經(jīng)騏源,李 婷,曾凡坤,索化夷,王洪偉,宋佳佳,張 玉,*
(1.西南大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院,重慶 400715;2.西南大學(xué) 食品科學(xué)與工程國家級(jí)實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心,重慶 400715)
泡菜是中國傳統(tǒng)發(fā)酵食品,具有悠久的歷史文化,其中四川泡菜堪稱為中國“國粹”[1]。四川泡菜原料種類多樣,泡蘿卜是四川泡菜的典型代表[2]。新鮮蘿卜經(jīng)密封發(fā)酵后,口感脆嫩,風(fēng)味獨(dú)特,不僅可以作為佐餐食用,更是川菜制作過程中必備的調(diào)味菜[3]。除此之外,泡蘿卜富含乳酸菌,并具有抗癌、抗肥胖、抗氧化、抗衰老和抗糖尿病的特性[4]。從最初的家庭自制,到目前的工業(yè)化生產(chǎn),泡蘿卜在中國乃至全世界都非常受歡迎[5]。
泡蘿卜在發(fā)酵過程中,微生物群落對(duì)其品質(zhì)起至關(guān)重要的作用[6]。發(fā)酵過程中微生物利用原料組分作為底物代謝產(chǎn)生多種營養(yǎng)和風(fēng)味物質(zhì),最終使產(chǎn)品具有獨(dú)特的營養(yǎng)價(jià)值和風(fēng)味品質(zhì)[7]。乳酸菌是發(fā)酵過程中起關(guān)鍵作用的微生物種群,其在發(fā)酵過程中產(chǎn)生的有機(jī)酸和二氧化碳能夠抑制腐敗菌的生長,從而提高產(chǎn)品的安全性[8]。但乳酸菌的生長代謝受多種因素的影響,如生長環(huán)境條件、發(fā)酵底物以及與其他微生物之間的相互作用等[9]。因此,工業(yè)化的泡蘿卜生產(chǎn),除了控制發(fā)酵環(huán)境和發(fā)酵底物的穩(wěn)定性之外,發(fā)酵劑的選擇顯得尤為重要。目前國內(nèi)泡蘿卜的生產(chǎn)多采用自然發(fā)酵,得到的泡蘿卜品質(zhì)參差不齊,因此,有針對(duì)性地開發(fā)泡蘿卜專用發(fā)酵劑對(duì)泡蘿卜工業(yè)化發(fā)展至關(guān)重要。
本研究選擇經(jīng)過篩選能夠發(fā)酵得到較好品質(zhì)的6 種泡蘿卜原液,經(jīng)分析確定其微生物群落組成后,將其作為發(fā)酵劑接種發(fā)酵新的泡蘿卜,對(duì)比分析泡蘿卜發(fā)酵過程中的基本理化指標(biāo)、質(zhì)構(gòu)特性,測(cè)定亞硝酸鹽、氨基酸、有機(jī)酸的含量,探索發(fā)酵過程中泡蘿卜品質(zhì)的變化規(guī)律,以期獲得高品質(zhì)泡蘿卜生產(chǎn)的專用發(fā)酵劑類型。
新鮮的白蘿卜、食鹽購于重慶永輝超市;6 種不同微生物群落組成的泡菜原液來自重慶地區(qū)家庭制作(分別標(biāo)記為發(fā)酵劑1、2、3、4、5和6)。
發(fā)酵劑1主要由布氏乳桿菌(66.26%(相對(duì)豐度,下同))、毛榛畢赤酵母(99.93%)和未分類的乳桿菌(12.58%)組成,菌落總數(shù)為1.04×106CFU/mL,pH 3.98,鹽度為5.5%。
發(fā)酵劑2主要由布氏乳桿菌(68.65%)、植物乳桿菌(28.64%)和毛榛畢赤酵母(99.99%)組成,菌落總數(shù)為7.35×106CFU/mL,pH 5.07,鹽度為3.0%。
發(fā)酵劑3主要由植物乳桿菌(30.79%)、布氏乳桿菌(14.81%)、未分類的乳桿菌(20.90%)和毛榛畢赤酵母(100.00%)組成,菌落總數(shù)為1.55×107CFU/mL,pH 3.99,鹽度為5.0%。
發(fā)酵劑4主要由植物乳桿菌(56.50%)、布氏乳桿菌(26.40%)、毛榛畢赤酵母(99.84%)和耐乙醇片球菌(15.65%)組成,菌落總數(shù)為5.45×106CFU/mL,pH 3.95,鹽度為3.0%。
發(fā)酵劑5主要由植物乳桿菌(43.63%)、布氏乳桿菌(39.87%)、耐酸乳桿菌(12.34%)和Issatchenkla orientalis(85.52%)組成,菌落總數(shù)為9.92×106CFU/mL,pH 2.54,鹽度為6.5%。
