營(yíng)養(yǎng)脅迫植物乳桿菌KLDS 1.0328的生理特性及其冷凍干燥菌粉貯存穩(wěn)定性分析

馬佳歌，姜瞻梅，姜 瑞，侯俊財(cái)，于 微

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué) 乳品科學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江 哈爾濱 150030）

益生菌被定義為“施予一定數(shù)量能夠?qū)λ拗鹘】诞a(chǎn)生有益作用的活的微生物”[1]。益生菌已被證實(shí)存在多種益生性能，包括抑制致病菌生長(zhǎng)、降膽固醇、調(diào)節(jié)機(jī)體免疫、改善胃腸道菌群、促進(jìn)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收及抗氧化等[2]。植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）是一種被認(rèn)為安全的一類革蘭氏陽(yáng)性乳酸菌，也是發(fā)酵食品和人類健康的重要“參與者”，其作為重要的發(fā)酵劑一直被廣泛用于發(fā)酵乳、肉和植物食品，如酸奶、奶酪、香腸、醬油、谷物飲料、泡菜等[3]。然而，益生菌在其生存環(huán)境中常面臨非生物性和生物性脅迫，其中，非生物脅迫主要發(fā)生在生產(chǎn)、加工、運(yùn)輸及貯存等過程中，如酸、堿、溫度、滲透壓、氧和乙醇等脅迫；生物脅迫則發(fā)生在宿主和復(fù)雜的生態(tài)系統(tǒng)中，如胃酸、酶和膽鹽等脅迫[4]。為增強(qiáng)益生菌對(duì)不利環(huán)境的抵抗性和貯藏穩(wěn)定性，常采用微膠囊包埋技術(shù)提高菌體的活力。其中，冷凍干燥技術(shù)是目前被廣泛應(yīng)用的保護(hù)益生菌活性最為有效的方式之一。盡管與其他技術(shù)相比其成本較高，但冷凍干燥技術(shù)能夠提高菌體應(yīng)對(duì)脅迫環(huán)境的抵抗力，并且兼具易于貯存和應(yīng)用的優(yōu)點(diǎn)[5]。凍干過程可能會(huì)引起菌體一定程度上的損傷，這些因素會(huì)嚴(yán)重影響益生菌的數(shù)量、活力和代謝穩(wěn)定性，繼而影響發(fā)酵食品的品質(zhì)及其益生功效的發(fā)揮。

隨著益生菌與腸道微生態(tài)健康關(guān)系的研究日益深入，人們也逐漸認(rèn)識(shí)到益生菌所需營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)也具有菌株特異性，許多益生菌對(duì)其生存環(huán)境的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和生長(zhǎng)條件均具有特殊的要求[6]。因此，益生菌生態(tài)位中由于營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)缺乏帶來(lái)的營(yíng)養(yǎng)脅迫作為一種特定的限制性因素也受到了學(xué)者們的重視[7]。眾所周知，葡萄糖是益生菌碳源和能源的最常見來(lái)源[8]。在葡萄糖耗盡的情況下，菌體遭受葡萄糖營(yíng)養(yǎng)饑餓脅迫，益生菌則開始分解氨基酸作為替代性的碳/能源并產(chǎn)生芳香化合物；一個(gè)典型的例子是一些乳品相關(guān)的乳酸菌可能會(huì)將支鏈氨基酸轉(zhuǎn)化為揮發(fā)性的支鏈脂肪酸以合成ATP[9]。聚氧乙烯脫水山梨醇單油酸酯，商品名稱吐溫80（Tween 80），其作為一種非離子表面活性劑和乳化劑，被廣泛地應(yīng)用于食品、藥品和化妝品等領(lǐng)域[10]。由于Tween 80的結(jié)構(gòu)中包含親油基團(tuán)——油酸基團(tuán)，因而也被廣泛用作微生物生長(zhǎng)培養(yǎng)基中的添加劑，為細(xì)菌（如乳酸菌屬）提供外源的油酸[11]。此外，Tween 80可通過影響菌體的細(xì)胞膜特性，保護(hù)菌體并減少不利環(huán)境帶來(lái)的影響[12]。

