分子標記技術(shù)在藥用植物上的應(yīng)用現(xiàn)狀與金錢草的研究進展

鄭子洪， 周曼佳， 何祥玉， 羅佳雯， 程汝濱*

(1.浙江九龍山國家級自然保護區(qū)管理中心， 浙江 遂昌 323300； 2.浙江中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院， 浙江 杭州 310053)

藥用植物種質(zhì)資源是保障其可持續(xù)發(fā)展的核心，也是中醫(yī)藥發(fā)展的基礎(chǔ)，但是隨著社會需求的迅速增長，導(dǎo)致藥用植物資源過度消耗，同時市場上也存在許多混偽品摻雜的現(xiàn)象，嚴重影響藥用植物的臨床用藥效果。因此，尋找高效穩(wěn)定的方法，對藥用植物及其混偽品進行鑒別，以推動藥用植物的可持續(xù)發(fā)展需求迫切。分子標記技術(shù)作為一項速度快、特異性強和靈敏度高的技術(shù)，可快速準確地鑒別植物品種及促進其系統(tǒng)發(fā)育分析等方面的深入研究。ZHOU等[1]基于掌葉大黃、藥用大黃和唐古特大黃的葉綠體基因組開發(fā)出潛在DNA條形碼并成功驗證，為超級DNA條形碼在大黃中的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。植物葉綠體基因組全序列具有獨特的高度保守結(jié)構(gòu)，因其堿基替換率低、單親本遺傳特性使其在植物的系統(tǒng)分類、品種鑒定和系統(tǒng)發(fā)育分析中具有特殊的優(yōu)勢。CHEN等[2]研究表明，6種橐吾屬植物的全基因組可能成為有效鑒定其物種的超級條形碼。金錢草為植物過路黃的干燥全草，具有清熱解毒，利尿排石，活血散瘀之功效，可治療肝膽結(jié)石、膽囊炎和水腫等。目前，藥材市場上的藥材品種繁多，同名異物等現(xiàn)象導(dǎo)致其質(zhì)量不高，各物種原植物形態(tài)、藥材性狀方面極為相似，近緣混偽品較多、真?zhèn)坞y辨，造成藥材質(zhì)量不穩(wěn)定。為同類研究及臨床應(yīng)用提供依據(jù)，概述了DNA條形碼、限制性片段長度多態(tài)性(RFLP)和擴增片段長度多態(tài)性(AFLP)等方面概述了分子標記技術(shù)在藥用植物研究上的應(yīng)用及金錢草的地方習(xí)用品與市場混用品、化學(xué)成分和藥理作用等的研究進展，并展望了其未來的研究方向。

1分子標記技術(shù)在藥用植物上的應(yīng)用現(xiàn)狀

DNA分子標記具有分布范圍廣、標記數(shù)量多、性狀穩(wěn)定且選擇便利、操作簡單和檢測迅速等優(yōu)點，近年來已廣泛應(yīng)用于藥用植物的分析鑒定。目前，分子標記技術(shù)對藥用植物研究提供了技術(shù)保證，其種類已有10余種，如DNA條形碼、限制性片段長度多態(tài)性(RFLP)、擴增片段長度多態(tài)性(AFLP)、單核苷酸多態(tài)性(SNP)和簡單重復(fù)序列(SSR)等，給藥用植物研究提供技術(shù)保證。而葉綠體基因序列具有獨特的高度保守結(jié)構(gòu)，比傳統(tǒng)的DNA條形碼具有更強的分辨力和更好的通用性，具備成為物種鑒定超級條形碼的潛力。

