順應(yīng)性，也增加了不良反應(yīng)的可能性，消耗更多的資源。如果制劑中能應(yīng)用既發(fā)揮藥效、與主藥協(xié)同作用，又能發(fā)揮輔料的促進成型等功能的材料，則一舉兩得?！八庉o合一”的理念便源于此。

艾天羊肌肉關(guān)節(jié)通絡(luò)方系由乳香、沒藥等10 余種中藥組成的經(jīng)驗方，具有活血化瘀、消炎止痛等功效。鑒于其原本應(yīng)用形式為藥物細(xì)粉與凡士林混合，制得按摩膏，不利于藥物成分溶出、患者順應(yīng)性差等問題，本課題組通過95%乙醇提取原料藥后，將提取濃縮液制備得到以中鏈脂肪酸為油相的普通乳膏——艾天羊肌肉通絡(luò)膏（ATY乳膏），實現(xiàn)了改善有效成分溶出和提高患者順應(yīng)性的目標(biāo)。本研究在ATY 乳膏基礎(chǔ)上，運用“藥輔合一”的理念，將ATY 乳膏油相的中鏈脂肪酸用薄荷油替代，得到ATY 乳膏Ⅱ，其中薄荷油既發(fā)揮承載藥物、構(gòu)成乳膏、促進主藥透皮的輔料作用，又可以很好地發(fā)揮止痛、疏散風(fēng)熱等治療作用，有助于促進艾天羊肌肉關(guān)節(jié)通絡(luò)方的抗炎、鎮(zhèn)痛作用。

1 材料

1.1 試藥

乳香、沒藥等中藥飲片購于廣州市嶺南中藥飲片有限公司佛山分公司，符合《中華人民共和國藥典》2015年版相關(guān)項下的要求。

硬脂酸（批號：CG10070082，上海麥克林生化科技有限公司）；單硬脂酸甘油酯（批號：C10286479，北京華威銳科化工有限公司）；薄荷油（安徽酷爾生物工程有限公司）；十二烷基硫酸鈉（批號：1202021，廣東省精細(xì)化學(xué)品工程技術(shù)研究開發(fā)中心）；尼泊金乙酯、冰醋酸（天津市福晨化學(xué)試劑廠）；二甲苯、丙三醇（批號分別為20160805、20161005，北京化學(xué)試劑公司）；消傷痛搽劑（安陽中智藥業(yè)有限責(zé)任公司）；無水乙醇（分析純，北京化工廠）；去離子水（實驗室自制）。

1.2 儀器

DFT-100A 型手提式高速萬能粉碎機（溫嶺市林大機械有限公司）；CP225D 型十萬分之一電子分析天平（Sartorius 公司）；KQ-300DE 型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；DB-3 型熱板儀（常州普天儀器制造有限公司）；101-1AB 電熱風(fēng)干燥箱（天津賽得利斯實驗儀器制造廠）。

1.3 動物

SPF級KM 小鼠，體質(zhì)量18～22 g；SD 大鼠，體質(zhì)量180～220 g，合格證號：SCXK（京）2016-0002，購于北京斯貝福實驗動物科技有限公司，飼養(yǎng)于北京中醫(yī)藥大學(xué)動物房。

2 方法與結(jié)果

2.1 藥液的提取

稱取處方量乳香、沒藥等中藥飲片，打成細(xì)粉過80 目篩，置2000 mL 具塞錐形瓶中，搖勻。加入95%乙醇1000 mL 振蕩，使得乙醇浸潤所有粉末，避光保存。72 h 后，減壓抽濾，避光保存濾液，濾渣繼續(xù)用1000 mL 95%乙醇避光浸提；24 h 后，減壓抽濾，避光保存濾液，濾渣繼續(xù)用1000 mL 95%乙醇避光浸提；24 h 后，減壓抽濾，合并3 次的濾液，回收乙醇至藥液質(zhì)量濃度約為0.82 g·mL-1，即得提取液。

2.2 Box-Behnken響應(yīng)面法優(yōu)選乳膏基質(zhì)處方

2.2.1 實驗設(shè)計 預(yù)試驗發(fā)現(xiàn)，油/水相質(zhì)量比、促透劑的添加劑量及藥液的用量，均對ATY 乳膏Ⅱ的質(zhì)量產(chǎn)生影響。因此，在預(yù)實驗基礎(chǔ)上，以油/水相質(zhì)量比（A）、促透劑的添加劑量（B）和藥液與基質(zhì)質(zhì)量比（C）設(shè)為自變量，以綜合評分（Y）為評價指標(biāo)，每個因素選取低、中、高3 個水平，因素水平見表1。

