楊海清，劉蕊婷，張?jiān)氯?，李錫祥，黨鴻蔚，任 艷，崔曉賓，劉春霞，胡建明

(1.石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院，新疆石河子 832002；2.石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院，新疆石河子 832008）

宮頸癌是常見(jiàn)的婦科惡性腫瘤之一，其發(fā)病率在我國(guó)女性惡性腫瘤中僅次于乳腺癌，全球每年宮頸癌的新發(fā)病例數(shù)大約為53萬(wàn)例，中國(guó)的死亡病例數(shù)約為2.6萬(wàn)例[1]，但宮頸癌的發(fā)生需要?dú)v經(jīng)眾多階段，及時(shí)、準(zhǔn)確發(fā)現(xiàn)宮頸癌前病變，預(yù)測(cè)其發(fā)展方向并選擇恰當(dāng)?shù)脑\治策略具有重要臨床意義。宮頸上皮內(nèi)病變（cervical intraepithelial neoplasia,CIN）與宮頸浸潤(rùn)癌密切相關(guān)，是宮頸癌的癌前病變之一，根據(jù)其病變程度可將其分為低級(jí)別鱗狀上皮內(nèi)病變（LSIL，CIN Ⅰ）和高級(jí)別鱗狀上皮內(nèi)病變（HSIL，CIN Ⅱ，CIN Ⅲ），其中，大部分低級(jí)別鱗狀上皮內(nèi)病變可自行消退或治愈，少部分有向更高級(jí)別病變甚至宮頸癌發(fā)展的風(fēng)險(xiǎn)。未明確意義的非典型鱗狀細(xì)胞(atypical squamous cells of undetermined significance，ASC-US)既可能提示著宮頸發(fā)生了HPV感染或其他惡性病變，也可能僅代表炎癥等良性反應(yīng)發(fā)生，ASC-US 是細(xì)胞學(xué)診斷的灰區(qū)。臨床對(duì)于LSIL 和 ASC-US 的干預(yù)與治療仍處于困境之中。P16 蛋白和Ki67 蛋白在細(xì)胞中的過(guò)表達(dá)提示細(xì)胞周期混亂，免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)P16和Ki67 陽(yáng)性與HR-HPV感染有關(guān)，大量研究已驗(yàn)證P16，Ki67 染色在宮頸癌篩查應(yīng)用中的可行性及檢測(cè)結(jié)果的可靠性。本文對(duì)宮頸組織進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)P16和Ki67的表達(dá)在LSIL和ASC-US中的應(yīng)用價(jià)值作綜述。

1 P16和Ki67的功能及其共表達(dá)

1.1 P16的功能及其表達(dá)意義 P16 通常由染色體9p21 基因編碼，參與細(xì)胞周期調(diào)控，發(fā)揮細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑的作用。P16 阻斷了CDK4與CDK6 介導(dǎo)的pRb 磷酸化反應(yīng)，非磷酸化的pRb同轉(zhuǎn)錄因子E2F 結(jié)合，抑制細(xì)胞進(jìn)入S 期，從而達(dá)到對(duì)細(xì)胞周期的負(fù)性調(diào)控作用[2]，反之，當(dāng)P16基因失活時(shí)，CDK4 被細(xì)胞周期蛋白結(jié)合，正常的Rb 蛋白磷酸化抑制機(jī)制失調(diào)，轉(zhuǎn)錄因子 E2F 與磷酸化的Rb 解離并活化，是細(xì)胞周期的轉(zhuǎn)錄基因被激活，形成異常細(xì)胞周期。因此正常細(xì)胞中P16基本不表達(dá)，當(dāng)細(xì)胞周期調(diào)控機(jī)制異常時(shí)，P16 增殖活躍，P16 過(guò)表達(dá)通常提示細(xì)胞周期阻滯。在宮頸癌病變發(fā)生過(guò)程中，HPV感染并整合至宿主細(xì)胞DNA 致使E6和E7 癌蛋白持續(xù)高表達(dá),使細(xì)胞周期失衡，P16 蛋白隨之呈現(xiàn)過(guò)度表達(dá)狀態(tài)[3]，因此P16 過(guò)表達(dá)可被認(rèn)為提示了E7 癌蛋白表達(dá)失調(diào)，當(dāng)P16 過(guò)表達(dá)并且在細(xì)胞內(nèi)積聚時(shí)便提示發(fā)生了宮頸癌前病變，其表達(dá)可通過(guò)免疫組織化學(xué)染色方法來(lái)進(jìn)行檢測(cè)[4]。近年來(lái)，P16 免疫組織染色法逐漸被推薦用于區(qū)分HSIL 和無(wú)關(guān)的腫瘤性疾病，研究表明P16 免疫組化染色可作為預(yù)測(cè)CIN 進(jìn)展的特異性生物標(biāo)志物[5]。但是，HERFS 等[6]的報(bào)道中指出，僅僅依靠P16 檢測(cè)并不能準(zhǔn)確診斷宮頸上皮內(nèi)瘤病變，要想達(dá)到明確診斷需要聯(lián)合其他標(biāo)記物。