1.1DNA條形碼

DNA條形碼(DNA barcoding)是通過利用一段短的、較保守的標準DNA序列進行物種鑒定的分子技術(shù)，其優(yōu)點是操作簡單、能快速準確鑒別大量樣本、結(jié)果不受外界環(huán)境影響等，實現(xiàn)藥用植物的快速準確鑒定，推動了DNA條形碼技術(shù)在藥用植物方面的應(yīng)用，是藥用植物分子鑒定方法上的重大創(chuàng)新[3]。近年來，DNA條形碼技術(shù)在藥用植物各方面的應(yīng)用越來越廣泛。INTHARUKSA等[4]研究發(fā)現(xiàn)，條形碼基因rbcL、ITS、ITS1和ITS2與psbA-trnH的組合可以準確區(qū)分不同的訶子屬藥用植物，且ITS2與psbA-trnH的DNA條形碼組合鑒別效果最好。張宏意等[5]研究發(fā)現(xiàn)，psbA-trnH序列分析可從分子水平上對德慶道地種源何首烏與其他種源何首烏進行有效鑒定和區(qū)分。JIN等[6]對400種蘭科植物DNA序列分析并結(jié)合聚類分析結(jié)果表明， rbcL可單獨或結(jié)合其他基因片段用于蘭科植物的遺傳多樣性研究，且蘭科植物的遺傳多樣性豐富。

1.2限制性片段長度多態(tài)性(RFLP)

限制性片段長度多態(tài)性(Restriction Fragment Length Polymorphism, RFLP)是一種以DNA-DNA雜交為基礎(chǔ)的第一代遺傳標記。該技術(shù)由于等位基因呈共顯性，且標記數(shù)量多和穩(wěn)定性高，已廣泛應(yīng)用于藥用植物鑒定和親緣關(guān)系分析等。梁晉軍等[7]對柿及其親緣植物關(guān)系分析發(fā)現(xiàn)，柿與金棗柿的親緣關(guān)系最緣，與美洲柿和烏柿的親緣關(guān)系較遠。SHI等[8]基于105種白頭翁屬植物和其常見摻假物的植物樣品，建立ITS2條碼庫，并開發(fā)出快速特異性PCR-RFLP鑒定檢測方法，為快速鑒別市售白頭翁產(chǎn)品提供技術(shù)支撐，有助于保證其中藥產(chǎn)品的安全使用。

1.3擴增片段長度多態(tài)性(AFLP)

擴增片段長度多態(tài)性(Amplified Fragment Length Polymorphism, AFLP)是RFLP和PCR技術(shù)相結(jié)合的產(chǎn)物，其特點是在知道DNA信息的條件下，專用引物能準確地對酶切片段進行PCR擴增，AFLP具有分辨率高、穩(wěn)定性好且靈敏度高的優(yōu)點可用于亞種分化和種間關(guān)系的研究。劉曉瑩等[9]對212個廣藿香樣本進行AFLP分析顯示，廣藿香種間具有較為豐富的遺傳多樣性，種內(nèi)遺傳多樣性相對較小，種間遺傳分化顯著，可為廣藿香優(yōu)良種質(zhì)的篩選等研究提供參考依據(jù)。蘇增一等[10]對不同產(chǎn)地益智樣本進行AFLP-PCR擴增，篩選出4對適合于益智AFLP分析的引物，且E3/M7引物組合效果最佳，能夠鑒定不同產(chǎn)地益智的種質(zhì)資源。

1.4單核苷酸多態(tài)性(SNP)

單核苷酸多態(tài)性(Single nucleotide polymorphism, SNP)主要指在基因組水平上由單個核苷酸的變異所引起的DNA序列多態(tài)性，這是一種檢測遺傳多樣性和保護育種者權(quán)利的有用的基因分型工具，可用于藥用植物的道地性評價，有望成為最有效的分子標記技術(shù)。喬東亞等[11]以85份紫薇種質(zhì)為樣本材料進行簡化基因組測序，篩選出高質(zhì)量的SNP標記，獲得SNP分型數(shù)據(jù)，紫薇種質(zhì)資源遺傳多樣性豐富，不同類群間存在較高的基因流。WANG等[12]通過檢測的單核苷酸多態(tài)性(SNP)位點設(shè)計2個經(jīng)過修飾的特異性引物，用于陳皮和果皮的多重等位基因特異PCR系統(tǒng)鑒定。SNP分析在藥用植物物種鑒定，道地性和遺傳多樣性研究等方面的應(yīng)用前景廣闊。

1.5簡單重復(fù)序列(SSR)

