聚γ-谷氨酸分子結(jié)構(gòu)變化在氯化鉀降低發(fā)酵液黏度中的作用

李凌甫，蔣 莉，劉 瑤，丁 蘇，陳桂光，梁智群，曾 偉

（廣西大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，亞熱帶農(nóng)業(yè)生物資源保護與利用國家重點實驗室，廣西微生物與酶工程技術(shù)研究中心，廣西 南寧 530004）

聚γ-谷氨酸（poly-γ-glutamic acid，PGA）是一種由D-谷氨酸和（或）L-谷氨酸通過α-氨基和γ-羧基以酰胺鍵鏈接而成的陰離子型高分子聚合物[1]。PGA特殊的聚酰胺結(jié)構(gòu)和主鏈上大量的游離羧基賦予其獨特的生化特性，如水溶性、可降解性、無毒、無免疫原性及羧基可作為活性位點進行修飾等性質(zhì)[2]。因此，PGA及其衍生物被廣泛用于食品、化妝品、醫(yī)藥和農(nóng)業(yè)等領(lǐng)域[3]。在食品領(lǐng)域，PGA可以作為冷凍保護劑、增稠劑、祛苦劑等[4]。例如，白登榮等[5]利用PGA改善雞肉糜凝膠的性質(zhì)；李天密等[6]利用PGA改善殼聚糖/姜黃素可食性復(fù)合膜的厚度和水溶性。

PGA生產(chǎn)方法有化學(xué)合成法和微生物發(fā)酵法，其中化學(xué)合成法存在合成路線長、副產(chǎn)物多、收率低、產(chǎn)物分子質(zhì)量低等問題，而微生物發(fā)酵法生產(chǎn)過程易控、周期短、產(chǎn)率高、產(chǎn)量穩(wěn)定、后處理工藝簡單、便于大規(guī)模生產(chǎn)，因此PGA生產(chǎn)主要利用微生物發(fā)酵法。微生物發(fā)酵生產(chǎn)PGA的主要菌株為谷氨酸依賴型的芽孢桿菌屬細菌，采用合成培養(yǎng)基，其中碳氮源和谷氨酸是必需組分，起始pH值一般維持在6.5～7.5之間，溫度30～40 ℃，發(fā)酵周期36～96 h，PGA產(chǎn)量與適宜的碳氮比、底物添加量和無機鹽密切相關(guān)[7]。采用補料分批發(fā)酵工藝，PGA發(fā)酵產(chǎn)量較高的可達30～50 g/L[8]。但在發(fā)酵過程中由于PGA的高分子和聚電解質(zhì)特性會引起發(fā)酵液黏度增大，尤其是在發(fā)酵后期，底物、溶氧和熱量的傳遞受到嚴(yán)重限制，從而制約了PGA產(chǎn)量和底物轉(zhuǎn)化率的進一步提高[1]。本課題組前期發(fā)現(xiàn)KCl對PGA發(fā)酵液黏度具有顯著調(diào)節(jié)作用，當(dāng)添加15 g/L KCl至培養(yǎng)基時，盡管菌體生長受到一定抑制，但發(fā)酵液黏度顯著降低了82.6%，PGA產(chǎn)量提高了39.5%[9]。

PGA分子結(jié)構(gòu)（分子質(zhì)量、立體構(gòu)型和構(gòu)象）與其水溶液的黏度極具相關(guān)性，且隨環(huán)境因素如溫度、溶液pH值、離子強度、PGA質(zhì)量濃度等變化而變化，表現(xiàn)出結(jié)構(gòu)多樣性[10]。推測PGA分子結(jié)構(gòu)的變化在KCl降低PGA發(fā)酵液黏度的過程中可能起重要作用。因此，KCl對PGA分子結(jié)構(gòu)的影響值得深入探究。本實驗利用1 株谷氨酸依賴型菌株枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）GXA-28為研究對象，通過在其發(fā)酵培養(yǎng)基中添加15 g/L KCl研究該菌株合成的PGA分子結(jié)構(gòu)變化情況及其對發(fā)酵液黏度的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