發(fā)酵劑6主要由植物乳桿菌(61.57%)、食竇魏斯氏菌(14.18%)、副銀念珠菌(10.14%)和其他(21.45%)組成,菌落總數(shù)為2.91×107CFU/mL,pH 2.55,鹽度為3.0%。
氫氧化鈉、亞硝酸鈉、亞鐵氰化鉀、乙酸鋅、鹽酸萘乙二胺、乙酸鈉、四硼酸鈉、對(duì)氨基苯磺酸、磷酸二氫鉀(均為分析純) 成都科龍化工試劑廠;苯異硫氰酸酯(phenyl isothiocyanate,PITC)、酚酞、三乙胺、正己烷、醋酸、磷酸(均為分析純),甲醇、乙腈(均為色譜純) 重慶鈦新化工有限公司。
LC20A型高效液相色譜儀 日本島津公司;T6新世紀(jì)紫外-可見分光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司;CT3物性測(cè)定儀 美國Brookfield公司;5810臺(tái)式高速離心機(jī) 德國Eppendorf公司;PB-10精密pH計(jì)德國Sartorius公司;HH-4恒溫水浴鍋 常州澳華儀器有限公司;C21-SN216多功能電磁爐 廣東美的生活電器制造有限公司。
1.3.1 泡菜的制備
將新鮮白蘿卜清洗瀝干后切成長寬25 mm、厚10 mm的塊狀,與等質(zhì)量6%食鹽的涼開水溶液混合裝壇后,分別接種6 種泡菜原液(菌落數(shù)108CFU/mL,接種量見表1),在25 ℃恒溫條件下密封發(fā)酵,每天取樣測(cè)定各項(xiàng)指標(biāo),連續(xù)測(cè)定7 d。
表1 發(fā)酵劑接種量Table 1 Inoculum amounts of starters
1.3.2 pH值的測(cè)定
取25 g泡蘿卜與等量水混合勻漿,用pH計(jì)測(cè)定pH值[10]。
1.3.3 總酸的測(cè)定
取25 g泡蘿卜樣品,加入煮沸過的蒸餾水,搗碎后置于密閉玻璃容器中,轉(zhuǎn)移至250 mL容量瓶中,沸水水浴加熱30 min,中途搖動(dòng)3 次,冷卻,定容后取25 mL濾液,用標(biāo)準(zhǔn)堿液進(jìn)行滴定[11]。
1.3.4 質(zhì)構(gòu)特性測(cè)定
取長寬25 mm、厚10 mm泡蘿卜樣品置于質(zhì)構(gòu)儀下進(jìn)行質(zhì)構(gòu)測(cè)定。質(zhì)構(gòu)測(cè)定參數(shù):探頭AT44,測(cè)試速率1 mm/s,壓縮量50%,壓縮力7 g[12]。
1.3.5 亞硝酸鹽含量測(cè)定
參考GB 5009.33—2016《食品中亞硝酸鹽與硝酸鹽的測(cè)定》。
1.3.6 游離氨基酸含量的測(cè)定
參照文獻(xiàn)[13]方法。
氨基酸提?。喝?0 g泡蘿卜于80 ℃烘干后,置于研缽中研磨溶于25 mL去離子水,超聲處理30 min后離心取上清液待衍生化處理。
衍生:取上清液500 μL,分別加入衍生劑A(精密量取PITC 2 mL,用乙腈定容至10 mL)125 μL和衍生劑B(精密量取三乙胺2 mL,用乙腈定容至10 mL)500 μL,室溫暗處孵育1 h,加1 mL正己烷萃取2 次,每次10 min,吸取下層溶液與20 μL醋酸溶液混合,過0.22 μm濾膜。
色譜條件:C18氨基酸專用分析柱(250 mm×4.6 mm,5 μm),流動(dòng)相A為乙腈-水(4∶1,V/V),流動(dòng)相B為0.1 mol/L乙酸鈉溶液(乙酸調(diào)pH 6.5)-乙腈(97∶3,V/V),流速1 mL/min,檢測(cè)波長254 nm,柱溫36 ℃,進(jìn)樣量20 μL,梯度洗脫:0~11 min,0%~1.5% A,100%~98.5% B;11~21.7 min,1.5%~7.6% A,98.5%~92.4% B;21.7~23.9 min,7.6%~11% A,92.4%~89% B;23.9~39 min,11%~30% A,89%~70% B;39~42 min,30%~70% A,70%~30% B;42~45 min,70%~100% A,30%~0% B;45~52 min,100% A,0% B;52~55 min,100%~0% A,0%~100% B;55~70 min,0% A,100% B。
1.3.7 有機(jī)酸含量測(cè)定