簡單重復(fù)序列(Simple sequence repeat, SSR)又稱微衛(wèi)星標記，是指基因組中由1～6個核苷酸為基本單位，經(jīng)重復(fù)串聯(lián)多次構(gòu)成一段DNA重復(fù)序列。其優(yōu)點是數(shù)量多，重復(fù)性、信息量和多態(tài)性高。因而SSR通常應(yīng)用于分子指紋圖譜構(gòu)建、物種品種鑒定和分子輔助育種等。劉亞令等[13]對380個黃芪樣本進行SSR遺傳多樣性及結(jié)構(gòu)分析顯示，藥用黃芪具有較高程度的遺傳多樣性水平，且2種黃芪的遺傳變異主要發(fā)生在居群內(nèi)部，為藥用黃芪種質(zhì)資源的有效利用、遺傳多樣性保護、育種及開發(fā)優(yōu)質(zhì)黃芪種質(zhì)資源提供一定的理論基礎(chǔ)。LU等[14]利用EST-SSR和SRAP技術(shù)構(gòu)建鐵皮石斛和杜仲雜種圖譜，為遺傳學(xué)研究提供了基礎(chǔ)，并有助于石斛品種育種計劃中醫(yī)學(xué)性狀的定位和標記輔助選擇研究?；赟SR分子標記構(gòu)建的指紋圖譜及遺傳多樣性研究，可為藥用植物種質(zhì)資源的深入研究奠定基礎(chǔ)。

1.6葉綠體全序列分析

葉綠體基因組是葉綠體內(nèi)相對獨立的遺傳物質(zhì)，由于其高度保守性、進化速率較慢的特性，使其成為不同物種間的分類鑒定研究的重要工具，為后期藥用植物新條形碼的開發(fā)提供了條件。近期有研究發(fā)現(xiàn)，葉綠體在藥用植物方面的應(yīng)用有道地性遺傳研究、物種鑒定以及系統(tǒng)發(fā)育等，也可用于篩選出高變區(qū)作為潛在的分子標記。姜丹[15]研究表明，在不同地區(qū)黃芩中，黃芩道地產(chǎn)區(qū)的遺傳多樣性高于非道地產(chǎn)區(qū)，且道地產(chǎn)區(qū)是黃芩的遺傳多樣性中心，可對黃芩及其他道地藥材的可持續(xù)利用提供依據(jù)。張明英等[16]比對分析了10種柴胡屬葉綠體基因組結(jié)果表明，葉綠體全基因組可準確鑒定柴胡屬植物。CHEN等[17]基于16種葉綠體基因組構(gòu)建的ML和MP進化樹，可有效鑒別3種麻黃屬植物，表明葉綠體基因組具有成為物種鑒定超級條形碼的潛力；同時發(fā)現(xiàn)，麻黃屬植物與買麻藤屬植物、百歲蘭具有更近的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系。TAN等[18]從皂莢和山皂莢的130個基因中鑒定出SSC區(qū)域的ycf1b核苷酸變異性最高，明顯高于植物通用標記區(qū)域rbcL、ndhF、rpl16、trnL-trnF、trnL intron、psbA-trnH和matK，揭示ycf1b作為DNA條形碼候選區(qū)域的潛能。利用葉綠體基因組以開發(fā)新的DNA條形碼，可提高金錢草及其他藥用植物質(zhì)量鑒定的有效性和準確性，可促進其系統(tǒng)發(fā)育及道地性研究。

分子標記技術(shù)的快速發(fā)展和葉綠體全序列的深入研究，對于藥用植物資源的研究影響較大。除前述幾種常見標記技術(shù)外，還有RAPD、ISSR、SRAP、CAPS和STS等分子標記技術(shù)也在藥用植物各方面的研究中具有重要的技術(shù)支撐作用。分子標記間各有優(yōu)勢與不足，與AFLP、RAPD等技術(shù)相比，SSR和ISSR具有多態(tài)性更高更豐富，表明單一的某種標記技術(shù)在藥用植物研究領(lǐng)域的局限性。多種技術(shù)的結(jié)合產(chǎn)生的新的標記技術(shù)使得藥用植物資源研究更加準確和全面，分子鑒定在理論和方法上日趨成熟。