實驗所用菌株為本實驗室自主篩選的B.subtilisGXA-28，菌株保藏編號CCTCC M 2012347。

葡萄糖、KH2PO4、MgSO4·7H2O、KCl 天津博迪化工有限公司；酵母膏 京奧博星生物技術(shù)有限公司；谷氨酸鈉 廣西南寧荷花味精有限公司；聚環(huán)氧乙烷日本TOSOH公司；無水乙醇 西隴化工有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

LC-20AT高效液相色譜系統(tǒng)（配有示差檢測器和二極管陣列檢測器） 日本Shimadzu公司；NicoletiS10傅里葉變換紅外光譜儀 美國Thermo Fisher Scientific公司；STA449F3同步熱分析儀 德國Netzsch公司；MOS-450圓二色譜儀 法國Bio-Logic公司；LSI-3DLS激光光散射儀 瑞士Lsinstruments公司；冷凍干燥儀 美國Labconco公司；R/S-CC旋轉(zhuǎn)流變儀 德國Brookfield公司。

1.3 方法

1.3.1 培養(yǎng)基和培養(yǎng)方法

1.3.1.1 培養(yǎng)基

種子培養(yǎng)基：葡萄糖10 g/L，酵母膏5 g/L，谷氨酸鈉5 g/L，KH2PO40.5 g/L，MgSO4·7H2O 0.1 g/L，pH 7.2±0.1；115 ℃滅菌30 min。

發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖20 g/L，酵母膏2.5 g/L，谷氨酸鈉20 g/L，KH2PO40.5 g/L，MgSO4·7H2O 0.1 g/L，pH 7.2±0.1；115 ℃滅菌30 min。對照組發(fā)酵培養(yǎng)基不添加KCl，實驗組發(fā)酵培養(yǎng)基加入15 g/L KCl。

1.3.1.2 培養(yǎng)方法

種子培養(yǎng)：吸取1.5 mL保藏于-20 ℃的甘油菌種，接種于裝有30 mL種子培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，200 r/min、45 ℃恒溫振蕩培養(yǎng)8 h。

發(fā)酵培養(yǎng)：按2%（V/V）接種量將種子液接種于裝有50 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，200 r/min、45 ℃恒溫振蕩培養(yǎng)24 h。

1.3.2 PGA純化

發(fā)酵液經(jīng)去離子水稀釋5 倍后，4 ℃、13 400×g離心20 min除去菌體，上清液與4 倍體積無水乙醇混合，9 000×g離心5 min收集沉淀，真空干燥；再加入適當(dāng)體積去離子水復(fù)溶，13 400×g離心10 min除去不溶物；用截留分子質(zhì)量10 kDa的透析袋，4 ℃過夜透析，真空冷凍干燥即得純化樣品，純化樣品溶于去離子水中pH值為7.0[11]。

1.3.3 分子質(zhì)量分析

取PGA純化樣品（10 mg，干質(zhì)量）溶于10 mL去離子水中，4 ℃、13 400×g離心10 min去除不溶物，經(jīng)0.45 μm濾膜過濾備用。采用LC-20AT高效液相色譜系統(tǒng)分析PGA分子質(zhì)量：色譜柱為TSK-GELG6000PWXLColumn（7.8 mm×300 mm，5 μm），流動相為去離子水，流速1.0 mL/min，柱溫30 ℃，進樣量20 μL，示差檢測器。用聚環(huán)氧乙烷作分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)曲線[12]。

1.3.4D/L-谷氨酸比例分析

取PGA純化樣品（500 mg，干質(zhì)量）于水解管中，加入10 mL 6 mol/L HCl溶液，抽真空，105 ℃酸解8 h。冷卻后，用6 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)pH 7.0，定容至100 mL，經(jīng)0.45 μm濾膜過濾備用。采用LC-20AT高效液相色譜系統(tǒng)分析PGA的D/L-谷氨酸組成：色譜柱為CHIRALPAK MA（+），流動相為2 mmol/L CuSO4溶液，流速0.5 mL/min，柱溫25 ℃，進樣量10 μL，二極管陣列檢測器[13]。