參照文獻(xiàn)[14]方法。
有機(jī)酸提?。喝∫欢ㄙ|(zhì)量泡蘿卜樣品,加等質(zhì)量去離子水混合,制備成勻漿,稱取5 g勻漿于離心管中,4 000 r/min離心15 min,準(zhǔn)確吸取上清液15 mL加入10 mL超純水,于75 ℃超聲處理20 min,再以12 000 r/min離心15 min,上清液經(jīng)0.22 μm濾膜過濾至2 mL進(jìn)樣瓶中待色譜測(cè)定。
色譜條件:C18色譜柱(250 mm×4.6 mm,5 μm),紫外檢測(cè)器,流動(dòng)相A為0.01 mol/L磷酸二氫鉀-水(3∶97,V/V)(pH 2.8),流動(dòng)相B為甲醇,波長為210 nm。
實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS Statistics 25軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,結(jié)果以±s表示;采用Origin 2018軟件進(jìn)行作圖。質(zhì)構(gòu)測(cè)定重復(fù)6 次,其他指標(biāo)分析均重復(fù)3 次。
pH值和總酸含量是泡蘿卜發(fā)酵過程中重要的理化指標(biāo),與泡蘿卜品質(zhì)和微生物生長情況密切相關(guān)[15]。由圖1可知,在發(fā)酵過程中,所有接種發(fā)酵劑蘿卜在發(fā)酵前期pH值顯著下降(P<0.05),總酸含量顯著上升(P<0.05),這與發(fā)酵劑中乳酸菌豐富、在發(fā)酵初期迅速成為優(yōu)勢(shì)菌群而不受其他雜菌影響、產(chǎn)生大量酸有關(guān)[16]。所有泡蘿卜樣品在接種4~7 d pH值趨于穩(wěn)定,這是由于產(chǎn)酸的增加,使乳酸菌的代謝活動(dòng)受到一定的抑制作用[17]。接種發(fā)酵劑1、5、6泡蘿卜在接種6~7 d總酸含量下降,發(fā)酵劑1接種泡蘿卜總酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)降低至(0.43±0.18)%,這是由于高鹽度的發(fā)酵劑的作用會(huì)使蘿卜組織細(xì)胞因滲透作用而脫水,蘿卜中所含有的一些可溶性酸就會(huì)隨著水分進(jìn)入到泡蘿卜水中,導(dǎo)致泡蘿卜的總酸含量降低[18]。當(dāng)泡蘿卜pH<4、總酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)>0.3%時(shí)可認(rèn)為發(fā)酵成熟[19]。由此可見,接種發(fā)酵劑1的泡蘿卜在接種3 d成熟,接種發(fā)酵劑2、4、5、6泡蘿卜在4 d成熟,接種發(fā)酵劑3泡蘿卜在5 d成熟。綜上,6 種發(fā)酵劑接種的泡蘿卜pH值和總酸含量的變化趨勢(shì)相同,且這6 種發(fā)酵劑在發(fā)酵7 d時(shí)對(duì)泡蘿卜的總酸含量的影響差異不顯著(P>0.05)。
圖1 發(fā)酵過程中pH值和總酸含量的變化Fig.1 Changes in pH and total acid content during fermentation
質(zhì)構(gòu)是評(píng)價(jià)泡蘿卜品質(zhì)的重要指標(biāo)之一[20]。本研究從硬度和咀嚼性2 個(gè)指標(biāo)反映泡蘿卜在不同發(fā)酵劑下發(fā)酵過程中質(zhì)構(gòu)的變化。泡蘿卜硬度主要與細(xì)胞壁原果膠成分有關(guān),原果膠不溶于水且有黏著性,能黏連細(xì)胞并使蘿卜組織保持硬脆[21]。由圖2A可知,在發(fā)酵0 d,不同發(fā)酵劑接種泡蘿卜硬度差異不顯著(P>0.05),發(fā)酵劑2接種泡蘿卜硬度(1 085.33±16)g略低于其他實(shí)驗(yàn)組(P>0.05)。發(fā)酵5 d,各實(shí)驗(yàn)組蘿卜硬度下降,其中發(fā)酵劑5接種泡蘿卜硬度下降率為42.05%,其他組下降率在30%左右。發(fā)酵7 d,6 種發(fā)酵劑接種蘿卜硬度差異不顯著(P>0.05),其中發(fā)酵劑3接種泡蘿卜硬度(1 022.67±226)g略高于其他組(P>0.05)。
