慢性HBV感染相關(guān)性肝癌發(fā)生的突變基因研究

何倩玉 李俊峰 毛小榮

一、前體蛋白

(一) preS1 慢性HBV感染是肝細(xì)胞癌(HCC)發(fā)生的主要原因。不同的preS/S突變體誘導(dǎo)不同的腫瘤發(fā)生機(jī)制，如轉(zhuǎn)錄因子的反激活和免疫炎癥反應(yīng)，從而導(dǎo)致HCC的發(fā)生。研究發(fā)現(xiàn)HBV病毒可刺激腫瘤干細(xì)胞(CSCs)相關(guān)標(biāo)記(CD133、CD117和CD90)和CSCs相關(guān)基因(Klf4、Sox2、Nanog、c-Myc和Oct4)的產(chǎn)生，并促進(jìn)人肝癌細(xì)胞CSCs的自我更新。HBV介導(dǎo)的CSCs生成需要HBV的PreS1蛋白。PreS1可激活正常肝細(xì)胞來(lái)源的細(xì)胞系(L02)和人肝癌細(xì)胞系(HepG2和Huh-7)中CD133、CD117和CD90的表達(dá)，促進(jìn)L02細(xì)胞更新，提高L02細(xì)胞和HepG2細(xì)胞誘導(dǎo)腫瘤的能力[1]。為了能更好地研究有關(guān)HCC肝臟疾病的進(jìn)展，研究者們建立了一個(gè)可以表達(dá)帶有W4P基因突變的完整HBV基因組的轉(zhuǎn)基因小鼠模型。結(jié)果顯示，攜帶W4P基因的雄鼠肝腫大更明顯，肝組織顆粒明顯增多，肝臟和血清HBsAg升高，血清ALT和IL-6也升高。表明preS1中的W4P突變基因可能導(dǎo)致男性HBV病毒復(fù)制增加和IL-6介導(dǎo)的炎癥增強(qiáng)，從而導(dǎo)致個(gè)人對(duì)HCC易感性存在性別差異[2]。另外，Pre-S1 A2962G/C2964A和Pre-S2 C105T突變體導(dǎo)致HBV cccDNA水平顯著升高，而A2962G/C2964A突變體與AFP水平升高相關(guān)[3]。還有研究發(fā)現(xiàn)，rtF221Y和sR122K與HBV相關(guān)HCC復(fù)發(fā)有關(guān)。特別是rtF221Y可以作為預(yù)測(cè)HCC預(yù)后的病毒標(biāo)志物。為了降低HBV DNA的復(fù)制，且預(yù)防耐藥，有必要及時(shí)、慎重地選擇核苷(酸)類似物(NAs)治療。這有助于降低HBV相關(guān)HCC患者的復(fù)發(fā)率和提高術(shù)后生存率[4]。因此，PreS1作為一種新的癌蛋白，在HCC發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用，這將有助于揭示HBV相關(guān)HCC的病毒學(xué)特征，實(shí)施更加個(gè)性化的臨床診療，并改善疾病預(yù)后。

(二)preS2 最近一項(xiàng)研究表明，HBsAg大表面蛋白(LHBs)通過(guò)誘導(dǎo)肝細(xì)胞DNA損傷和PLK1介導(dǎo)的G2/M檢查點(diǎn)失效，誘導(dǎo)細(xì)胞分裂失敗，進(jìn)而導(dǎo)致非整倍體形成，從而促進(jìn)HCC的發(fā)展。LHBs誘導(dǎo)的細(xì)胞分裂失敗可能是HCC發(fā)展的啟動(dòng)因素[5]。與HBsAg不同的是，PreS2中的大形態(tài)表面蛋白(LHBS)，其主要表達(dá)于HBV誘導(dǎo)的HCC腫瘤區(qū)域，提示其在腫瘤進(jìn)展中發(fā)揮獨(dú)特作用，血清中preS2突變體的相對(duì)水平于腫瘤分期是獨(dú)立因素，是原發(fā)性肝癌切除術(shù)后再次復(fù)發(fā)的重要高危標(biāo)志物[6]。人們還發(fā)現(xiàn)HBsAg的過(guò)度表達(dá)，包括大(LHBs)、中(MHBs)和小(SHBs)表面蛋白促進(jìn)了HCC細(xì)胞的增殖和腫瘤形成，同時(shí)敲除HCC細(xì)胞中的HBsAg可降低IL-6的生成，抑制信號(hào)轉(zhuǎn)換器和轉(zhuǎn)錄激活因子3 (STAT3)信號(hào)傳導(dǎo)，IL-6-STAT3通路可能與HBsAg介導(dǎo)的HBV相關(guān)性HCC的惡性程度相關(guān)[7]。甲胎蛋白(AFP)和Glypican 3 (GPC3)在HCC中均為癌基因并被重新激活。實(shí)驗(yàn)中，在preS2陽(yáng)性的HCC標(biāo)本中AFP及GPC3水平顯著高于preS2陰性的HCC標(biāo)本，而白蛋白水平無(wú)明顯差異。說(shuō)明preS2蛋白的表達(dá)與HCC標(biāo)志物AFP和GPC3密切相關(guān)[8]。HBV轉(zhuǎn)錄激活的FOXP3基因，編碼了preS2癌蛋白，進(jìn)而發(fā)生HCC；另外，ATAD2可能在HCC發(fā)生過(guò)程中發(fā)揮重要作用，并可能導(dǎo)致腫瘤的惡化。臨床上，ATAD2的檢測(cè)可作為肝臟活檢組織鑒別病變性質(zhì)的有價(jià)值的標(biāo)志物[9-10]。