1.3.5 靜態(tài)光散射分析

將PGA純化樣品溶解于經(jīng)0.22 μm膜過濾的去離子水中，PGA質(zhì)量濃度范圍為1～10-6g/L，靜置6 h備用。使用LSI-3DLS激光光散射儀進行靜態(tài)光散射分析。該儀器裝備22 mW He-Ne激光光源，測試波長632.8 nm，測試角度范圍30°～120°，間隔為15°，每個角度重復(fù)測量4 次，測試溫度25 ℃。重均分子質(zhì)量、旋轉(zhuǎn)半徑和第二維利系數(shù)由Zimm plot軟件計算得到[14]。

1.3.6 圓二色譜分析

采用圓二色譜通過監(jiān)測酰胺鍵發(fā)生電子躍遷的紫外區(qū)域（180～250 nm）進行二級結(jié)構(gòu)分析。取PGA純化樣品溶解于去離子水中作為待測樣品，PGA質(zhì)量濃度為1 g/L，0.22 μm膜過濾，pH 7.0。使用MOS-450圓二色譜儀進行分析，掃描范圍190～250 nm，石英比色皿寬1 mm，溫度45 ℃。圓二色譜圖用去卷積軟件CDNN2.1進行二級結(jié)構(gòu)分析[15]。

1.3.7 紅外光譜分析

紅外光譜分析PGA分子構(gòu)象。取PGA純化樣品與干燥KBr粉末（質(zhì)量比1∶100）混合后，研磨壓片，利用NicoletiS10傅里葉變換紅外光譜儀在4 000～400 cm-1范圍內(nèi)掃描分析PGA，掃描次數(shù)32 次[16]。

1.3.8 差示掃描量熱和熱重分析

PGA的熔點和熱降解溫度由STA449F3同步熱分析儀分析。PGA純化樣品放置于氧化鋁坩堝上，升溫速率10 ℃/min，溫度范圍25～800 ℃，氮氣速率20 mL/min。熔點選取吸熱峰峰值[14]。

1.3.9 PGA溶液剪切黏度分析

將PGA純化樣品完全溶解于去離子水中，PGA質(zhì)量濃度為0.5 g/100 mL，測定溫度為25 ℃，利用R/S-CC旋轉(zhuǎn)流變儀測定靜置0 h和6 h后的PGA水溶液的剪切黏度，剪切速率范圍為3～35 s-1[16]。

2 結(jié)果與分析

2.1 PGA分子質(zhì)量分析

如表1所示，當(dāng)培養(yǎng)基中KCl添加量從0 g/L增加至15 g/L時，B.subtilisGXA-28合成PGA的重均分子質(zhì)量和數(shù)均分子質(zhì)量均有所降低，其中重均分子質(zhì)量從（3 590±10）kDa下降至（3 090±10）kDa，數(shù)均分子質(zhì)量從（1 620±26）kDa下降至（1 210±40）kDa，但多聚分散性從2.22提高至2.55。多聚分散性的提高是因為在添加15 g/L KCl培養(yǎng)基中小分子質(zhì)量的PGA數(shù)量增加。在培養(yǎng)基中添加外源物質(zhì)調(diào)控PGA分子質(zhì)量的現(xiàn)象在其他菌株中也有類似報道，當(dāng)培養(yǎng)基中FeCl3質(zhì)量濃度從0 g/L增加至1.2 g/L時，Bacillus licheniformisATCC 9945a合成的PGA分子質(zhì)量從（1 310±140）kDa下降至（318±30）kDa[17]。PGA分子質(zhì)量對其黏度有重要作用，分子質(zhì)量越大則黏度越高[13,18-19]。但是，在本實驗中PGA分子質(zhì)量僅下降13.9%，在PGA產(chǎn)量提高39.5%的情況下，發(fā)酵液黏度卻降低了82.6%，說明PGA分子質(zhì)量降低只是引起發(fā)酵液黏度下降的一個原因。