1.2 Ki67的功能及其表達(dá)意義 Ki67 是一種增殖細(xì)胞的相關(guān)抗原，由染色體10q25 基因編碼。Ki67在靜止期細(xì)胞中基本不表達(dá)，而在增殖的細(xì)胞中普遍存在表達(dá)，在不同的細(xì)胞進(jìn)展周期中發(fā)揮著不同的作用。Ki67 免疫組織化學(xué)染色陽(yáng)性通常提示細(xì)胞處于細(xì)胞周期增殖期，因此它可作為腫瘤細(xì)胞增殖的標(biāo)志物，預(yù)測(cè)腫瘤的惡性潛能，Ki67表達(dá)越高，腫瘤惡性進(jìn)展的風(fēng)險(xiǎn)也就越高[7]。在宮頸癌中，Ki67 能反映癌細(xì)胞的分化程度，對(duì)臨床腫瘤診斷可起到輔助作用[8]，Ki67 標(biāo)記指數(shù)（LI）會(huì)隨著宮頸病變組織學(xué)分級(jí)的增加而增加[9]，同時(shí)Ki67的表達(dá)與病變的嚴(yán)重程度乃至生長(zhǎng)速度之間存在一定關(guān)聯(lián)，證實(shí)了Ki67表達(dá)在HPV 引起的宮頸病變分析中具有一定的應(yīng)用價(jià)值[10-11]，目前Ki67的檢測(cè)被廣泛作為宮頸癌前病變和其他癌癥的輔助診斷[12]。

1.3 P16/Ki67的共表達(dá) P16和Ki67 分別作為腫瘤抑制因子和細(xì)胞增殖標(biāo)記物，在正常狀態(tài)下P16的過(guò)表達(dá)和Ki67的表達(dá)相互排斥，通常不會(huì)發(fā)生于同一宮頸上皮細(xì)胞中，如果出現(xiàn)P16，Ki67 共同表達(dá)則意味著高危型HPV 誘導(dǎo)的細(xì)胞周期異常。共表達(dá)的P16和Ki67 可作為預(yù)測(cè)高危型HPV 誘導(dǎo)細(xì)胞轉(zhuǎn)化和CIN 高級(jí)別病變的標(biāo)志[12]，因此免疫組織化學(xué)P16/Ki67雙染檢測(cè)法可被作為宮頸癌前病變和宮頸癌的篩查診斷手段。