目前關(guān)于環(huán)境脅迫對(duì)乳酸菌影響的科學(xué)研究多集中在單一脅迫的條件下，然而在實(shí)際應(yīng)用中，多種脅迫往往同時(shí)發(fā)生，且不同脅迫之間可能具有復(fù)雜的交叉關(guān)聯(lián)性[13]。由一種脅迫應(yīng)激所誘導(dǎo)的對(duì)另一種環(huán)境脅迫的保護(hù)作用被稱為交叉保護(hù)。研究發(fā)現(xiàn)，馬乳酒樣乳桿菌的熱、冷、酸和膽鹽的脅迫預(yù)適應(yīng)誘導(dǎo)了同源脅迫的耐受性和異源脅迫的交叉保護(hù)，蛋白質(zhì)組學(xué)顯示在脅迫預(yù)適應(yīng)處理的菌體中發(fā)生了27 個(gè)蛋白的差異性表達(dá)，其中包含參與碳水化合物代謝、平衡pH值、翻譯相關(guān)和脅迫應(yīng)激蛋白，這些應(yīng)激蛋白表達(dá)水平的上調(diào)可能在菌體抵御之后的脅迫方面發(fā)揮關(guān)鍵的作用[14]。近年來(lái)，眾多研究學(xué)者利用交叉保護(hù)作用成功改善了食品微生物在冷凍干燥及其貯藏過程中的存活率。甄妮等[15]報(bào)道了熱休克處理誘發(fā)的交叉保護(hù)能夠使嗜酸乳桿菌在凍干過程的存活率顯著增加，并且增強(qiáng)了菌體在不同貯存溫度下的抵御能力。Gasaluck等[16]采用冷和滲透交叉保護(hù)作為控制性措施，提高貯存期間凍干菌體的穩(wěn)定性和延長(zhǎng)保質(zhì)期。

由于食品工業(yè)中的環(huán)境脅迫會(huì)導(dǎo)致乳酸菌細(xì)胞存活率大幅下降，因此，提高乳酸菌存活率和穩(wěn)定性的方法和策略越來(lái)越受到食品工業(yè)的關(guān)注。分析乳酸菌在營(yíng)養(yǎng)脅迫下的應(yīng)激反應(yīng)能夠更為有效地對(duì)其生長(zhǎng)及發(fā)酵條件進(jìn)行針對(duì)性設(shè)計(jì)和開發(fā)，具有十分重要的意義。然而，通過營(yíng)養(yǎng)脅迫處理提高冷凍干燥乳酸菌在貯存過程中活力的效果目前研究較少?；谏鲜鲈?，本研究采用前期篩選出的具有益生特性的L.plantarumKLDS 1.0328為研究對(duì)象，測(cè)定葡萄糖脅迫、Tween 80脅迫以及葡萄糖和Tween 80復(fù)合脅迫對(duì)其活力、產(chǎn)酸、細(xì)菌素抑菌活性及形態(tài)的影響。并在此基礎(chǔ)上，分析經(jīng)不同營(yíng)養(yǎng)脅迫處理后冷凍干燥的L.plantarumKLDS 1.0328活力差異，以期為提高益生菌發(fā)酵劑貯存穩(wěn)定性提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

L.plantarumKLDS 1.0328為東北農(nóng)業(yè)大學(xué)乳品科學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室分離篩選自東北傳統(tǒng)發(fā)酵泡菜并保藏；金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureusATCC 25923）和大腸桿菌（Escherichia coliATCC 25922）美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心；MRS培養(yǎng)基、MRS瓊脂培養(yǎng)基 北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；脫脂乳粉黑龍江完達(dá)山乳業(yè)股份有限公司；海藻糖 阿拉丁試劑（上海）有限公司；其余試劑均采用國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

VD-1320超凈工作臺(tái) 蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；DH4000A電熱恒溫培養(yǎng)箱 天津泰斯特儀器有限公司；ULT1386-3-V30超低溫冰箱 日本Sanyo公司；Allegra X-30R臺(tái)式高速冷凍離心機(jī) 美國(guó)Beckman Coulter公司；PHS-3C精密pH計(jì) 上海雷磁儀器廠；UV-2600型紫外-可見分光光度計(jì) 日本Shimadzu公司；ES-2030真空冷凍干燥儀、SU8010掃描電鏡 日本Hitachi公司；6590N-5973N氣相色譜儀 美國(guó)Agilent公司；HC103/02水分測(cè)定儀 瑞士Mettler Toledo公司；LabMaster-aw水分活度儀 瑞士Novasina公司。