表1 KCl對PGA分子質(zhì)量的影響Table 1 Effect of KCl on the molecular mass of PGA

2.2 PGA分子中D/L-谷氨酸比例分析

如表2所示，當(dāng)培養(yǎng)基中KCl添加量從0 g/L增加至15 g/L，PGA分子中D-谷氨酸比例從（47.66±0.10）%提高至（53.77±0.02）%，L-谷氨酸比例從（52.34±0.10）%下降至（46.23±0.03）%。除了K+之外，Mn2+已經(jīng)在B.subtilisNX-2、B.licheniformisATCC 9945a、B.licheniformisWBL-3等多株細菌中被證明能夠有效地改變PGA中D/L-谷氨酸的比例[20-22]。PGA分子中D/L-谷氨酸比例會影響其性質(zhì)[23]。例如，PGA分子中只含有D-谷氨酸或L-谷氨酸時可溶于乙醇，但當(dāng)含有相同含量D-谷氨酸和L-谷氨酸時則不溶于乙醇[24]。此外，PGA分子中D/L-谷氨酸比例還會導(dǎo)致其在構(gòu)象上存在差異[10]。所以，D-谷氨酸比例的提高會引起PGA性質(zhì)和構(gòu)象的變化，而這些變化可能與PGA溶液黏度有關(guān)，但仍需進一步驗證。

表2 KCl對PGA分子中D/L-谷氨酸比例的影響Table 2 Effect of KCl on the D/L-glutamate ratio of PGA

2.3 靜態(tài)光散射分析

如表3所示，經(jīng)過6 h靜置后，不同KCl質(zhì)量濃度下合成的PGA重均分子質(zhì)量差別顯著，并且遠大于2.1節(jié)中分子質(zhì)量。當(dāng)培養(yǎng)基中KCl質(zhì)量濃度從0 g/L增加至15 g/L時，在水溶液中的PGA重均分子質(zhì)量從1.40×104kDa提高至5.22×107kDa。這是由于PGA分子會通過分子間相互作用使分子鏈糾纏形成聚集態(tài)、超螺旋和超折疊結(jié)構(gòu)導(dǎo)致分子質(zhì)量增加[16]。在相同PGA質(zhì)量濃度下，聚集態(tài)、超螺旋和超折疊結(jié)構(gòu)的PGA溶液黏度低于正常狀態(tài)下的PGA黏度[25]。大幅提高的分子質(zhì)量表明KCl的添加使B.subtilisGXA-28合成的PGA分子更容易形成聚集態(tài)[16]。這表明在培養(yǎng)基中添加15 g/L KCl合成的PGA水溶液黏度會更低。

表3 KCl對PGA在水溶液中分子質(zhì)量、旋轉(zhuǎn)半徑和第二維利系數(shù)的影響Table 3 Effect of KCl on the molecular mass, gyration radius and second virial coefficient of PGA in aqueous solution

不同KCl質(zhì)量濃度下合成的PGA旋轉(zhuǎn)半徑也存在差別。未添加KCl時，PGA旋轉(zhuǎn)半徑為69.52 μm，而添加15 g/L KCl時PGA旋轉(zhuǎn)半徑增加至80.72 μm。旋轉(zhuǎn)半徑的增加遠小于分子質(zhì)量的增加，由此推測15 g/L KCl下合成的PGA在水溶液中可能形成了更加緊密的結(jié)構(gòu)。無論添加KCl與否，PGA第二維利系數(shù)均為正數(shù)，說明B.subtilisGXA-28合成的PGA具有良好的水溶性。此外，添加15 g/L KCl合成的PGA的第二維利系數(shù)是未添加KCl的3 倍，這說明添加15 g/L KCl合成的PGA與水分子之間的分子作用更強。