2金錢草的研究

正品金錢草藥材為報春花科珍珠菜屬植物過路黃(LysimachiachristinaeHance)的干燥全草，又名大金錢草、對座草、路邊黃和遍地黃等，味苦，酸，微寒。具有清熱解毒、利尿排石和活血散淤等功能。近年來，中藥材市場銷售及臨床應(yīng)用上經(jīng)常發(fā)現(xiàn)金錢草地方習(xí)用品和混用品被當作金錢草正品藥材使用，造成金錢草質(zhì)量和安全性得不到保障，給臨床應(yīng)用造成安全隱患，降低其治療效果。

2.1地方習(xí)用品與市場混用品

全國各地金錢草地方習(xí)用品和市場混用品眾多，因此識別主要地方金錢草習(xí)用品和混用品，才能正確區(qū)分鑒別正品金錢草。在市場上除金錢草正品外，其地方習(xí)用品和混用品眾多，據(jù)不完全統(tǒng)計，目前至少有7科14種植物被作為金錢草在各地使用，常見的地方習(xí)用品和混用品包括點腺過路黃、天胡荽、活血丹、廣金錢草、馬蹄金和積雪草。近年研究發(fā)現(xiàn)，其同屬植物聚花過路黃和巴東過路黃等也作為金錢草偽品在市場上流通。

點腺過路黃為報春花科植物點腺過路黃的全草，因其性味歸經(jīng)和功能主治與正品金錢草相似，在浙江地區(qū)作金錢草使用。天胡荽及其變種白毛天胡荽，為傘形科植物天胡荽的全草，又稱破銅錢，在江西地區(qū)被當作金錢草使用，功效更偏向治痢疾，利水作用強，可治目翳。活血丹為唇形科植物活血丹的干燥地上部分，又稱大葉金錢草和連錢草，在上海和江蘇地區(qū)作為金錢草地方習(xí)用品。這是因為其生境與藥效與過路黃相似，也常生于路邊荒地濕氣大的地方，可利水通淋治結(jié)石。廣金錢草是豆科植物，其地上部分在湖南及兩廣地區(qū)作為金錢草混用品使用，其在治療泌尿系統(tǒng)結(jié)石方面效果更佳。馬蹄金為旋花科植物馬蹄金的全草，又稱小金錢草，在永州地區(qū)作金錢草混用品使用，其功效與金錢草的最大差別是馬蹄金對結(jié)石無治療作用。積雪草為傘形科植物積雪草的全草，在湖南永順地區(qū)為金錢草混用品，與金錢草相比，積雪草在清熱解毒方面效果更好。聚花過路黃和巴東過路黃與金錢草來源于同科同屬，是金錢草的混偽品，因其形態(tài)相似，在四川地區(qū)易被當作金錢草使用。金錢草習(xí)用品和混用品與金錢草正品存在較多方面的不同，兩者混淆使用會對金錢草的臨床應(yīng)用造成隱患。因此，迫切需要尋找快速鑒別不同地區(qū)金錢草習(xí)用品和混用品的方法。

2.2化學(xué)成分

金錢草的功效與其化學(xué)成分組成相關(guān)，金錢草的初步分析得出其含有酚類、黃酮類、甙類、鞣質(zhì)、揮發(fā)油、氨基酸、膽堿、甾醇、氯化鉀和內(nèi)脂類等成分，其中黃酮類化合物研究較為深入[19]。沈聯(lián)德等[20]從金錢草分離得到六個黃酮類化合物，此外，還分離出兩種無機鹽結(jié)晶，檢驗出其中具有硝酸鹽的存在。趙世萍[21]等還分離出尿嘧啶和對羥基苯甲酸。侯冬巖[22]等用水蒸氣-萃取法提取金錢草揮發(fā)性成分發(fā)現(xiàn)主要為樟腦、山奈酚和石竹烯醇等。

2.3藥理作用

金錢草的藥理作用廣泛，具有利尿通淋、除濕退黃等功效，其對治療肝膽結(jié)石效果顯著，是治結(jié)石之要藥。YANG等[23]研究發(fā)現(xiàn)，金錢草提取物體內(nèi)具有明顯的抗膽囊炎和利膽活性。金錢草還具有利尿[24]和鎮(zhèn)痛[25]作用。王萍等[26]采用體外模擬的技術(shù)，使用 SEM，F(xiàn)T-IR和 XRD等檢測方法對提取的晶體研究發(fā)現(xiàn)，金錢草具有排石作用。此外，金錢草還具有抗氧化和抗菌等藥理活性[27]。金錢草藥理作用的深入研究，不僅有利于金錢草的臨床治療應(yīng)用，還為金錢草藥品開發(fā)方向和提高利用效率提供科學(xué)依據(jù)。