2 P16/Ki67雙染檢測(cè)法與其他方法比較

細(xì)胞學(xué)檢測(cè)方法作為宮頸早期篩查手段已作為一項(xiàng)重大公共衛(wèi)生決策被許多國(guó)家所接受并執(zhí)行，但長(zhǎng)期實(shí)踐表明細(xì)胞學(xué)檢測(cè)法在制片、診斷等方面均存在主觀性強(qiáng)、依賴醫(yī)生經(jīng)驗(yàn)且無(wú)法判定LSIL和ASCUS 患者的病變進(jìn)展方向等不足。關(guān)于P16/Ki67雙染檢測(cè)法與細(xì)胞學(xué)檢測(cè)法在宮頸病變中的應(yīng)用價(jià)值，不同研究存在不同的觀點(diǎn)。WRIGHT 等[13]通過(guò)對(duì)980例病例進(jìn)行P16/Ki67雙染和TCT 檢測(cè)后發(fā)現(xiàn)，雙染檢測(cè)法對(duì)宮頸CIN Ⅱ和CIN Ⅲ病變?cè)\斷的敏感度和特異度均高于TCT 檢測(cè)，說(shuō)明相比細(xì)胞學(xué)檢測(cè)法，雙染檢測(cè)法在提高診斷準(zhǔn)確度等方面可能具有更好的價(jià)值。WRIGHT 等[13]人的研究顯示雙染檢測(cè)與細(xì)胞學(xué)檢測(cè)法相比特異度相似，但其有更高的靈敏度，西班牙的一項(xiàng)研究與此相反，AREáN-CUNS 等[14]的結(jié)果顯示的是在對(duì)HPV 陽(yáng)性患者進(jìn)行分流時(shí)，雙染檢測(cè)的靈敏度與細(xì)胞學(xué)檢測(cè)方法相當(dāng)，但其特異度顯著超過(guò)細(xì)胞學(xué)檢測(cè)法，這說(shuō)明雙染檢測(cè)法在病變檢測(cè)的靈敏度和特異度方面也存在一定的不穩(wěn)定性，但總的來(lái)說(shuō)，與細(xì)胞學(xué)檢測(cè)方法相比，雙染檢測(cè)法在結(jié)果判定等方面相對(duì)客觀，因而在篩查宮頸病變方面具有更大的潛力。

HPV檢測(cè)法是宮頸病變的檢測(cè)方法之一，它被認(rèn)為有較強(qiáng)的靈敏度。但HPV檢測(cè)法僅能檢測(cè)有無(wú)病毒，無(wú)法區(qū)分病毒的一過(guò)性感染和持續(xù)性感染，而一過(guò)性的HPV感染在宮頸惡性病變環(huán)節(jié)不發(fā)揮作用，持續(xù)性的HPV感染才是導(dǎo)致宮頸病變的原因。同時(shí)，宮頸病變?cè)\斷的目的是判斷宮頸是否發(fā)生了病變，但HPV檢測(cè)陽(yáng)性不代表宮頸發(fā)生了病變，它僅能說(shuō)明未來(lái)宮頸癌發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)增加。HPV DNA檢測(cè)用于宮頸癌診斷的靈敏度、特異度及準(zhǔn)確度均不高，尚不足以作為單獨(dú)檢測(cè)診斷宮頸癌的依據(jù)[15]。有關(guān)研究顯示在異常宮頸病變的診斷中，P16/Ki67雙染在不降低靈敏度的同時(shí)提高了特異度，相對(duì)雙染檢測(cè)法具有更好的診斷效能。WENTZENSEN[16]的結(jié)果表明，在對(duì)CIN Ⅱ及以上病變的診斷中，P16/Ki67雙染法比起HPV檢測(cè)具有更高的特異度。同時(shí)，有研究顯示，與HPV檢測(cè)相比，P16/Ki67雙染檢測(cè)法對(duì)于異常宮頸病變具有更好地分流能力[17]和費(fèi)用效能[18]。

一些將P16/Ki67雙染檢測(cè)法、細(xì)胞學(xué)檢測(cè)法和HPV檢測(cè)法聯(lián)合比較的研究也表明，P16/Ki67雙染法在檢測(cè)宮頸病變時(shí)可以作為一種更有價(jià)值的檢測(cè)手段。在WANG 等[19]的研究中，P16/Ki67雙染法對(duì)異常宮頸病變檢出的靈敏度明顯高于LBC 法和HPV16/18 基因分型，在GE 等[20]的研究中，雙染檢測(cè)法對(duì)CIN Ⅱ及其以上病變的敏感度與TCT和高危型HPV 篩查相當(dāng)，但特異度顯著高于其他兩種，與此相同，黃美虹等[21]人的研究也證實(shí)了雙染檢測(cè)法在診斷HSIL 時(shí)能在不降低靈敏度的同時(shí)提高特異度，且具有更高的陽(yáng)性預(yù)測(cè)值，這說(shuō)明雙染檢測(cè)法能夠提高宮頸病變?cè)\斷的準(zhǔn)確性。在對(duì)HPV檢測(cè)陽(yáng)性患者進(jìn)行分流的應(yīng)用中，賈漫漫等[22]人證明P16/Ki67雙染檢測(cè)法也有較好的效能，她們的研究以CIN Ⅱ?yàn)榧膊〗K點(diǎn)指標(biāo)，發(fā)現(xiàn)雙染檢測(cè)的靈敏度與LBC 檢測(cè)相等，高于HPV檢測(cè)，特異度高于其他兩種檢測(cè)方法，其陽(yáng)性預(yù)測(cè)值和陰性預(yù)測(cè)值與其他兩種方法相比也更占有優(yōu)勢(shì)，具有更好地分流效能。