二、HBV x基因(HBx) 特定基因的基因突變是致癌和肝細(xì)胞癌進(jìn)展的關(guān)鍵因素。然而，導(dǎo)致HCC發(fā)生、發(fā)展和生存預(yù)后的基因尚不清楚。大多數(shù)HCC患者的HBV整合于HBx區(qū)域，TERT啟動(dòng)子、TP53、CTNNB1、HBV整合等基因的改變與HCC的發(fā)展密切相關(guān)，TERT啟動(dòng)子的突變與不良預(yù)后相關(guān)[11]。研究發(fā)現(xiàn)，HCC患者中LINC00152基因的表達(dá)明顯高于癌旁非腫瘤組織，且與腫瘤大小、HBsAg及腫瘤數(shù)量呈正相關(guān)。體外實(shí)驗(yàn)中，在Huh-7和SM7721細(xì)胞中，HBx過(guò)表達(dá)后LINC00152基因上調(diào)，HBx沉默后表達(dá)下調(diào)。表明HBx增強(qiáng)了LINC00152的表達(dá)，抑制LINC00152基因點(diǎn)可以作為肝癌的治療靶點(diǎn)[12]。HBV x基因區(qū)域的T1753V突變、PC區(qū)域的G1896A突變以及前體蛋白的協(xié)同作用，可顯著增加C基因型CHB患者HCC的發(fā)生[13]。蛋白磷酸酶2A (PP2A)是一種由36 kD催化組成的三聚體蛋白質(zhì)磷酸酶亞基(PP2Ac)。PP2Ac的高表達(dá)與血清HBsAg及HBeAg、肝硬化、肝細(xì)胞癌中至差的分化程度、疾病晚期、肝內(nèi)轉(zhuǎn)移和早期復(fù)發(fā)相關(guān)。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)PP2Ac與HBx可直接相互作用。PP2Ac過(guò)表達(dá)可促進(jìn)HCC細(xì)胞增殖、集落形成和腫瘤發(fā)生。PP2Ac的上調(diào)對(duì)HCC患者的總預(yù)后生存期有較差的影響，并可增強(qiáng)病毒的侵襲性，PP2Ac可能是HCC潛在的治療靶點(diǎn)[14]。在HBV相關(guān)HCC組織和細(xì)胞中可檢測(cè)到MiR-520e和EPH受體A2 (EphA2)，MiR-520e上調(diào)，EphA2則下調(diào)。實(shí)驗(yàn)表明在HBV感染的HCC中，MiR-520e的過(guò)表達(dá)通過(guò)抑制EphA2，阻斷p38MAPK和ERK1/2信號(hào)通路，從而減少HBV復(fù)制，抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)[15]。