2.4 紅外光譜分析

如圖1所示，不同KCl質(zhì)量濃度下合成的PGA均在3 300～3 400 cm-1處有一個寬峰。未添加KCl時寬峰較為尖銳且特征峰的波數(shù)為3 374 cm-1；添加15 g/L KCl時特征峰峰形平緩寬大，特征峰波數(shù)3 314～3 374 cm-1。上述寬峰是由酰胺鍵中—NH基團振動伸縮引起的，寬峰中波數(shù)大（一般大于3 350 cm-1）的特征峰是非氫鍵酰胺—NH基團引起的，而波數(shù)?。ㄒ话阈∮? 350 cm-1）的峰則是氫鍵酰胺—NH基團，當(dāng)兩種—NH基團共存時特征峰會重疊而形成寬峰[26]。由此可知，培養(yǎng)基中未添加KCl時合成的PGA分子中以非氫鍵酰胺—NH基團為主；培養(yǎng)基中添加15 g/L KCl時，PGA分子內(nèi)同時存在非氫鍵酰胺—NH和氫鍵酰胺—NH基團。這表明KCl的添加使PGA分子內(nèi)氫鍵增強。PGA分子內(nèi)氫鍵的強弱決定了PGA的構(gòu)象，分子內(nèi)氫鍵較強時PGA構(gòu)象呈α-螺旋。因此，KCl的添加有可能使PGA構(gòu)象發(fā)生了變化。

圖1 不同KCl質(zhì)量濃度下合成的PGA紅外光譜圖Fig.1 FTIR spectra of PGA synthesized with different KCl concentrations

不同KCl質(zhì)量濃度下合成的PGA分子在1 592 cm-1和1 420 cm-1處均有很強的振動峰，這兩個峰是—COOH基團去質(zhì)子化后形成的—COO—引起的，1 592 cm-1處為不對稱拉伸峰，而1 420 cm-1為對稱拉伸峰。這與PGA分子在偏中性和堿性條件下在1 590 cm-1和1 410 cm-1處出現(xiàn)特征峰[27]基本一致。此外，KCl的添加使PGA分子在1 629 cm-1處的特征峰移動到了1 635 cm-1。1 630～1 650 cm-1處的特征峰通常用于分析二級結(jié)構(gòu)（α-螺旋、β-折疊和無規(guī)卷曲等）的變化，1 635 cm-1處的特征峰表明PGA分子內(nèi)存在α-螺旋結(jié)構(gòu)[28]。特征峰的移動表明KCl的添加使PGA構(gòu)象中形成了α-螺旋結(jié)構(gòu)。綜上所述，紅外光譜表明KCl的添加會使PGA分子內(nèi)氫鍵增強，從而形成α-螺旋結(jié)構(gòu)。

2.5 圓二色譜分析

如圖2所示，不同KCl質(zhì)量濃度下合成的PGA分子均在212 nm存在負峰。在遠紫外區(qū)時，β-折疊結(jié)構(gòu)的多肽會在212 nm處形成負峰[15]。212 nm處的負峰表明不同KCl質(zhì)量濃度下合成的PGA都存在β-折疊結(jié)構(gòu)，且未添加KCl時合成的PGA分子以β-折疊結(jié)構(gòu)為主。培養(yǎng)基中添加15 g/L KCl時合成的PGA在209 nm和215 nm處形成了負峰。遠紫外區(qū)時，α-螺旋結(jié)構(gòu)的多肽會在209 nm處形成負峰[25]。由此可知，KCl的添加使PGA分子從β-折疊結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)向了β-折疊與α-螺旋并存的結(jié)構(gòu)。此外，215 nm處的負峰可能是由β-折疊結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)向其他結(jié)構(gòu)時形成的過渡態(tài)結(jié)構(gòu)而引起。圓二色譜結(jié)果表明，KCl的添加使PGA分子從β-折疊結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)向了β-折疊與α-螺旋并存的結(jié)構(gòu)。圓二色譜分析結(jié)果與紅外光譜結(jié)果基本一致。

圖2 不同KCl質(zhì)量濃度下合成的PGA圓二色譜圖Fig.2 CD spectra of PGA synthesized with different KCl concentrations

2.6 差示掃描量熱和熱重分析

如圖3所示，第1個吸熱峰是PGA純化樣品中的水蒸發(fā)吸熱峰，質(zhì)量占據(jù)了樣品質(zhì)量的20%；第2個吸熱峰是PGA分子的吸熱峰，而該吸熱峰分成了2 個階段，第1階段的吸熱峰面積較第2個階段大。當(dāng)培養(yǎng)基中KCl添加量從0 g/L增加至15 g/L時，PGA熔點從376.46 ℃提高至377.26 ℃，焓變從486.6 J/g提高至498.1 J/g（表4）。這表明隨培養(yǎng)基中KCl添加量的增加，PGA熔點和焓變稍有提高。