1.3 方法

1.3.1 菌種的活化

將保存在-80 ℃及40%（V/V）甘油凍存管中的L.plantarumKLDS 1.0328以2%（V/V，下同）的接種量（約107CFU/mL）接種于已滅菌的MRS液體培養(yǎng)基中，并于37 ℃恒溫條件下培養(yǎng)24 h，連續(xù)活化2 代以恢復(fù)菌種活力。將該菌種接入至MRS固體平板培養(yǎng)基中于37 ℃培養(yǎng)24 h，接種環(huán)挑取單菌落移入MRS液體培養(yǎng)基中進(jìn)行分離純化，37 ℃培養(yǎng)18 h作為供試菌液備用。

1.3.2 營(yíng)養(yǎng)脅迫

采用4 種不同的生長(zhǎng)培養(yǎng)基（基礎(chǔ)MRS、葡萄糖脅迫、Tween 80脅迫、葡萄糖和Tween 80脅迫液體培養(yǎng)基），以探究多種營(yíng)養(yǎng)脅迫對(duì)L.plantarumKLDS 1.0328生理參數(shù)，如菌體生長(zhǎng)、產(chǎn)酸能力、細(xì)菌素生產(chǎn)和菌體形態(tài)等的影響。培養(yǎng)基配方如表1所示。將上述培養(yǎng)基的pH值調(diào)整至6.2±0.1，于121 ℃高壓滅菌15 min。將L.plantarumKLDS 1.0328菌懸液以2%接種量（約107CFU/mL）接種在上述4 種營(yíng)養(yǎng)脅迫培養(yǎng)基中37 ℃培養(yǎng)24 h，菌液于4 ℃、5 000×g離心10 min，棄上清液，采用0.85 g/100 mL生理鹽水洗滌菌泥3 次。

表1 L.plantarumKLDS 1.0328營(yíng)養(yǎng)脅迫培養(yǎng)基配方Table 1 Nutrient-stress medium formulations of L.plantarum KLDS 1.0328

1.3.3 pH值和菌體生長(zhǎng)情況的測(cè)定

使用PHS-3C精密pH計(jì)測(cè)定培養(yǎng)液的pH值；UV-2600型紫外-可見分光光度計(jì)用于測(cè)定菌液在600 nm波長(zhǎng)處的OD值；通過梯度稀釋及平板菌落計(jì)數(shù)法測(cè)定活菌數(shù)[17]。

1.3.4 抑菌活性的測(cè)定

以S.aureusATCC 25923和E.coliATCC 25922為指示菌，根據(jù)牛津杯瓊脂擴(kuò)散法[18]稍作改動(dòng)，每隔3 h對(duì)多種營(yíng)養(yǎng)脅迫L.plantarumKLDS 1.0328的抑菌活性進(jìn)行測(cè)定。以抑菌圈的直徑（mm）表示L.plantarumKLDS 1.0328的抑菌活性強(qiáng)弱。

1.3.5 掃描電鏡觀察營(yíng)養(yǎng)脅迫菌體

將1.3.2節(jié)中所獲得的營(yíng)養(yǎng)脅迫菌體與戊二醛（2.5%，pH 6.8）混合并于4 ℃固定12 h。用0.1 mol/L的磷酸緩沖液（pH 6.8）沖洗3 次（每次10 min）。分別使用體積分?jǐn)?shù)50%、70%和90%的乙醇溶液脫水15 min，再用無(wú)水乙醇脫水2 次（每次10 min）。采用無(wú)水乙醇∶叔丁醇=1∶1（V/V）和100%叔丁醇分別置換15 min。樣品于-20 ℃預(yù)凍12 h后進(jìn)行冷凍干燥。將干燥的菌體粘貼在導(dǎo)電膠帶上并鍍金，噴金時(shí)間120 s，電流強(qiáng)度20 mA，采用掃描電鏡觀察營(yíng)養(yǎng)脅迫菌體的形態(tài)。從掃描電鏡圖像中隨機(jī)選取30 個(gè)菌體，通過ImageJ軟件測(cè)量每個(gè)菌體的長(zhǎng)度（l）和直徑（d），每次測(cè)量重復(fù)3 次。參照Parlindungan等[19]的方法定義了乳桿菌桿的半徑（r=d/2）和高度（h=l-2r），并得到平均菌體體積計(jì)算如式（1）所示：

