噬菌體抗體庫分類與篩選方法的研究

張 媛，常思源

（1.南京鐘鼎生物技術有限公司研發(fā)部，江蘇 南京 210034 ；2.南京科技職業(yè)學院生命健康學院，江蘇 南京 210048）

噬菌體是能夠侵襲細菌、真菌、藻類、放線菌或螺旋體等微生物的一類病毒的總稱。噬菌體的基因組中含有許多個基因。所有已知的噬菌體均是由細菌細胞中利用細菌的核糖體、蛋白質合成時所需的各種因子、各種氨基酸和能量產生系統(tǒng)來實現(xiàn)其自身的生長和增殖。噬菌體具有嚴格的宿主特異性，只寄居在易感宿主的菌體內。噬菌體抗體庫技術是一項新的基因工程抗體制備技術。該技術在人源性抗體克隆、抗體技能改造、抗體基因研究等方面發(fā)揮著重要的作用。在對噬菌體抗體庫進行篩選的過程中，按照噬菌體抗體庫的具體分類選擇合適的篩選方法尤為重要。通過聚合酶鏈式反應（PCR）等基因工程的方法，能夠對噬菌體進行擴增，以獲得抗體的可變區(qū)和/ 或恒定區(qū)，然后利用酶連或重組技術將目的基因構建至特定的噬菌粒載體中，使外源基因與噬菌體的核衣殼蛋白Ⅲ或Ⅷ融合表達,進而可直接展示在噬菌體核衣殼表面獲得的噬菌體抗體庫。有研究表明，外源多肽或蛋白的基因主要與噬菌體的DNA 融合表達，基因與表型之間是一一對應的關系。因此，直接通過對篩選獲得的噬菌體DNA 進行一代測序即可獲得抗體基因序列的具體信息，進而為新藥及疫苗的研制奠定基礎[1]。本研究主要是探討噬菌體抗體庫的分類與篩選方法。

1 噬菌體抗體庫的分類

按照抗體庫的來源可將噬菌體抗體庫分為免疫噬菌體抗體庫和非免疫噬菌體抗體庫兩大類。免疫噬菌體抗體庫來源于經(jīng)過免疫接種動物的組織或血清。非免疫噬菌體抗體庫來源于未經(jīng)過免疫接種動物的組織或血清。非免疫噬菌體抗體庫除了可直接通過動物的組織或血清獲得，還可通過半合成或全合成的方式獲得[2]。

1.1 免疫噬菌體抗體庫

免疫噬菌體抗體庫是指從獲取細胞免疫或體液免疫(包括但不局限于注射疫苗、感染微生物、罹患腫瘤性疾病等)后的個體上獲得的抗體庫。通過免疫壓力的篩選，可大大地增加免疫噬菌體抗體庫中特異性抗體的豐度，不需要很大的庫容即可篩選到針對特異性抗原的抗體。目前，市面上有大量的商業(yè)化免疫抗體庫制備試劑盒，包括Amersham Pharmacia的RPAS 小鼠ScFv 庫構建試劑盒。該試劑盒是從RPAS 小鼠脾臟或骨髓瘤細胞中擴增獲得的ScFv 基因庫。該試劑盒不適用于檢測弱免疫原性的抗原、免疫個體自身的抗原或者有毒性的抗原,其應用受到一定的限制。

1.2 非免疫噬菌體抗體庫

免疫噬菌體抗體庫是從獲取細胞免疫或體液免疫后的動物組織中擴增獲得特異性抗體，而非免疫噬菌體抗體庫是不需動物獲取細胞免疫或體液免疫后獲得的抗體庫。按照噬菌體抗體庫可變區(qū)的組成情況，非免疫噬菌體抗體庫可分為以下3 類：1）天然噬菌體抗體庫。天然噬菌體抗體庫中所有抗體庫的可變區(qū)均來源于未經(jīng)免疫動物的B 淋巴細胞。2）半合成噬菌體抗體庫。此類抗體庫中一部分可變區(qū)的序列是通過人工化學合成獲得，另一部分可變區(qū)的序列則來源于未經(jīng)免疫動物的B 淋巴細胞。3）全合成噬菌體抗體庫?？贵w庫中所有可變區(qū)的序列均是通過人工化學合成的方式獲得。在構建非免疫噬菌體抗體庫的過程中，所有抗體的來源均可不經(jīng)過細胞免疫或體液免疫的作用。因此，非免疫噬菌體抗體庫中針對特異性抗原的抗體的比例較低。Mondon 等[3]的報道中稱，2007 年非免疫噬菌體抗體庫的庫容已經(jīng)普遍達到了1011的水平。從理論上分析，只要非免疫噬菌體抗體庫的庫容足夠大，就可以篩選到任何特異性抗體，但為了獲得針對特異性抗原的抗體，建議構建特異性非免疫噬菌體抗體庫。