圖3 不同KCl質(zhì)量濃度下合成的PGA差示掃描量熱圖Fig.3 Differential scanning calorimetry curves of PGA synthesized with different KCl concentrations

表4 KCl對PGA熱力學(xué)性質(zhì)的影響Table 4 Effect of KCl on thermodynamic properties of PGA

培養(yǎng)基中添加0 g/L和15 g/L KCl合成的PGA質(zhì)量損失溫度分別從365 ℃和368.5 ℃開始，直到800 ℃仍然存在質(zhì)量損失現(xiàn)象（圖4）。從質(zhì)量損失溫度開始，PGA的質(zhì)量損失曲線分為3 個階段，第1階段是PGA在高溫（質(zhì)量損失開始溫度到410 ℃左右）下進行熱降解。當(dāng)溫度繼續(xù)升高至410～500 ℃左右時，出現(xiàn)第2次質(zhì)量損失情況，即為第2階段的質(zhì)量損失。第3階段是PGA持續(xù)熱降解形成焦谷氨酸（500～800 ℃）。經(jīng)過質(zhì)量損失后，PGA殘余質(zhì)量在去除水分占比后大約為25%，這與其他文獻報道的PGA熱降解后殘余質(zhì)量基本一致，殘余物質(zhì)是PGA在高溫催化下形成的焦谷氨酸[29]。一般情況下，PGA的質(zhì)量損失過程不存在類似的第2階段質(zhì)量損失變化，但本研究中PGA質(zhì)量損失存在第2階段的質(zhì)量損失，這與其他報道結(jié)果存在差異[30]。差示掃描量熱分析與熱重分析結(jié)果表明KCl的添加使PGA熔點、焓變和熱質(zhì)量損失溫度均略有提高。熔點、焓變和熱質(zhì)量損失溫度會受到分子內(nèi)作用力的影響，分子內(nèi)作用力強時熔點、焓變和熱質(zhì)量損失溫度會降低[14]。而PGA構(gòu)象由β-折疊結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)向了α-螺旋時，分子內(nèi)氫鍵增強，分子內(nèi)作用力減弱[27]。由此可知，KCl的添加使PGA構(gòu)象發(fā)生了變化。

圖4 不同KCl質(zhì)量濃度下合成的PGA熱重圖Fig.4 Thermogravimetry curves of PGA synthesized with different KCl concentrations

2.7 PGA溶液剪切黏度分析

如圖5所示，不同時間下，PGA水溶液均體現(xiàn)出剪切變稀的特性。剪切變稀的特性說明PGA水溶液屬于假塑性流體，其與其他報道一致[31]。不同KCl質(zhì)量濃度下合成的PGA水溶液剪切黏度不同。當(dāng)培養(yǎng)基中添加15 g/L KCl時，PGA剪切黏度從2.12 Pa·s下降至1.44 Pa·s，剪切黏度降低了32.08%（圖5a）。此外，隨靜置時間的延長，PGA水溶液的剪切黏度明顯降低。PGA水溶液靜置6 h后，培養(yǎng)基中未添加KCl時合成的PGA水溶液剪切黏度為1.99 Pa·s，添加15 g/L KCl時的剪切黏度僅為1.14 Pa·s，相比于0 h的剪切黏度分別降低了6.14%和20.84%（圖5b）。這表明培養(yǎng)基中KCl的添加使PGA水溶液剪切黏度隨時間延長而降低的現(xiàn)象更明顯。該結(jié)果與2.3節(jié)推測基本一致。

圖5 不同KCl質(zhì)量濃度下合成的PGA水溶液剪切黏度曲線Fig.5 Shear viscosity curves of PGA aqueous solutions synthesized with different KCl concentrations