式中：V為平均菌體體積/μm3；r為乳酸菌桿的半徑/μm；h為桿的高度/μm。

1.3.6 細(xì)胞膜脂肪酸的測(cè)定

細(xì)胞膜脂肪酸樣品制備參照Gandhi等[20]的方法進(jìn)行。利用配有HP-5彈性石英毛細(xì)管柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）的氣相色譜儀對(duì)L.plantarumKLDS 1.0328菌體的細(xì)胞膜脂肪酸進(jìn)行分離鑒定，進(jìn)樣口溫度250 ℃，高純氦氣作為載氣，柱流速1 mL/min，柱前壓73.0 kPa，起始溫度70 ℃運(yùn)行2 min，5 ℃/min升至230 ℃，保持20 min，5 ℃/min升至280 ℃，保持15 min，分流進(jìn)樣1 μL，分流比20∶1。質(zhì)譜分析：電子電離源，電子能量70 eV，離子源溫度200 ℃，接口溫度250 ℃。脂肪酸含量表示為相對(duì)物質(zhì)的量百分比（%）。

1.3.7 冷凍干燥

將10 g脫脂乳粉和5 g海藻糖分散在85 mL已滅菌的去離子水中，于室溫下600 r/min磁力攪拌30 min以充分溶解，并于121 ℃滅菌15 min。將1.3.2節(jié)中所獲得的營(yíng)養(yǎng)脅迫菌體與上述凍干保護(hù)劑混合均勻。將分散在保護(hù)劑中的菌懸液置于-20 ℃冰箱內(nèi)預(yù)凍12 h。將預(yù)凍好的菌液冷凍干燥處理12 h，將凍干菌粉取出后備用。稱取1.5 g左右L.plantarumKLDS 1.0328凍干菌粉，將其疏松分散在水分測(cè)定儀托盤中央干燥以便水分迅速蒸發(fā)，直到樣品小于1 mg的質(zhì)量變化達(dá)到90 s，利用干燥過程中樣品質(zhì)量變化計(jì)算水分含量。凍干菌粉的水分活度于室溫下使用水分活度儀進(jìn)行測(cè)定。

1.3.8 冷凍干燥存活率的測(cè)定

將各脅迫處理的L.plantarumKLDS 1.0328凍干菌粉樣品于0.85 g/100 mL生理鹽水中復(fù)水，而后進(jìn)行梯度稀釋并采用平板菌落計(jì)數(shù)法測(cè)定活菌數(shù)。冷凍干燥后細(xì)胞存活率的計(jì)算如式（2）所示：

式中：S1凍干后的細(xì)胞存活率/%；N為凍干后的活菌數(shù)/（CFU/g）；N0為凍干前的活菌數(shù)/（CFU/g）。

1.3.9 營(yíng)養(yǎng)脅迫凍干菌粉在貯存期存活率的測(cè)定

將經(jīng)營(yíng)養(yǎng)脅迫處理的L.plantarumKLDS 1.0328按1.3.6節(jié)方法進(jìn)行冷凍干燥。將獲得的凍干菌粉置于Eppendorf管中并用封口膜密封，將菌粉樣品分別于-18、4、25 ℃和37 ℃貯存42 d。每隔7 d檢測(cè)其在貯存期間的細(xì)胞存活率，其計(jì)算如式（3）所示：

式中：S2為貯存期間的細(xì)胞存活率/%；NA為凍干后貯存第n周（1～6 周）的活菌數(shù)/（CFU/g）；NB為凍干后貯存第0周的活菌數(shù)/（CFU/g）。

1.4 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 營(yíng)養(yǎng)脅迫對(duì)L.plantarum KLDS 1.0328產(chǎn)酸和生長(zhǎng)的影響

