去唾液酸糖蛋白受體在肝臟疾病診治中的應(yīng)用及研究進展

胡虎蘭，姚金金

(1.杭州市第九人民醫(yī)院 消化內(nèi)科，浙江 杭州 311225；2.杭州師范大學(xué)附屬醫(yī)院 藥劑科，浙江 杭州 310015)

中國是肝病大國，現(xiàn)有的肝病種類包括病毒性肝炎、自身免疫性肝病、酒精性肝病、非酒精性脂肪肝、肝纖維化、肝硬化、肝癌等[1]。隨著疾病進展，任何種類的肝病均可出現(xiàn)進一步惡化，肝臟疾病的有效診治顯得尤為重要。去唾液酸糖蛋白受體(asialoglycoprotein receptor，ASGPR)是肝細胞膜表面的一種異源低聚物內(nèi)吞受體，又稱為半乳糖/N-乙?；咸前肥荏w、Ashwell-Morell受體、肝凝集素。ASGPR特定于肝細胞膜表面，特異性識別、結(jié)合并轉(zhuǎn)載糖蛋白[2]。本文綜述目前ASGPR在各類肝臟疾病診治中的應(yīng)用。

1 肝臟疾病流行病學(xué)現(xiàn)狀

據(jù)WHO報道，每年有一定數(shù)量的肝病患者死亡，2015年約有134萬人死于病毒性肝炎。病毒性肝炎按病原學(xué)可分為甲型、乙型、丙型、丁型和戊型。全球每年約140萬人感染甲型肝炎病毒(hepatitis A virus，HAV)，HAV主要通過糞—口傳播，因此其發(fā)病率隨經(jīng)濟水平及衛(wèi)生狀況波動。盡管甲型病毒性肝炎屬于自限性疾病，但易引起大規(guī)模暴發(fā)和流行，且當前甲肝疫苗及治療藥物尚不成熟[3]，嚴重者仍可引起死亡。2015年，全球約有1.1萬人死于HAV感染。全球乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)感染者高達2.57億，我國高達7千萬。近年來，乙肝疫苗及抗HBV藥物應(yīng)運而生，HBV感染控制成效顯著，然而HBV仍無法達到完全根治的目的，全球每年約有88.7萬人死于HBV感染[1]。全球約有7 100萬人感染丙型肝炎病毒(hepatitis C virus，HCV)，每年約有39.9萬人死于HCV感染并發(fā)癥，現(xiàn)有的抗病毒藥物存在治療適應(yīng)證局限及不良反應(yīng)[4]。全球每年約有2 000萬人感染戊型肝炎病毒(hepatitis E virus，HEV)。戊型病毒性肝炎屬于食源性人畜共患疾病，大部分HEV感染者存在臨床表達沉默和自我限制的特點，但仍有引起慢加急或急性肝衰竭的風(fēng)險，急性暴發(fā)流行多見于衛(wèi)生條件落后的國家，每年約有5.6萬人死于HEV[5]。

自身免疫性肝病(autoimmune liver disease, AILD)受遺傳和環(huán)境等因素影響，發(fā)病機制復(fù)雜，治療方法不一，易合并出現(xiàn)肝硬化。禁錮于現(xiàn)有的診斷手段，自身免疫性肝病的發(fā)病率統(tǒng)計并不完全[6]。隨著生活水平的提高，酒精性肝病(alcoholic liver disease，ALD)及非酒精性脂肪肝(nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD)發(fā)病率逐步提升，全球每年有330萬人死于過量飲酒[7]，NAFLD患病率為6.3%～45.0%，其中中東和南美洲患病率最高，亞洲最低[8]。

肝纖維化是肝硬化的早期階段，肝硬化、肝癌是肝病的終末環(huán)節(jié)且不可逆轉(zhuǎn)。據(jù)統(tǒng)計，肝癌是全球第五大常見腫瘤，在腫瘤致死率中排名第2[9]。

2 ASGPR概述

2.1 ASGPR結(jié)構(gòu) ASGPR由46 kD主要亞基ASGPR(H1)和50 kD次要亞基ASGPR2(H2)組成，含量比為3：1，均為Ⅱ型單次跨膜糖蛋白。ASGPR主要分布于肝小葉的門靜脈周圍，每個肝細胞約有1×105～5×105個結(jié)合位點，富集于網(wǎng)格蛋白聚集處。ASGPR根據(jù)功能區(qū)劃分為胞質(zhì)區(qū)、跨膜區(qū)、蒂區(qū)和糖識別域，其中因糖識別域識別并結(jié)合配體的機制為鈣離子依賴，故屬C型凝集素。配體被H1亞基有效識別結(jié)合后，通過H1、H2亞基共同完成內(nèi)吞作用。ASGPR亦分布于細胞內(nèi)囊泡組織、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體中，參與一系列的運輸過程，配體最終在溶酶體中被降解[10]。