表1 ATY乳膏Ⅱ基質(zhì)處方設(shè)計因素與水平

2.2.2 考察指標(biāo)及評價方法 在篩選處方過程中，以外觀均一性、涂抹延展性、離心穩(wěn)定性、耐寒性和耐熱性作為乳膏質(zhì)量評價的指標(biāo)，各項考察指標(biāo)的評價方法[1-2]：1）外觀均一性。取適量樣品，觀察外觀質(zhì)地是否均勻、顏色是否一致、靜置是否會自然分層。2）涂布延展性。取適量樣品，在表面皿上涂布，觀察涂布過程中有無結(jié)塊、是否會產(chǎn)生顆粒。3）離心穩(wěn)定性評價。取適量乳膏于2 mL 的EP 管中，4000 r·min-1離心15 min（離心半徑為5 cm），觀察是否發(fā)生分層、變色等油水分離現(xiàn)象。4）耐寒性。取適量乳膏于2 mL 的離心管中置-20℃放置24 h，取出放至室溫，觀察實驗樣品是否發(fā)生分層、變色等油水分離現(xiàn)象。5）耐熱性。取適量乳膏于2 mL 的EP 管中，密封，于50 ℃恒溫箱中，恒溫保持6 h，觀察上述實驗樣品是否發(fā)生分層、變色等油水分離現(xiàn)象（表2），評分情況見表3。

表2 ATY乳膏Ⅱ處方篩選各項考察指標(biāo)評分

表3 ATY乳膏Ⅱ處方綜合評分

2.2.3 模型擬合 采用Design-Expert 對上面數(shù)據(jù)進行分析，以Y對自變量進行模型擬合，并通過r等對擬合模型進行評價，通過比較各擬合方程的擬合度，得到二次多項式回歸方程Y=93.28-1.13A-5.81B+0.63C+0.37AB+2.25AC-0.37BC-8.37A2-10.97B2-5.87C2，r=0.993 1，P＜0.000 1，F(xiàn)=111.57，表明模型差異有統(tǒng)計學(xué)意義；失擬項P=0.309 9＞0.05，失擬項差異無統(tǒng)計學(xué)意義，說明該模型擬合度和可信度均有效，實驗誤差小，可以用此模型對薄荷油處方進行分析和預(yù)測，結(jié)果見表4。

表4 ATY乳膏Ⅱ二次多項式方程模型方差分析

2.2.4 響應(yīng)面優(yōu)化分析 根據(jù)擬合方程，通過Design-Expert V8.0.6.1 軟件繪制評價指標(biāo)隨因素變化的等高線圖和響應(yīng)面圖，見圖1～3。

圖1 油/水相質(zhì)量比與藥液與基質(zhì)質(zhì)量比等高線圖與響應(yīng)面圖

圖2 油/水相質(zhì)量比與促透劑的添加劑量等高線圖與響應(yīng)面圖

圖3 促透劑的添加劑量與藥液與基質(zhì)質(zhì)量比等高線圖與響應(yīng)面圖

由圖1～3 可知，油/水相質(zhì)量比、促透劑添加劑量和藥液的用量對綜合評分影響均成拋物線形，即隨著因素的增大，綜合評分呈先增大后降低的趨勢，因此，在提取工藝中適當(dāng)提高三者比例可以提高綜合評分。由表4 可知，促透劑添加劑量對綜合評分的影響不如其他2 個因素顯著，隨著其添加比例的提高綜合評分先升高，繼而緩慢降低，因此，在實際應(yīng)用中應(yīng)控制促透劑的添加劑量在最佳范圍。

根據(jù)回歸模型分析且考慮實際操作的可行性，各因素值保留為整數(shù)，ATY 乳膏Ⅱ最優(yōu)處方：油/水相質(zhì)量比為35∶65、促透劑的添加劑量為8%、藥液與基質(zhì)質(zhì)量比為1∶10。