如圖1所示，由葡萄糖、Tween 80或兩種營(yíng)養(yǎng)缺失帶來(lái)的脅迫環(huán)境對(duì)L.plantarumKLDS 1.0328的產(chǎn)酸性能和活力均有不同程度的影響。在培養(yǎng)24 h時(shí)，未經(jīng)脅迫對(duì)照組菌液pH值為3.78±0.20，Tween 80脅迫組菌體的產(chǎn)酸能力與對(duì)照組相比未產(chǎn)生顯著差異，而葡萄糖脅迫及葡萄糖和Tween 80復(fù)合脅迫組菌體培養(yǎng)液的pH值至仍保持在6.14±0.20和6.06±0.28。這些結(jié)果與文獻(xiàn)中報(bào)道的葡萄糖是乳酸菌（如嗜酸乳桿菌、保加利亞乳桿菌、干酪乳桿菌、乳酸乳球菌和L.plantarum等）的首選碳水化合物來(lái)源一致[21]。對(duì)于生長(zhǎng)活力而言，經(jīng)葡萄糖脅迫和復(fù)合脅迫處理的L.plantarumKLDS 1.0328菌體的OD600nm和活菌數(shù)相較于對(duì)照組均顯著下降（P＜0.05），且復(fù)合脅迫組中生長(zhǎng)活力降低的趨勢(shì)更大。此外，Tween 80脅迫組的生長(zhǎng)活力與對(duì)照組相比未發(fā)生明顯變化，這表示L.plantarumKLDS 1.0328具有一定自我調(diào)控及適應(yīng)Tween 80缺乏環(huán)境的能力，乳酸菌在Tween 80脅迫下的存活取可能決于它們利用其他營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的能力[22]。以葡萄糖作為碳源的營(yíng)養(yǎng)脅迫環(huán)境下所產(chǎn)生的較高菌液pH值和較低生長(zhǎng)活力的現(xiàn)象，取決于其偏愛有效吸收及利用葡萄糖的代謝途徑，因而不存在葡萄糖的培養(yǎng)基的生長(zhǎng)及代謝水平與碳水化合物葡萄糖富集的培養(yǎng)基相比較低[23]。Hussian等[24-25]研究營(yíng)養(yǎng)脅迫下干酪乳桿菌的適應(yīng)能力時(shí)也發(fā)現(xiàn)，該菌株在無(wú)乳糖所導(dǎo)致的脅迫環(huán)境下培養(yǎng)30 d后仍能存活，說明盡管相對(duì)于富含碳水化合物培養(yǎng)下的干酪乳桿菌，無(wú)乳糖培養(yǎng)的干酪乳桿菌具有較低的生長(zhǎng)速率和最終光密度，但該菌株仍具有適應(yīng)營(yíng)養(yǎng)脅迫環(huán)境的能力。

圖1 營(yíng)養(yǎng)脅迫處理后L.plantarumKLDS 1.0328的pH值和生長(zhǎng)情況分析Fig.1 pH and growth of L.plantarum KLDS 1.0328 under nutrient stress

2.2 營(yíng)養(yǎng)脅迫對(duì)L.plantarum KLDS 1.0328抑菌活性的影響

如圖2所示，在未經(jīng)營(yíng)養(yǎng)脅迫處理的基礎(chǔ)MRS培養(yǎng)基中，L.plantarumKLDS 1.0328抑菌活性顯著高于葡萄糖脅迫處理組（P＜0.05），且對(duì)S.aureusATCC 25923和E.coliATCC 25922的抑菌圈直徑分別為（18.89±0.29）mm和（17.94±0.38）mm。此外，對(duì)照組和營(yíng)養(yǎng)脅迫組中對(duì)S.aureusATCC 25923抑菌活性均顯著高于E.coliATCC 25922。在Tween 80或葡萄糖和Tween 80復(fù)合營(yíng)養(yǎng)脅迫環(huán)境下，未檢測(cè)到細(xì)菌素抑菌活性。這說明Tween 80是L.plantarumKLDS 1.0328細(xì)菌素生產(chǎn)中非常關(guān)鍵的物質(zhì)前提。結(jié)合圖1，可推測(cè)乳酸菌細(xì)菌素的抑菌活性和生長(zhǎng)活力之間并不一定存在同步關(guān)系。此外，對(duì)比關(guān)于已有Tween 80脅迫下乳酸菌的研究可以發(fā)現(xiàn)，乳酸菌細(xì)菌素的抑菌活性除了受環(huán)境因素影響，還可能具有菌株特異性。Fadahunsi等[26]報(bào)道了乳酸菌培養(yǎng)基中Tween 80對(duì)乳酸菌生長(zhǎng)及細(xì)菌素合成具有至關(guān)重要的作用。這也與Huot等[27]的結(jié)果相似，其分析發(fā)現(xiàn)Tween 80的存在使乳酸乳球菌細(xì)菌素的產(chǎn)量增加了4 倍。Tween 80造成的影響可以歸因于其與乳酸菌細(xì)菌素的解聚和脫吸附有關(guān)[28]。

圖2 營(yíng)養(yǎng)脅迫處理后L.plantarum KLDS 1.0328的抑菌活性分析Fig.2 Antimicrobial activity of L.plantarum KLDS 1.0328 under nutrient stress