2.2 ASGPR檢測方法 目前，ASGPR有多種檢測方法，基礎(chǔ)步驟為以pET3-CRDH1為模板設(shè)計引物，PCR擴增CRDH1基因，定向克隆至原核表達載體pET-32c中。含有CRDH1/pET-32c的BL21單菌落通過TPTG誘導(dǎo)表達，Ni2+螯合柱親和純化其表達產(chǎn)物。H1/H1b最終檢測方法可采用：(1)免疫印跡技術(shù)分析其免疫反應(yīng)性，該方法對H1b亞基特異性識別，尤其是天然構(gòu)象的內(nèi)源性H1b亞基，但不識別H1a亞基，且該檢測方法要求采用肝臟組織標本[11]。(2)間接法rH1-IgG-ELISA，該方法具有較好的敏感性及特異性，對檢測標本的純度要求不高，但操作過程復(fù)雜，成本高[12]。(3)捕獲噬菌體酶免疫吸附試驗法，該檢測方法假陽性率低，具有高效率的篩選能力，但對標本純度要求苛刻[13]。(4)流式細胞術(shù)和免疫組織化學(xué)法，該檢測方法特異性良好，可用于鑒別原發(fā)性肝癌及轉(zhuǎn)移性肝癌，但對肝組織細胞完整性要求高[14]。H2檢測方法可采用半定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式反應(yīng)技術(shù)(RT-PCR)，該方法基于mRNA水平檢測，特異性高，僅需血清標本即可完成，操作簡便[15]。H2a檢測方法可采用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附法，該方法操作簡單且已制備成試劑盒，具有穩(wěn)定性好、特異性強、靈敏度高、準確度高等特點，對標本要求不高，但仍需大樣本檢測優(yōu)化方法[16]。

3 ASGPR在肝臟疾病診治中的應(yīng)用

3.1 病毒性肝炎

3.1.1 甲型病毒性肝炎 HAV與ASGPR相關(guān)性的研究較少。Dotzauer 等[17]采用定量檢測HAV負鏈RNA，表明HAV通過形成HAV-抗HAV IgA復(fù)合物經(jīng)ASGPR介導(dǎo)進入肝細胞內(nèi)。進入細胞內(nèi)后，HAV逃逸，基因組RNA釋放，病毒大量復(fù)制，導(dǎo)致肝臟疾病惡化。

3.1.2 乙型病毒性肝炎 Sewing等[18]利用HBV通過ASGPR介導(dǎo)完成肝細胞感染機制制備的抗病毒藥物具有靶向性強和腎臟毒副作用小等優(yōu)點。HBV附著于PreS1區(qū)的21～47氨基酸位點，一種50 kD的糖蛋白(含有N-乙酰半乳糖胺和N-乙酰氨基葡萄糖殘基)通過特異性結(jié)構(gòu)域結(jié)合PreS1區(qū)，使HBV能被ASGPR識別并介導(dǎo)進入肝細胞內(nèi)，HBV入胞后開始復(fù)制工作[19]。Vyas等[20]在研究胎盤滋養(yǎng)細胞時發(fā)現(xiàn)，母體HBV感染者ASGPR表達增加；通過免疫熒光檢測到在滋養(yǎng)層和胎盤樹突狀細胞中存在ASGPR和HBV共同位點，認為樹突狀細胞是HBV載體，能被ASGPR識別，通過ASGPR通道完成HBV的內(nèi)吞、結(jié)合和攝取過程。但ASGPR在垂直傳播中的作用并未被證實。Javanbakht等[21]將用于抗病毒治療的單鏈寡核苷酸(single-stranded oligonucleotide，SSO)置于鎖核酸(locked nucleic acid，LNA)平臺，形成LNA-SSO復(fù)合物。該LNA-SSO復(fù)合物與3個N-乙酰半乳糖結(jié)合，可特異性識別肝細胞表面的ASGPR，經(jīng)該受體介導(dǎo)進入肝細胞內(nèi)，達到高效的抗病毒作用。Latavia等[22]采用ASGPR特異性配體(包括半乳糖、乙酰半乳糖胺、亞細胞苷)嘗試標記載體，與藥物結(jié)合運送至肝細胞內(nèi)，提高藥物攝取率。隨著研究進展，新的ASGPR特異性配體層出不窮，包括納米粒子(無機納米粒子、高分子納米粒子)、脂類(可電離脂質(zhì)納米粒子、陽離子脂質(zhì)、脂質(zhì)體、高密度脂蛋白、固體脂質(zhì)納米粒子)、細胞穿膜肽、HBV附著物抑制劑。