2.3 乳膏的制備

2.3.1 ATY 乳膏的制備 稱取處方量硬脂酸、單硬脂酸甘油酯和尼泊金乙酯，于1000 mL 蒸發(fā)皿中80 ℃水浴加熱熔融后，加入中鏈脂肪酸135 g（邊加入邊攪拌）攪勻后，加入提取液90 mL（邊加入邊攪拌），1 h 后，加入剩余脂溶性原料，攪拌均勻后加入促透劑，攪勻既得油相。稱取處方量十二烷基硫酸鈉加入純凈水中，80 ℃水浴加熱融化十二烷基硫酸鈉，再加入處方量的甘油，既得水相。制備好的油相加入水相中，邊加邊攪拌，攪拌均勻，保鮮膜密封避光放涼即得。

2.3.2 ATY 乳膏Ⅱ的制備 除把中鏈脂肪酸替換為薄荷油外，其余操作同2.3.1項下的制備方法。

2.4 藥效學(xué)實驗

2.4.1 ATY乳膏及ATY乳膏Ⅱ?qū)π∈笸撮撝档挠绊?/p>

2.4.1.1 方法 將小鼠置于熱板儀［溫度為（55±0.5）℃］上，從小鼠足底接觸熱板至出現(xiàn)舔后足的時間為該小鼠的痛閾值，5 s＜痛閾值＜30 s 的小鼠為合格。選擇痛閾值合格小鼠30 只，隨機分為空白組、ATY 乳膏組、ATY 乳膏Ⅱ組，每組10 只小鼠。各組小鼠兩后足涂抹給藥，空白組給予0.9%氯化鈉溶液0.2 mL/只，ATY 乳膏組和ATY 乳膏Ⅱ組給藥劑量均為0.4 g/只。每日涂抹3次，每次涂抹后按摩20 min，連續(xù)給藥10 d。各組動物在末次給藥后30、60、90、120 min分別測定各小鼠痛閾值（痛閾值超過60 s，即停止測試，按60 s 記），各組間痛閾值的比較可以通過柱狀圖更直觀地看出，具體結(jié)果見圖4。

圖4 ATY乳膏和ATY乳膏Ⅱ?qū)π∈笸撮撝档挠绊懀?n=10）

2.4.1.2 結(jié)果 與空白組比較，ATY 乳膏和ATY乳膏Ⅱ均可顯著提高小鼠痛閾值（P＜0.01），且改進后的ATY 乳膏Ⅱ比ATY 乳膏效果更好，結(jié)果見表5。

表5 ATY乳膏和ATY乳膏Ⅱ?qū)π∈笸撮撝档挠绊懀?n=10）

表5 ATY乳膏和ATY乳膏Ⅱ?qū)π∈笸撮撝档挠绊懀?n=10）

注：與空白組相比，*P＜0.01；表6同。

2.4.2 ATY乳膏和ATY乳膏Ⅱ?qū)π∈蟮逆?zhèn)痛作用

2.4.2.1 造模、分組與給藥 分組與給藥同

2.4.1.1 ，連續(xù)給藥10 d。末次給藥6 h 后，每只小鼠腹腔注射0.6%冰醋酸0.2 mL，記錄注射后15 min內(nèi)因疼痛發(fā)生扭體的次數(shù)及開始出現(xiàn)扭體反應(yīng)的時間（即扭體反應(yīng)潛伏期）。

2.4.2.2 結(jié)果 與空白組相比較，ATY 乳膏組和ATY 乳膏Ⅱ組小鼠扭體反應(yīng)次數(shù)明顯減少（P＜0.01），扭體反應(yīng)潛伏期明顯增長（P＜0.01），且改進后的ATY 乳膏Ⅱ比ATY 乳膏鎮(zhèn)痛效果更好。將各組小鼠鎮(zhèn)痛作用繪制成柱狀圖，可以直觀地看出，模型組與空白組和給藥組之間差異有統(tǒng)計學(xué)意義，說明藥效較好，結(jié)果見圖5。

圖5 ATY乳膏和ATY乳膏Ⅱ?qū)π∈箧?zhèn)痛作用的影響（,n=10）

2.4.3 ATY 乳膏和ATY 乳膏Ⅱ?qū)Χ妆街滦∈蠖[脹的影響

2.4.3.1 方法 將小鼠隨機分為3 組，分別為模型對照組、ATY乳膏組和ATY乳膏Ⅱ組。在小鼠左耳前后均勻給藥，空白組給予0.9%氯化鈉溶液0.2 mL/只，ATY 乳膏組和ATY 乳膏Ⅱ組給藥劑量為0.4 g/只。給藥6 h后，小鼠左耳里、外兩面涂抹二甲苯0.05 mL，右耳不涂為正常對照。15 min 后處死小鼠，剪下雙耳，用9 mm 內(nèi)徑打孔器在雙耳的同一部位打孔并稱質(zhì)量。計算小鼠耳腫脹度。