2.3 營(yíng)養(yǎng)脅迫下L.plantarum KLDS 1.0328形態(tài)的差異分析

通過掃描電鏡觀察L.plantarumKLDS 1.0328菌體在多種營(yíng)養(yǎng)脅迫培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的形態(tài)變化?；A(chǔ)MRS液體培養(yǎng)基中菌體呈現(xiàn)出較為平滑和規(guī)則的形態(tài)（圖3A）；可直觀發(fā)現(xiàn)，與未經(jīng)脅迫處理組相比，葡萄糖脅迫處理得到的菌體普遍變短，部分呈現(xiàn)卵圓形（圖3B）；Tween 80脅迫下菌體呈現(xiàn)出細(xì)長(zhǎng)的棒狀，且部分產(chǎn)生了略微褶皺的表面（圖3C）；葡萄糖和Tween 80復(fù)合脅迫則導(dǎo)致菌體呈現(xiàn)出短桿乃至卵圓狀的形態(tài)（圖3D）。

圖3 營(yíng)養(yǎng)脅迫處理后L.plantarumKLDS 1.0328的掃描電鏡圖Fig.3 SEM images of L.plantarum KLDS 1.0328 under nutrient stress

由表2可知，經(jīng)Tween 80脅迫的菌體具有最大長(zhǎng)度2.07 μm；與對(duì)照組菌體相比，Tween 80脅迫導(dǎo)致菌體的長(zhǎng)度/直徑比顯著增加，且其體積也由0.40 μm3顯著上升至0.48 μm3。研究顯示，乳桿菌在沒有隔膜生長(zhǎng)、側(cè)壁產(chǎn)生肽聚糖的情況下時(shí)，由于細(xì)胞不完全分裂或細(xì)胞分裂異常，可能導(dǎo)致菌體轉(zhuǎn)變?yōu)榧?xì)長(zhǎng)絲狀桿的形態(tài)[19]。葡萄糖脅迫及葡萄糖和Tween 80復(fù)合脅迫菌體的長(zhǎng)度之間無(wú)顯著性差異（P＞0.05），且均顯著低于未受脅迫菌體的長(zhǎng)度1.60 μm（P＜0.05）。營(yíng)養(yǎng)脅迫處理的各組菌體直徑之間無(wú)顯著差異（P＞0.05）。此外，葡萄糖脅迫及葡萄糖和Tween 80復(fù)合脅迫菌體的平均長(zhǎng)度、長(zhǎng)度/直徑比和體積與對(duì)照組相比均顯著減小（P＜0.05）。這可能是因?yàn)榫w的短桿或球形形態(tài)可使菌體具有較大的營(yíng)養(yǎng)攝取表面積，從而在營(yíng)養(yǎng)缺乏的環(huán)境中保持其活性[29]。因此，可進(jìn)一步推測(cè)菌體形態(tài)上所發(fā)生的變化可作為細(xì)菌生存及適應(yīng)營(yíng)養(yǎng)脅迫環(huán)境的重要方式。

表2 營(yíng)養(yǎng)脅迫對(duì)L.plantarumKLDS 1.0328的平均長(zhǎng)度、直徑、長(zhǎng)度/直徑比和體積的影響Table 2 Effect of nutrient stress on average cell length, diameter,length/diameter ratio and volume of L.plantarum KLDS 1.0328