3 免疫組化染色檢測(cè)P16，Ki67在LSIL中表達(dá)的應(yīng)用

根據(jù)美國(guó)國(guó)家綜合癌癥網(wǎng)絡(luò)( NCCN) 宮頸癌篩查指南，LSIL 病例的治療以臨床觀察為主[7]，對(duì)LSIL 的積極治療可能導(dǎo)致了醫(yī)療資源的浪費(fèi)，造成患者的心理負(fù)擔(dān)，消極治療又可能導(dǎo)致癌前病變進(jìn)展為癌癥，但因約10%的LSIL 會(huì)進(jìn)展為HSIL，尋找一種適宜手段合理管理LSIL 病例勢(shì)在必行。

3.1 P16 在LSIL中的應(yīng)用價(jià)值 多項(xiàng)研究表明，P16 免疫組織化學(xué)染色的陰陽(yáng)性結(jié)果和陽(yáng)性表達(dá)率對(duì)LSIL 的進(jìn)展傾向有預(yù)測(cè)價(jià)值。馬新義等[7]在研究過(guò)程中收集了84例LSIL 病變病例和22例良性反應(yīng)病例,他們發(fā)現(xiàn)在LSIL 病例中，P16的陽(yáng)性表達(dá)率高于宮頸正常和炎癥病例，這提示了P16 可以作為區(qū)分LSIL 和良性反應(yīng)性改變的鑒別診斷因子。SARI 等[23]人的研究提示在低級(jí)別宮頸上皮內(nèi)瘤變中，P16染色彌漫陽(yáng)性病例更傾向于發(fā)展至高級(jí)別病變，P16染色陰性則存在較高的倒退傾向，BENEVOLO 和CHAROONWATANA 等[24-25]的 研究與此相同，BENEVOLO 等[24]的研究發(fā)現(xiàn)P16染色彌漫陽(yáng)性的LSIL 病例有更高地可能性向高級(jí)別進(jìn) 展，CHAROONWATANA 等[25]對(duì)96例LSIL 的隨訪結(jié)果顯示P16染色結(jié)果為陰性的病例僅有3.6%進(jìn)展為高級(jí)別病變，這說(shuō)明宮頸組織P16染色結(jié)果對(duì)評(píng)估LSIL 病變是否會(huì)向更高級(jí)別病變發(fā)展有著重要作用。另外一些研究證明，P16染色的陽(yáng)性率越高，LSIL 病例進(jìn)展的可能性越大。馬新義等[7]在對(duì)84例LSIL 隨訪12個(gè)月后發(fā)現(xiàn)，LSIL 進(jìn)展組病例中 P16 陽(yáng)性表達(dá)率為76.9%，高于持續(xù)組(25.0%)和消退組(19.1%)；NEGRI 等[26]的研究與此相似，在對(duì)LSIL 進(jìn)行隨訪后，他們發(fā)現(xiàn)P16 陰性和彌漫陽(yáng)性的LSIL 病變分別有71.4%和37.8%回歸，而28.6%和62.2%的陰性和彌漫陽(yáng)性的CIN Ⅰ病變進(jìn)展為高級(jí)別病變，這提示P16染色陽(yáng)性率對(duì)判斷LSIL 病人在后期是否會(huì)向高級(jí)別病變進(jìn)展具有預(yù)測(cè)作用。