功能性LncRNA基因參與多種癌癥的發(fā)生。關(guān)于HBV相關(guān)性HCC的遺傳易感性，已經(jīng)進(jìn)行了一些全基因組關(guān)聯(lián)研究(GWAS)。多種單核苷酸多態(tài)性(SNPs)，如STAT4位點(diǎn)的rs7574865，HLA-DQ位點(diǎn)的rs9275319，8p12位點(diǎn)的rs12682266、rs7821974、rs2275959、rs1573266等，已被發(fā)現(xiàn)與HCC的發(fā)生有關(guān)[16]。研究選取的SNP中，rs12427129和rs3816153、rs2723175和rs2708973，可能在對(duì)HCC的易感性上發(fā)揮重要作用；rs2723176、rs2723175、rs2723186、rs364030、rs28947200、rs4392270 等與HBV的清除有相關(guān)性。尤其是rs4849133與HBV攜帶者和HBV相關(guān)性肝病進(jìn)展相關(guān)[17]。

三、HBV病毒

?；悄懰徕c的協(xié)同轉(zhuǎn)運(yùn)由SLC10A1編碼的多肽(NTCP)是近年來(lái)研究的熱點(diǎn)，認(rèn)為SLC10A1 (NTCP) S267F變異與肝硬化、HCC風(fēng)險(xiǎn)降低以及抗HBV感染有獨(dú)立相關(guān)性。研究中SLC10A1 (NTCP) S267F變異在排除性別、年齡、血清ALT和HBV DNA水平等重要危險(xiǎn)因素后，與肝硬化、肝硬化HCC和非肝硬化HCC具有顯著且獨(dú)立的相關(guān)性[18]。

DNA雙鏈斷裂(DSBs)是細(xì)胞失活最嚴(yán)重的機(jī)制之一，因?yàn)樗鼈兛梢宰钄嗉?xì)胞周期的進(jìn)展。DSBs可以發(fā)生在DNA復(fù)制過(guò)程中，也可以暴露于氧化應(yīng)激、化療或輻射之下。由于基因組不穩(wěn)定和染色體易位，DSBs的積累可導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。DSBs的修復(fù)經(jīng)過(guò)兩種細(xì)胞途徑，即非同源黏性末端連接(NHEJ)和同源基因重組(HR)。腫瘤表達(dá)的蛋白激酶催化亞基(DNA-PKcs),與肝癌患者的腫瘤進(jìn)展、HBsAg載量和術(shù)后預(yù)后相關(guān)[19]。

典型的核因子jB (NF-jB)信號(hào)通路在HCC發(fā)生、發(fā)展中的作用取決于肝損傷模式，在HBV驅(qū)動(dòng)的肝癌發(fā)生中，肝細(xì)胞中的NF-jB通過(guò)增強(qiáng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)而發(fā)揮重要的腫瘤抑制因子的作用[20]。

miRNAs 是一類約含 20～25 個(gè)核苷酸的非編碼RNA，它可以通過(guò)與靶基因非編碼區(qū)結(jié)合，從而影響基因的編碼和穩(wěn)定性。研究發(fā)現(xiàn)HBV感染合并肝癌患者肝臟中Let-7a水平明顯降低，與肝內(nèi)preS2 mRNA水平呈負(fù)相關(guān)。體內(nèi)外研究表明，HBV miRNA抑制let-7a靶點(diǎn)，可增強(qiáng)HCC細(xì)胞集落形成和腫瘤生長(zhǎng)，這為miRNA的致癌潛力提供了證據(jù)[21]。Let-7a miRNA可在各種癌癥中顯示下調(diào)。上調(diào)let-7a可減少HBV復(fù)制，并可預(yù)防HCC的發(fā)展，這一點(diǎn)可能是一種有效的治療HBV感染的方法[22]。除此之外，血清 miR-375 和 miR-146a 在診斷上的敏感性和特異性均優(yōu)于 CA19-9 和 AFP, miR-375 和miR-146a 可作為原發(fā)性肝癌,尤其是有HBV感染史患者原發(fā)性肝癌的診斷標(biāo)志物[23]。