2.4 營(yíng)養(yǎng)脅迫下L.plantarum KLDS 1.0328細(xì)胞膜脂肪酸的差異分析

如圖4所示，暴露于不同營(yíng)養(yǎng)饑餓環(huán)境下菌體的細(xì)胞膜脂肪酸的含量均有不同程度變化。4 組樣品中共檢測(cè)出9 種脂肪酸，其中包含4 種飽和脂肪酸（saturated fatty acid，SFA）和5 種不飽和脂肪酸（unsaturated fatty acid，USFA）。SFA分別包括豆蔻酸C14:0、十五酸C15:0、棕櫚酸C16:0和硬脂酸C18:0；USFA分別包括棕櫚烯酸C16:1n-9、十八碳烯酸C18:1n-7、油酸C18:1n-9、亞油酸C18:2和環(huán)丙烷脂肪酸cycC19:0。與對(duì)照組相比可以發(fā)現(xiàn)，葡萄糖脅迫及Tween 80脅迫菌體的細(xì)胞膜脂肪酸中的C14:0和C15:0含量均顯著減少，C18:1n-9和cycC19:0含量顯著升高（P＜0.05）。葡萄糖脅迫組的C16:1n-9顯著高于對(duì)照組，而Tween 80脅迫組恰好相反（P＜0.05）。此外，葡萄糖和Tween 80復(fù)合脅迫組的C16:1n-9顯著低于對(duì)照組，C18:1n-9和cycC19:0含量顯著高于對(duì)照組（P＜0.05）。研究表明，cycC19:0是一種經(jīng)油酸甲基化得到的USFA，其產(chǎn)生對(duì)于菌體抵御嚴(yán)酷環(huán)境的破壞具有重要的價(jià)值[30]。值得注意的是，不同營(yíng)養(yǎng)脅迫處理后菌體的總UFSA和SFA含量比值具有明顯差異性。其中，對(duì)照組菌體細(xì)胞膜的USFA/SFA值為1.26，而葡萄糖脅迫組中USFA/SFA值在4 組樣品中最高約為1.41，Tween 80脅迫組和復(fù)合營(yíng)養(yǎng)脅迫組的USFA/SFA值分別為1.35和1.32。這種UFSA占比增加的現(xiàn)象和Haddaji等[31]的研究相似，其也提出細(xì)菌可通過改變自身細(xì)胞膜脂肪酸的組成和含量作為適應(yīng)脅迫環(huán)境的策略，細(xì)胞膜流動(dòng)性受其USFA/SFA值的變化而調(diào)控，以降低其營(yíng)養(yǎng)脅迫下的損傷。

圖4 營(yíng)養(yǎng)脅迫處理對(duì)L.plantarumKLDS 1.0328細(xì)胞膜脂肪酸成分及含量的影響Fig.4 Effect of nutritional stress on the fatty acid composition and content of cell membrane of L.plantarum KLDS 1.0328

2.5 營(yíng)養(yǎng)脅迫對(duì)冷凍干燥L(fēng).plantarum KLDS 1.0328存活率的影響

如表3所示，未受到營(yíng)養(yǎng)脅迫L.plantarumKLDS1.0328在冷凍干燥后的存活率為（82.49±3.86）%。與未受營(yíng)養(yǎng)脅迫菌體相比，葡萄糖脅迫處理菌體在凍干后存活率略低，但兩者間不存在顯著差異（P＞0.05）；葡萄糖和Tween 80復(fù)合脅迫菌體在凍干后存活率顯著低于前兩者（P＜0.05）；Tween 80脅迫后菌體在凍干后的存活率也顯著降低，為4 組樣品中的最低（（30.18±4.20）%）。此外，經(jīng)營(yíng)養(yǎng)脅迫和未經(jīng)脅迫處理的各組凍干菌粉的水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)和水分活度之間無(wú)顯著差異（P＞0.05）。水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)及水分活度與益生菌粉的貯存穩(wěn)定性密切相關(guān)[32]。已有研究表明乳基質(zhì)中的水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)一般應(yīng)低于5%左右的臨界值，水分活度一般為0.1～0.25，以保證微生物菌體的穩(wěn)定性[33-34]，過高或過低的水分活度和含量都會(huì)對(duì)菌體造成潛在的傷害。本研究結(jié)果表明樣品的水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)和水分活度均在此范圍內(nèi)。

表3 冷凍干燥L(fēng).plantarum KLDS 1.0328的存活率、水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)和水分活度Table 3 Survival rates, moisture contents and water activity of lyophilized L.plantarum KLDS 1.0328