3.2 Ki67在LSIL中的應(yīng)用價(jià)值 Ki67 可作為宮頸病變的標(biāo)記物，其染色結(jié)果也可提示LSIL 病例發(fā)展傾向。馬新義等[7]的研究同時(shí)顯示Ki67 陽(yáng)性表達(dá)率均高于宮頸正常和炎癥病例，Ki67 可以作為區(qū)分LSIL 和良性反應(yīng)性改變的鑒別診斷因子。KRUSE 及其團(tuán)隊(duì)[27]隨訪了44例LSIL 病例，發(fā)現(xiàn)Ki67 染色結(jié)果預(yù)測(cè)LSIL 發(fā)生進(jìn)展的靈敏度為100%，特異度為56%，說(shuō)明大部分的進(jìn)展病例是能通過(guò)Ki67 染色結(jié)果預(yù)測(cè)到的。馬新義等[7]在后期隨訪后發(fā)現(xiàn)LSIL 進(jìn)展組Ki67 陽(yáng)性表達(dá)率高于持續(xù)組和消退組，賴婷等[28]的研究與此相似也顯示了LSIL 進(jìn)展患者的組織中Ki67的陽(yáng)性表達(dá)率也明顯高于 LSIL 未進(jìn)展組，由此可以看出，Ki67的陽(yáng)性表達(dá)率越高，LSIL 病例進(jìn)展為高級(jí)別病例的可能性也就越大。ALSHENAWY 等[29]人則發(fā)現(xiàn)Ki67的表達(dá)隨CIN 等級(jí)升高逐漸增加，癌癥組織中，Ki67的表達(dá)率達(dá)到100%，因此，不難得出結(jié)論，Ki67的表達(dá)率可能是評(píng)估LSIL 病變的有效預(yù)測(cè)因子。

3.3 P16/Ki67雙染在LSIL中的應(yīng)用價(jià)值 國(guó)內(nèi)外的多項(xiàng)研究表明P16/Ki67雙染在LSIL中的轉(zhuǎn)歸具有預(yù)測(cè)意義。邱曉陽(yáng)等[30]通過(guò)對(duì)LSIL 病例進(jìn)行隨訪并結(jié)局分為進(jìn)展、持續(xù)和消退三組，他們發(fā)現(xiàn)P16/Ki67雙染陽(yáng)性的LSIL 病變進(jìn)展率是陰性的3倍，雙染陽(yáng)性診斷LSIL 病變持續(xù)率是陰性的1.2 倍，黃美虹等[23]使用了相似的研究方法，她們的研究顯示LSIL 病變進(jìn)展的病例中，P16/Ki67雙染陽(yáng)性病變進(jìn)展是陰性的2 倍，這說(shuō)明雙染結(jié)果陽(yáng)性可作為L(zhǎng)SIL 病例會(huì)發(fā)生進(jìn)展的指征。在VRDOLJAKMOZETIC 等[31]的研究中P16/Ki67 陽(yáng)性病例的進(jìn)展率和陰性進(jìn)展率分別為30.8%和4.3%，顯著高于陰性病例的進(jìn)展率，也同樣證實(shí)了P16/Ki67雙染檢測(cè)法對(duì)LSIL 病例轉(zhuǎn)歸具有預(yù)測(cè)作用。此外，也有很多研究表明，P16/Ki67雙染法對(duì)從LSIL 病例中篩出高級(jí)病變有較好的特異度。LIAO 等[32]表明P16/Ki-67 雙染可用于在低級(jí)別宮頸病變中診斷高級(jí)別病變，周小會(huì)等[33]在研究P16/Ki67雙染在LSIL病例中篩查出HSIL 病例的價(jià)值時(shí)指出，雖然雙染檢測(cè)法的靈敏度與陰性預(yù)測(cè)值只與高危型人乳頭瘤病毒(HR-HPV)檢測(cè)相當(dāng)，但其特異度和陽(yáng)性預(yù)測(cè)值顯著超過(guò)了HR-HPV檢測(cè)；歐洲一項(xiàng)納入了27 349例女性的研究[34]也同樣顯示P16/Ki67雙染在從LSIL 病例中檢出HSIL 病例有較高陽(yáng)性預(yù)測(cè)值?？梢?jiàn)P16/Ki67 聯(lián)合染色對(duì)預(yù)測(cè)LSIL 病變的轉(zhuǎn)歸以及從LSIL 病變中篩檢出高級(jí)別病變皆有較高的效能。