3 結(jié) 論

利用凝膠滲透色譜、手性色譜、靜態(tài)光散射、圓二色譜、紅外色譜、熱分析以及剪切黏度測定等方法，對添加KCl培養(yǎng)基中B.subtilis合成的PGA分子結(jié)構(gòu)（分子質(zhì)量、立體構(gòu)型和構(gòu)象）進行了系統(tǒng)表征。當(dāng)培養(yǎng)基中添加15 g/L KCl時，PGA分子質(zhì)量下降13.9%，PGA分子中D-谷氨酸比例增加6.11%，PGA表現(xiàn)出更好的水溶性，且更易發(fā)生聚集而形成聚集態(tài)，構(gòu)象上β-折疊結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)向了β-折疊與α-螺旋并存的結(jié)構(gòu)，剪切黏度降低了32.08%（0 h）。

PGA分子質(zhì)量和PGA分子中D-谷氨酸比例會受到PGA合成酶系的影響，其中PGA分子質(zhì)量主要受到PGA降解酶（如pgdS、ggt和cwlO等）的影響，PGA中D-谷氨酸比例則受到谷氨酸消旋酶或轉(zhuǎn)運酶（如glr和dat等）的影響[3,17]。KCl的添加有可能引起了上述酶系表達量的變化，使PGA分子質(zhì)量降低及PGA中D-谷氨酸比例提高。PGA分子質(zhì)量的降低和PGA中D-谷氨酸比例的提高降低了PGA溶液黏度。

當(dāng)溶液pH值高于PGA等電點時，PGA分子在溶液中的帶負電荷，PGA分子之間排斥作用較強[7]。培養(yǎng)基中添加KCl時，部分K+會進入PGA分子中使PGA的負電荷降低，靜電排斥力減弱，因而容易聚集[16]。而PGA溶液黏度會隨聚集態(tài)程度的升高而降低，因此PGA易形成聚集態(tài)的特性會使PGA溶液黏度降低。

此外，PGA構(gòu)象變化與KCl的添加密不可分。因為PGA構(gòu)象受到分子內(nèi)氫鍵的影響，H+會使PGA形成強烈的分子內(nèi)氫鍵，從而導(dǎo)致PGA構(gòu)象轉(zhuǎn)向α-螺旋[27]。K+與H+相似，K+的添加也會使PGA構(gòu)象向α-螺旋轉(zhuǎn)變，但K+直徑大于H+且K+的對于羧基的負電荷親和力弱于H+[32]。因此KCl的添加僅使PGA構(gòu)象由β-折疊轉(zhuǎn)向β-折疊和α-螺旋并存的結(jié)構(gòu)。PGA構(gòu)象對PGA溶液黏度意義重大，構(gòu)象為α-螺旋時PGA溶液黏度較低，β-折疊時黏度較高。因而，KCl的添加引起的構(gòu)象轉(zhuǎn)變將會使PGA溶液黏度降低。

綜上所述，KCl的添加會使PGA分子結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，分子結(jié)構(gòu)的變化會直接導(dǎo)致PGA水溶液黏度降低，從而引起PGA發(fā)酵液黏度的降低。KCl降低發(fā)酵液黏度時分子結(jié)構(gòu)變化涉及分子質(zhì)量、立體構(gòu)型和構(gòu)象，而其他降低PGA發(fā)酵液黏度的方法引起的分子結(jié)構(gòu)變化往往是單方面的。如耐鹽B.subtilis（chungkookjang）發(fā)酵生產(chǎn)PGA時可以通過添加NaCl使發(fā)酵液黏度降低，NaCl的添加引起發(fā)酵液黏度降低的原因是NaCl導(dǎo)致PGA分子質(zhì)量的降低[13]。B.subtilisCGMCC 2108發(fā)酵生產(chǎn)PGA時，可以通過向培養(yǎng)基中添加CaCl2降低發(fā)酵液黏度，而導(dǎo)致發(fā)酵液黏度降低的原因是CaCl2使PGA構(gòu)象發(fā)生了變化[31]。分子結(jié)構(gòu)多方面變化協(xié)同作用導(dǎo)致PGA發(fā)酵液黏度降低給開發(fā)降黏策略提供了新的思路和基礎(chǔ)。