四、宿主免疫功能

HBsAg-toll樣受體2(TLR2)通路對(duì)HBV相關(guān)HCC細(xì)胞生長(zhǎng)和侵襲的影響，與HepG2細(xì)胞相比，HepG2.2.15細(xì)胞中TLR2的mRNA和蛋白水平明顯升高。HBsAg增加了促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生和HepG2.2.15細(xì)胞的侵襲，而這一過(guò)程被TLR2所抑制。JS-K是一種釋放一氧化氮的重氮庚二酸鹽，對(duì)多種腫瘤有效，可抑制HepG2.2.15細(xì)胞生長(zhǎng)，抑制細(xì)胞集落形成和遷移，阻滯細(xì)胞在G2期聚集，其作用機(jī)制不僅與抑制HBsAg和HBeAg分泌有關(guān)，還與誘導(dǎo)DNA損傷和凋亡有關(guān)。所以JS-K是一種很有前景的治療HCC的候選藥物[24-25]。另一項(xiàng)研究表明，高表達(dá)的HBsAg增強(qiáng)了與膜聯(lián)蛋白II的相互作用。然而,膜聯(lián)蛋白II不是跨膜蛋白。因此,通過(guò)TLR4 / 88 (MyD88) /骨髓分化因素NF-κB軸實(shí)現(xiàn)，某些方面HBsAg/GDPI復(fù)合物的機(jī)制激活了NF -κB通路。我們發(fā)現(xiàn)通過(guò)TLR4 / MyD88 /IκBαaxis的通路，HBsAg /β2 GDPI才可激活NF -κB信號(hào)通路，在HCC形成中發(fā)揮著關(guān)鍵作用在[26]。上述研究表明，TLR信號(hào)通路與慢性HBV感染期間的炎癥和腫瘤進(jìn)展有關(guān)，并也可通過(guò)BMI1和DKK1促進(jìn)HBV相關(guān)HCC的進(jìn)展[27]。

五、其他突變基因及通路

最近的證據(jù)表明，TIP30可能參與了上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)的調(diào)控。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)顯示，HBV可能通過(guò)下調(diào)TIP30的表達(dá)來(lái)促進(jìn)HCC的進(jìn)展。TIP30在HCC中的下調(diào)可能是由HBV感染引起的，是影響HCC患者預(yù)后的獨(dú)立不良因素[28]。研究表明，CASP8-652 6N ins/del多態(tài)性可能是中國(guó)漢族人群HBV相關(guān)HCC的風(fēng)險(xiǎn)和預(yù)后生物標(biāo)志物，與HCC的發(fā)生、發(fā)展和預(yù)后生存中起著積極的作用[29]。有報(bào)道稱，HBV rtA181T/sW172*突變體的出現(xiàn)可導(dǎo)致HBsAg顯性分泌缺陷，增加HCC發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)。sW172*突變編碼可能增加HBV相關(guān)性腫瘤發(fā)生的可能性，其機(jī)制可能與TGF- TGF /Smad信號(hào)通路中TGFBI表達(dá)下調(diào)有關(guān)。然而HBV突變體編碼截?cái)嘈虷BsAg的確切生物學(xué)特性尚不清楚，截?cái)嘈虷BsAg增加HBV致瘤的確切機(jī)制尚需更多研究揭示[30]。

泛素-細(xì)胞色素c還原酶鉸鏈蛋白(UQCRH)由線粒體呼吸的細(xì)胞色素BC1復(fù)合物組成。UQCRH在腫瘤較大、分化較差的肝癌細(xì)胞中高度表達(dá)，或存在侵襲血管。UQCRH過(guò)表達(dá)與HCC患者預(yù)后不良相關(guān)。此外，在以AFP升高為主的高危分組的患者中，UQCRH無(wú)過(guò)表達(dá)可能是臨床治療的參考指標(biāo)[31]。

肝癌細(xì)胞中鋅指抗病毒蛋白(ZAP)，ZAP的表達(dá)與凋亡信號(hào)通路相關(guān)。在HCC中ZAP低表達(dá)較為常見(jiàn)，與HCC進(jìn)展及預(yù)后較差相關(guān)，在HCC的發(fā)生中起重要作用。還需要更多、更大樣本量的臨床研究來(lái)闡明HCC和ZAP表達(dá)之間的相關(guān)性，將ZAP確定為腫瘤抑制基因，并將其作為治療HCC的新靶點(diǎn)[32]。

HBV與肝癌的發(fā)生有密切的聯(lián)系，隨著分子生物學(xué)及細(xì)胞生物學(xué)等先進(jìn)技術(shù)的應(yīng)用，在HCC發(fā)病機(jī)制方面的研究取得了一定進(jìn)展,但缺乏突破性。以上研究對(duì)于進(jìn)一步理解HBV的腫瘤發(fā)生機(jī)制非常重要，這些結(jié)果對(duì)于理解肝癌發(fā)生、診斷和預(yù)測(cè)HCC患者預(yù)后的潛在機(jī)制非常有用，并將為預(yù)防HBV相關(guān)肝癌的發(fā)生及其進(jìn)展提供新的策略。