4 免疫組化染色檢測(cè)P16，Ki67表達(dá)在ASCUS中的應(yīng)用

在宮頸細(xì)胞檢查中可經(jīng)常觀察到非典型鱗狀細(xì)胞(atypical squamous cells of undetermined significance，ASCUS)，其細(xì)胞異常特征明顯多于炎性細(xì)胞改變，但數(shù)量和質(zhì)量不足以診斷為CIN，故成為細(xì)胞學(xué)診斷中的灰區(qū)。ASCUS 病例惡變的頻率在1.6%和9.0%之間[35]，如果ASCUS 不能有效分流則會(huì)錯(cuò)過(guò)最佳治療時(shí)機(jī)，病變可能會(huì)繼續(xù)發(fā)展到更高級(jí)別或鱗狀細(xì)胞癌。然而，ZHU 等[36]研究發(fā)現(xiàn)，在ASCUS中，CIN Ⅱ+僅占18.0%，CIN Ⅲ+僅占8.3%，且大多數(shù)ASCUS 是CIN Ⅰ或?qū)m頸炎癥，如果所有ASCUS 患者接受陰道鏡檢查則會(huì)過(guò)度治療ASCUS。

目前針對(duì)檢測(cè)到ASCUS 的患者，臨床管理策略是從中分流出宮頸上皮內(nèi)瘤變2 級(jí)及以上(CIN Ⅱ+)病變，主要采用HR-HPV檢測(cè)法，但此法存在特異度低、陽(yáng)性預(yù)測(cè)值低等問(wèn)題。國(guó)內(nèi)外很多研究表明P16/Ki67雙染法比HR-HPV檢測(cè)法更能提高診斷的特異度，在ZHU 等[36]人的研究中，共有300例ASCUS 患者接受了宮頸組織病理學(xué)診斷，HPV-DNA 檢測(cè)總陽(yáng)性率為85.3%，P16/Ki67 免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)陽(yáng)性率為32.0%，說(shuō)明用P16/Ki67雙染法代替HPV-DNA 檢測(cè)對(duì)ASCUS 進(jìn)行分型，可使陰道鏡檢查的轉(zhuǎn)診率降低53.3%。有研究[37-39]在對(duì)ASCUS 患者進(jìn)行分診時(shí)發(fā)現(xiàn)，P16/Ki67 對(duì)CIN II +的敏感度為86.36%，對(duì)CIN Ⅲ+的敏感度為83.33%，與 HR-HPV 相似，而P16/Ki67的特異度均高于HR-HPV，提示 P16/Ki67雙染檢測(cè)可作為我國(guó)宮頸癌篩查的有效方法。馬春華等[40]人研究雙染檢測(cè)法在ASCUS 的分流作用時(shí)發(fā)現(xiàn)，P16/Ki67雙染檢測(cè)法在檢測(cè)診斷 CIN Ⅱ和 CIN Ⅲ病變時(shí)靈敏度（陽(yáng)性符合率) 達(dá)到了92%，特異度（陰性符合率)達(dá)到67.6%，雙染檢測(cè)結(jié)果與組織病理學(xué)結(jié)果符合率高?？梢?jiàn)P16/Ki67雙染檢測(cè)能夠優(yōu)化臨床醫(yī)師對(duì)ASCUS 患者的分層管理。

5 小結(jié)

綜上所述，目前大部分研究證實(shí)了檢測(cè)P16，Ki67 蛋白在宮頸上皮內(nèi)病變中的表達(dá)對(duì)LSIL 病例的分流及預(yù)測(cè)轉(zhuǎn)歸具有意義；P16/Ki67 免疫組織化學(xué)雙染法對(duì)LSIL 病例和ASCUS 病例的分流有重要的臨床價(jià)值。P16 上皮彌漫陽(yáng)性、Ki67 高表達(dá)提示為高級(jí)別鱗狀上皮內(nèi)病變或鱗癌，在宮頸病變的診斷中，在形態(tài)學(xué)的基礎(chǔ)上，輔以P16，Ki67 免疫組化標(biāo)記物檢測(cè)，幫助實(shí)現(xiàn)宮頸病變判讀、預(yù)測(cè)，促進(jìn)臨床醫(yī)師對(duì)患者合理分流、分層管理。