3.1.3 丙型病毒性肝炎 研究[23]表明，HCV p7可上調(diào)ASGPR1基因表達，ASGPR1啟動子順式激活下游基因，促進HCV與肝細胞結(jié)合。利用siRNA制成的靶向制劑可顯著增加HCV清除率。Lakshminarayanan等[24]采用聚丙烯醚亞胺樹突狀大分子，與siRNA相互作用結(jié)合，靶向傳遞siRNA至肝細胞內(nèi)HCV核周區(qū)域，可有效抑制HCV復(fù)制。Willoughby等[25]研究表明，GalNAc-siRNA技術(shù)可應(yīng)用于肝靶向，且可降低ASGPR表達的疾病狀態(tài)。

3.1.4 戊型病毒性肝炎 目前，HEV與ASGPR相關(guān)性研究較少。Zhang等[26]通過免疫沉淀、下拉和酶聯(lián)免疫吸附試驗，發(fā)現(xiàn)HEV ORF2蛋白直接與ASGPR1和ASGPR2的外區(qū)相互作用，促使HEV與肝細胞結(jié)合并進入肝細胞內(nèi)，導(dǎo)致HEV感染的發(fā)生。

3.2 自身免疫性肝病 ASGPR抗體對AILD的診斷特異性高，免疫系統(tǒng)中的部分免疫球蛋白經(jīng)ASGPR介導(dǎo)進入細胞內(nèi)；AILD患者血清中ASGPR抗體含量高，可作為檢測、評估病情輕重及預(yù)后情況的重要標志[27]。

3.3 酒精性肝病 乙醇可引起肝細胞ASGPR表達下降，損害ASGPR功能，ALD的損傷程度與ASGPR存在相關(guān)性。ASGPR可識別末端含有半乳糖或N-乙酰半乳糖殘基的糖蛋白，可去除潛在有害的去解離糖蛋白，同時參與凋亡細胞的攝取[28]。ALD患者中的ASGPR表達下降，但仍保存部分ASGPR通道的完整性。Wang等[29]將當歸多糖(angelica sinensis polysaccharide，ASP)通過酯化反應(yīng)合成雙性膽固醇半琥珀酸-ASP(ASP-CHEMS)，再裝配成ASP-CHEMS納米粒子，合成ACNPs。ACNPs可有效結(jié)合ASGPR，并利用ASGPR通道進入肝細胞。相較于ASP通過非ASGPR通道進入肝細胞，前者使ASP具有更高的溶解性、光穩(wěn)定性及肝臟靶向性，達到更好的治療效果。基于ACNPs可利用ALD患者僅存的ASGPR通道達到更好的治療效果。

3.4 非酒精性脂肪肝 ASGPR1屬于肝細胞源性循環(huán)細胞外囊泡(circulating extracellular vesicles，EVs)，而EVs是非酒精性脂肪性肝炎(nonalcoholic steatohepatitis，NASH)的新興生物標志物，Li等[30]發(fā)現(xiàn)在NASH小鼠中，ASGPR1隨著飼養(yǎng)周期延長而逐步升高，ASGPR1可作為NASH診斷和隨訪的新生標志物。

3.5 肝纖維化 在肝纖維化患者中，ASGPR水平降低。Wang等[31]采用ASGPR染色法在小鼠中得到了證實。

3.6 肝硬化 景博瓊等[32]通過研究發(fā)現(xiàn)，肝硬化患者的抗ASGPR水平明顯高于健康者及慢性肝炎患者，認為抗ASGPR有助于臨床診治的鑒別診斷，有幫助治療和評估預(yù)后的價值。

3.7 肝癌 Ding等[33]研究發(fā)現(xiàn)，肝癌中ASGPR1基因表達下調(diào)，認為ASGPR1水平與肝癌晚期淋巴轉(zhuǎn)移TNM分期有關(guān)，推測ASGPR1可抑制肝癌的發(fā)生發(fā)展，并抑制肝癌轉(zhuǎn)移和侵襲。肝癌靶向治療藥物與乳糖化衍生物結(jié)合，通過ASGPR介導(dǎo)進入肝細胞內(nèi)，既增強抗腫瘤藥物的療效又減少對其他組織的毒副反應(yīng)。研究[34-37]發(fā)現(xiàn)，可用于結(jié)合ASGPR的載體包括糖基化前藥、糖基化小分子納米藥物載體、糖基化基因復(fù)合物，其中糖基化小分子納米藥物載體包括聚合物膠束、脂質(zhì)體、糖基化殼聚糖載體、樹枝狀聚合體、金納米粒子、果膠等。

4 總結(jié)和展望

綜上所述，ASGPR肝臟特異性強，參與肝臟疾病的發(fā)生發(fā)展。目前基于ASGPR制備了部分新型制劑，當前制劑仍以動物實驗應(yīng)用為主，還未真正應(yīng)用于臨床醫(yī)療，亟待進一步深入研究，以發(fā)揮其更大的臨床價值。