2.4.3.2 結(jié)果 與空白組相比較，模型對照組小鼠耳腫脹程度顯著增高（P＜0.01），說明造模成功；與模型對照組相比較，ATY 乳膏組和ATY 乳膏Ⅱ組可顯著降低二甲苯致小鼠耳腫脹的程度（P＜0.01）。結(jié)果見表6。

表6 ATY乳膏和ATY乳膏Ⅱ?qū)Χ妆街滦∈蠖[脹的影響（,n=10）

表6 ATY乳膏和ATY乳膏Ⅱ?qū)Χ妆街滦∈蠖[脹的影響（,n=10）

注：與空白組相比，▽P＜0.01；與模型組相比，*P＜0.01。

3 討論

艾天羊肌肉關(guān)節(jié)通絡(luò)方以乳香、沒藥為君藥。乳香、沒藥配伍應(yīng)用始見于“乳香止痛散”（《證治準(zhǔn)繩》）[3-4]。其中，乳香味辛，性溫，芳香，具有調(diào)氣活血，治療癰瘡腫毒、跌打損傷的作用；沒藥性平，具有治療跌打損傷、金瘡、筋骨、癰疽腫痛等作用。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)也已表明，乳香具有抗炎抗菌、抗氧化等藥理作用[5-6]。沒藥具有抗炎、凝血、鎮(zhèn)痛等藥理作用[7-8]。乳香沒藥同用，可以同時活血祛瘀、消炎鎮(zhèn)痛，協(xié)同增效。自古以來，臨床應(yīng)用中運用乳香活血、沒藥散血的功效，且兩者皆能止痛消腫，因此，兩者常以藥對形式相兼而用?，F(xiàn)代實驗研究也表明，乳香、沒藥配伍后產(chǎn)生的藥效在藥理作用的層面上也體現(xiàn)為協(xié)同增效[9-11]。除此之外，本方中添加的薄荷性涼，芳香升散，有解熱、抗炎、鎮(zhèn)痛等作用。已有研究表明，薄荷油可刺激中樞神經(jīng)，使皮膚毛細(xì)血管擴張，促進汗腺分泌，增加散熱，有發(fā)汗解熱作用[12]。因此，薄荷油的添加對于該方的臨床應(yīng)用和患者的使用感受均有不可替代的作用。

“藥輔合一”，是指制劑處方中部分中藥兼任原料和輔料的雙重角色。2010 年，國家就已經(jīng)把藥用輔料的開發(fā)列入了重點研究課題[13]；2016 年，《國家重點支持的高新技術(shù)領(lǐng)域》中也將制劑新輔料開發(fā)納入其中，因此，藥用輔料已經(jīng)成為了研究熱點。本研究所研制的外用制劑，增加藥物的滲透性是關(guān)鍵。因此，結(jié)合“藥輔合一”的理念，考慮到中藥的某些揮發(fā)油或芳香成分能促進藥物的吸收與跨膜轉(zhuǎn)運，并且其本身的藥理活性可以治療疾病的雙重特點，可以考慮將其作為透皮促進劑[14]。所以本方中的薄荷油既作為乳膏中的油相，起到承載脂溶性提取物及構(gòu)建乳膏的作用，還能夠發(fā)揮促進藥物透皮吸收、止痛、疏風(fēng)散寒等作用，既充當(dāng)著輔藥，保證臨床藥效，又可以作為輔料制成制劑成型，有效地減少了合成促透劑的使用量，一定程度上減輕了不良反應(yīng)，提高了制劑的安全性。

4 結(jié)語

綜上所述，本研究對于薄荷油的利用是對“藥輔合一”思想的合理詮釋，也為今后薄荷油的綜合開發(fā)提供了理論基礎(chǔ)，因此，未來應(yīng)該給予“藥輔合一”研究更多重視，這不僅有利于提高中藥制劑的藥效，還能推動中藥現(xiàn)代化的發(fā)展，使中醫(yī)藥文化一直維持生命活力，也使中華瑰寶在世界大放異彩。