2 噬菌體抗體庫的篩選方法

噬菌體抗體庫篩選方法的選擇，可在很大程度上決定能否從其中篩選出所需的特異性抗體。影響噬菌體抗體庫篩選過程的因素包括（但不局限于）以下情況：抗體庫本身的庫容、重復率、存放條件、擴增方法及篩選方法[4]。噬菌體抗體庫篩選方法的選擇，需根據(jù)所需抗原的具體性質而定。按照篩選抗原的純度，噬菌體抗體庫的篩選方法可分為純化抗原篩選法和非純化抗原篩選法兩大類。

2.1 純化抗原篩選法

純化抗原篩選法是指采用純化過的抗原進行抗體庫篩選的方法。該篩選法具有效率高、特異性強、流程簡單等特點，是目前被普遍使用的噬菌體抗體庫的篩選方法。純化抗原篩選法分為固相篩選法和液相篩選法兩種：1）固相篩選法是將純化后的抗原，直接包被在酶標條或免疫管等固相介質上投入抗體庫中，經(jīng)過若干輪的篩選、富集后獲得特異性抗體的方法。固相篩選法具有操作簡單、特異性強等特點，是最常用的抗體庫篩選方法。2010 年Han DG 等[5]采用固相篩選法對噬菌體抗體庫進行了4 輪的篩選、富集后，成功地獲得了抗EGFRv Ⅲ的特異性噬菌體抗體庫。在采用固相篩選法對噬菌體抗體庫進行篩選時，可通過多種調整包被密度及洗脫強度的方法獲得不同親和力的抗體，且包被的密度越高、洗脫的強度越大，獲得抗體的親和力就越高。在采用固相篩選法對噬菌體抗體庫進行篩選時，還可通過增加競爭性抗體的方法進行篩選調整。2001 年Bracci等[6]將煙堿乙酰膽堿受體增加到篩選體系中，使其與噬菌體抗體進行競爭性篩選后，獲得了抗蛇毒的 sc Fv 抗體。固相篩選法的缺點是：⑴由于抗原的包被附著在固相介質的表面上,部分表位極易受到影響而丟失特異性抗體。⑵在對抗體庫進行篩選的過程中，對抗原的需求較大,較難根據(jù)抗體、抗原的性質進行相應的量化處理。2）液相篩選法。目前，在對噬菌體抗體庫進行液相篩選時，一般采用以下兩種方法：⑴對抗原進行生物素標記，再利用生物素與鏈霉親和素相結合的原理，將抗原包被在偶聯(lián)的鏈霉親和素磁珠上，然后對噬菌體抗體庫進行篩選。⑵對抗原進行生物素標記后，將其放入噬菌體抗體庫中，讓抗原與抗體進行配對結合，將反應后的產物加入到偶聯(lián)的鏈霉親和素磁珠中進行篩選。與固相篩選法相同，液相篩選法也可通過多種調整包被的密度和洗脫的強度獲得親和力不同的抗體，且包被的密度越高、洗脫的強度越大，獲得抗體的親和力就越高。與采用固相篩選法相比，采用液相篩選法對噬菌體抗體庫進行篩選的優(yōu)勢是：1）抗原和抗體的運動相對自由，可使其結合得更加充分。2）抗原在液相環(huán)境中能夠保持自身的空間構象，可避免受到抗原表位的影響。液相篩選法的缺點是：⑴在對抗原進行生物素標記時，一些潛在的、能夠與特異性抗體結合的抗原表位可能出現(xiàn)失活的現(xiàn)象。⑵偶聯(lián)在磁珠上的鏈霉親和素可能會與非特異抗體相結合。陳瑛煒等[7]將帶有His-tag的抗原與噬菌體抗體庫進行混合反應后,再將反應產物通過鎳柱進行純化洗脫,獲得了特異性噬菌體抗體，從而解決了上述問題。