2.4臨床應(yīng)用

金錢草在中醫(yī)臨床上應(yīng)用廣泛，常用于治療結(jié)石、黃疸型肝炎、慢性前列腺炎、尿潴留和慢性膽囊炎等[28]。據(jù)文獻記載，諸多排石中藥配方中金錢草均為君藥，是治療結(jié)石(膀胱結(jié)石、膽囊結(jié)石等)的有效中草藥。齊鵬[29]研究表明，以金錢草為主藥，對急性黃疸型肝炎、慢性前列腺炎、慢性膽囊炎和尿潴留4種病癥進行治療，其治愈率高。金錢草臨床應(yīng)用范圍極廣，藥用價值極高，具有安全性高、價格實惠、資源豐富等特點，應(yīng)當加強對金錢草臨床應(yīng)用的研究，充分發(fā)揮其醫(yī)療功效。

2.5產(chǎn)品開發(fā)

金錢草藥品因其良好功效在市場上銷售應(yīng)用廣泛，據(jù)統(tǒng)計，約有99種中成藥中使用金錢草。此外，為提高金錢草的臨床治療效果，有以金錢草藥劑配伍其他中成藥的治療效果良好。其中，中成藥中藥金錢草沖劑具有清熱解毒和利尿排石作用，既可清熱利濕，又可解毒通淋，同時可減少晶體形成，對于膀胱濕熱、尿路感染、尿路結(jié)石和腎絞痛等有良好的輔助治療作用。復(fù)方金錢草顆粒具有清熱祛濕，利尿排石，消炎止痛，用于治療泌尿系統(tǒng)結(jié)石和尿路感染等[30]。氧氟沙星與金錢草沖劑聯(lián)合治療尿路感染和復(fù)雜性尿路感染，可顯著提高治療的有效率[31]。清熱利膽片組方中的金錢草具有清熱利膽功效，適用于急性單純性膽囊炎、輕度化膿性膽囊炎、急性膽源性胰腺炎、膽管炎和膽道術(shù)后綜合征等[32]。金錢草開發(fā)應(yīng)用較廣，其制成的中成藥較多，市場銷售量大，是良好的中成藥制備藥材，但由于其習(xí)用品和混用品的存在藥品質(zhì)量降低，應(yīng)探究其更好的鑒別技術(shù)，以提高金錢草藥品在臨床上的應(yīng)用效果。

3展望

分子標記技術(shù)和葉綠體全序列在現(xiàn)代藥用植物種質(zhì)資源與道地性評價、親緣關(guān)系分析與正偽品鑒定等領(lǐng)域應(yīng)用廣泛，有利于促進中醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。但是，多數(shù)分子標記方法耗時耗力，不利于推廣和實際應(yīng)用，且在DNA的研究中，使用的基因片段多為ITS、matK、rbcL和psbA-trnH等，對其新型片段的開發(fā)應(yīng)用較少，仍無法對部分疑難物種進行鑒別[33]。因此，后續(xù)研究應(yīng)建立省時省力、節(jié)約成本的分子標記技術(shù)，同時更加注重特異性強的位點或片段，以開發(fā)出新型片段。同時，金錢草藥用價值高，但其市售質(zhì)量參差不齊，且金錢草及其習(xí)用品和混偽品的臨床應(yīng)用存在差異，濫用可能會造成不良影響，其常見鑒別方式有性狀鑒別、顯微和薄層色譜，但易受技術(shù)及條件等的影響，鑒別效率不高。因此，亟待探尋高效準確的方法對金錢草及其習(xí)用品和混用品的質(zhì)量進行鑒別。以期分子標記技術(shù)結(jié)合葉綠體全序列分析技術(shù)能夠探尋出金錢草的特征性DNA片段，利用其對金錢草及其混偽品進行快速區(qū)分，提高鑒定準確性，為臨床用藥和后續(xù)應(yīng)用提供指導(dǎo)。