2.6 營(yíng)養(yǎng)脅迫處理的凍干L.plantarum KLDS 1.0328在不同貯存溫度下的存活率

如圖5所示，未經(jīng)脅迫處理和營(yíng)養(yǎng)脅迫處理的菌體在4 種溫度下的存活率，整體上均隨貯存時(shí)間的延長(zhǎng)呈現(xiàn)下降的趨勢(shì)。與更高的貯存溫度實(shí)驗(yàn)組和其余營(yíng)養(yǎng)脅迫處理組菌粉相比，在-18 ℃條件下貯存的葡萄糖脅迫凍干菌粉在貯存42 d的存活率最高，為（64.57±2.60）%。各組營(yíng)養(yǎng)脅迫凍干菌粉于4 ℃貯存42 d期間，其存活率的變化趨勢(shì)與-18 ℃貯存環(huán)境下的相似。葡萄糖脅迫對(duì)于提高L.plantarumKLDS 1.0328凍干發(fā)酵劑在42 d貯存期間內(nèi)的穩(wěn)定性起到了顯著的積極作用（P＜0.05），尤其是當(dāng)貯存溫度控制在25 ℃和37 ℃時(shí)。當(dāng)營(yíng)養(yǎng)脅迫菌粉貯藏于37 ℃時(shí)，對(duì)照組和3 種營(yíng)養(yǎng)脅迫實(shí)驗(yàn)組在0～7 d期間內(nèi)的存活率均明顯降低，未經(jīng)營(yíng)養(yǎng)脅迫和Tween 80脅迫的凍干菌粉在37 ℃貯藏42 d存活率僅分別為（7.54±2.40）%和（2.19±0.98）%，而經(jīng)葡萄糖脅迫處理后存活率可達(dá)（33.17±3.19）%，為對(duì)照組的4.40 倍。此外，葡萄糖和Tween 80復(fù)合脅迫對(duì)凍干菌粉在貯存期內(nèi)活力的保護(hù)也具有一定的益處。據(jù)報(bào)道，葡萄糖缺失帶來(lái)的營(yíng)養(yǎng)脅迫可能導(dǎo)致乳酸菌對(duì)其他脅迫條件（如酸、熱、滲透壓及氧脅迫）的耐受性的增強(qiáng)[8]。Chen等[14]通過蛋白質(zhì)組學(xué)分析揭示了脅迫預(yù)適應(yīng)處理可能會(huì)誘導(dǎo)相關(guān)應(yīng)激蛋白合成的增加，從而引起對(duì)同源脅迫的保護(hù)和對(duì)異源脅迫的交叉保護(hù)作用。此外，如前所述細(xì)菌細(xì)胞膜脂肪酸的變化可解釋葡萄糖脅迫下L.plantarumKLDS 1.0328凍干菌粉在貯藏期間穩(wěn)定性和生存能力的提高[35]。

圖5 營(yíng)養(yǎng)脅迫處理凍干L.plantarumKLDS 1.0328在不同溫度下貯存42 d的存活率Fig.5 Survival rates of freeze-dried L.plantarum KLDS 1.0328 under nutrient stress stored at ?20, 4, 25 or 37 ℃ for up to 42 days

3 結(jié) 論

研究發(fā)現(xiàn)，與未經(jīng)脅迫對(duì)照組相比，葡萄糖脅迫及葡萄糖和Tween 80復(fù)合營(yíng)養(yǎng)脅迫對(duì)L.plantarumKLDS 1.0328的生長(zhǎng)、產(chǎn)酸和細(xì)菌素抑菌活性方面均有不利影響，并且在復(fù)合脅迫培養(yǎng)基中得到的樣品未檢測(cè)出細(xì)菌素抑菌活性；盡管Tween 80脅迫下的菌體生長(zhǎng)較為旺盛、產(chǎn)酸量較高，但也未檢測(cè)到細(xì)菌素抑菌活性；菌體由短桿狀轉(zhuǎn)變?yōu)殚L(zhǎng)棒狀或卵圓形的形態(tài)可作為其暴露于Tween 80脅迫或葡萄糖及復(fù)合營(yíng)養(yǎng)脅迫環(huán)境下的生存策略；細(xì)胞膜脂肪酸的組成和含量對(duì)維持菌體在多種營(yíng)養(yǎng)脅迫下的存活和形態(tài)也具有重要意義；以上指標(biāo)的檢測(cè)對(duì)于研究菌株的營(yíng)養(yǎng)脅迫適應(yīng)和生存機(jī)制提供了理論支持。此外，未脅迫和經(jīng)葡萄糖脅迫的菌體經(jīng)冷凍干燥后存活率無(wú)顯著差異，且多種營(yíng)養(yǎng)脅迫菌粉的水分含量和水分活度均在合理范圍內(nèi)。本研究得出葡萄糖脅迫可顯著提高冷凍干燥L(fēng).plantarumKLDS 1.0328在不同溫度下貯存42 d期間的存活率，且于-18 ℃條件下的存活率較高。該結(jié)果為開發(fā)和針對(duì)性設(shè)計(jì)L.plantarumKLDS 1.0328培養(yǎng)基及提高其貯存穩(wěn)定性提供了參考。