2.2 非純化抗原篩選法

非純化抗原篩選法包括細胞篩選法和組織或體內篩選法兩種。1）細胞篩選法。在無法獲得足夠量的抗原或抗原的免疫原性較弱、性質不確定時，不能直接采用抗原-抗體結合的方式進行篩選，需采用完整的細胞對噬菌體抗體庫進行篩選。由于完整細胞的膜蛋白、表面蛋白可以保證抗原維持完整的天然構象，故采用完整的細胞對抗體庫進行篩選獲得的抗體更符合后續(xù)的需求。在采用細胞篩選法對抗體庫進行篩選時，可使用貼壁細胞或懸浮細胞。采用貼壁細胞對抗體庫進行篩選的過程與采用固相篩選法對抗體庫進行篩選的流程類似。采用懸浮細胞對抗體庫進行篩選的流程與采用液相篩選法對抗體庫進行篩選的流程相似。雖然細胞篩選法更加符合蛋白的天然構象，但因細胞的表面存在大量的非相關蛋白質、脂類、糖類等其他成分，可能會發(fā)生目的蛋白與非特異性噬菌體抗體相結合的現(xiàn)象。一般情況下，目的蛋白在細胞表面的含量較低，如進行篩選的批次較多，則易丟失特異性抗體。2008 年Taipa 等[8]采用磁性細胞分選器（magnetic cell sorter，MACS）對細胞進行分選，方法是：將陽性細胞包裹在MACS 中的磁珠上，加入大量的陰性細胞，再加入能夠與特異性噬菌體結合的陽性細胞，隨后通過磁珠快速地進行分離篩選。2）組織內或體內篩選法。細胞培養(yǎng)存在一定的局限性，許多細胞往往無法進行體外培養(yǎng)。部分細胞雖可進行體外培養(yǎng)，但體外環(huán)境的改變會使細胞膜表面的蛋白發(fā)生變化，使其與在體內環(huán)境中培養(yǎng)的膜蛋白構象出現(xiàn)較大的差異，進而無法有效地觀察到抗體的結合。與進行體外篩選相比，在組織內或體內對噬菌體抗體進行篩選，能夠保持抗體本身自然的三維環(huán)境，更加適用于對腫瘤組織及器官上細胞特異性標志物的抗體進行篩選[9]。有研究表明，將待篩選的噬菌體抗體通過尾靜脈注射的方式注入到小鼠的體內，這些抗體會通過小鼠自身的血液循環(huán)作用分布至其全身，其血液中的非特異性抗體會逐漸被稀釋、清除，而特異性抗體則能夠結合在不同的組織、器官中。通過分離其相應的組織或器官的細胞可對特異性抗體進行洗脫、富集，獲得特異性噬菌體抗體。2000 年Johns 等[10]通過組織內或體內篩選法成功地從內皮細胞中獲得了特異性噬菌體抗體庫。1997年Tordson 等[11]采集了黑色素瘤的組織樣本，將其制備成冰凍組織切片，通過幾輪的平移后進行篩選、富集，獲得了針對黑色素瘤的特異性噬菌體抗體庫。但是，組織內或體內篩選法具有一定的局限性，即進行篩選的過程無法在體內完成，故不能對非特異性結合位點進行封閉處理，致使抗體與組織結合的背景復雜，隨意性較強。

3 小結

噬菌體抗體庫技術具有操作簡單、高效等特點，其應用的前景廣泛。目前，篩選噬菌體抗體庫的方法雖然較多，但這些篩選方法的效率卻普遍不高。因此，需在今后的研究中進一步優(yōu)化噬菌體抗體庫的篩選方法，以提高篩選噬菌體抗體庫的效率，進而為新藥的研發(fā)及疫苗的研制提供幫助。