咀嚼性可以描述食品在口腔中被吞咽所需時(shí)間或咀嚼的次數(shù),與硬度、彈性、凝聚性有關(guān),反映了在咀嚼食物時(shí)牙齒對(duì)外力的抵抗作用[22]。由圖2B可知,發(fā)酵劑1、2、3、4、5接種泡蘿卜咀嚼性先增加后下降最后趨于穩(wěn)定,發(fā)酵劑6接種泡蘿卜咀嚼性先迅速下降后趨于穩(wěn)定。張慧敏等[23]將0.1%直投式發(fā)酵劑(主要菌種為植物乳桿菌550)與純?nèi)樗峄旌习l(fā)酵蘿卜,發(fā)現(xiàn)泡蘿卜咀嚼性有類似的變化趨勢(shì)。不同實(shí)驗(yàn)組在發(fā)酵7 d后咀嚼性不顯著(P>0.05),但發(fā)酵劑6對(duì)泡蘿卜咀嚼性影響最大。
圖2 發(fā)酵過程中硬度(A)和咀嚼性(B)變化Fig.2 Changes in hardness (A) and chewiness (B) during fermentation
飲食中約80%的硝酸鹽來自蔬菜消費(fèi)[24]。由圖3可知,所有發(fā)酵劑接種泡蘿卜亞硝酸鹽含量基本呈先上升后下降再上升的趨勢(shì)(0、4 d和5 d未檢測(cè)到)。在發(fā)酵7 d,發(fā)酵劑5和6接種泡蘿卜顯著低于其他實(shí)驗(yàn)組亞硝酸含量(P<0.05),其中發(fā)酵劑5接種泡蘿卜亞硝酸鹽含量最低,為(1.28±0.2) mg/kg。Xiang Wenliang等[25]的研究表明食竇魏斯氏菌WC018和植物乳桿菌LP067共同接種發(fā)酵在抑制泡菜亞硝酸鹽的形成方面具有協(xié)同作用,這可能是發(fā)酵劑6接種泡蘿卜亞硝酸鹽含量較其他組低的原因。所有實(shí)驗(yàn)組泡蘿卜在發(fā)酵過程中的亞硝酸鹽含量都處于較低水平,其中最高的是發(fā)酵劑3接種的泡蘿卜,在發(fā)酵第6天時(shí),亞硝酸鹽含量為(4.69±0.2)mg/kg。因此,所有實(shí)驗(yàn)組所用發(fā)酵劑都能使泡蘿卜亞硝酸鹽含量在國標(biāo)限量范圍內(nèi)(20 mg/kg)。
圖3 發(fā)酵過程中亞硝酸鹽含量的變化Fig.3 Changes in nitrite content during fermentation
共檢測(cè)了17 種氨基酸,其中包含5 種甜味氨基酸(蘇氨酸、絲氨酸、丙氨酸、甘氨酸和脯氨酸)、3 種鮮味氨基酸(天冬氨酸、谷氨酰胺和谷氨酸)、9 種苦味氨基酸(蛋氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、組氨酸、精氨酸、賴氨酸和纈氨酸)的含量[26]。如表2所示,所有實(shí)驗(yàn)組泡蘿卜甜味氨基酸的總含量在發(fā)酵前期波動(dòng)較大,發(fā)酵后期穩(wěn)定,其中丙氨酸占比最大。接種發(fā)酵劑2的泡蘿卜在發(fā)酵7 d總甜味氨基酸含量顯著高于其他組(P<0.05),其中蘇氨酸含量最高為(0.09±0.03)mg/g。發(fā)酵過程中,所有實(shí)驗(yàn)組天冬氨酸在鮮味氨基酸中占比較低,微生物對(duì)天冬氨酸的利用率較高[27]。所有樣品泡蘿卜中苦味氨基酸總含量在發(fā)酵4 d達(dá)到峰值,在隨后的發(fā)酵過程中逐漸下降。其中苯丙氨酸和酪氨酸都含有苯環(huán),在酶的催化下形成酚類化合物,是重要的風(fēng)味前體物質(zhì)[28-29]。在發(fā)酵第7天時(shí),各實(shí)驗(yàn)組氨基酸總含量差異顯著(P<0.05),發(fā)酵劑6接種泡蘿卜甜味、鮮味、苦味氨基酸含量均偏低,發(fā)酵劑2接種泡蘿卜甜味和鮮味氨基酸顯著高于其他組(P<0.05),其中谷氨酸含量最高,為(0.18±0.01)mg/g。
表2 發(fā)酵過程泡蘿卜中游離氨基酸的含量Table 2 Contents of free amino acids in pickled radish during fermentation
有機(jī)酸是泡蘿卜風(fēng)味和滋味的重要因素[30]。在泡蘿卜發(fā)酵過程中,有機(jī)酸的產(chǎn)生和消耗以及種類由微生物群落的組成和生長環(huán)境所決定[31]。本研究主要分析了8 種有機(jī)酸,包括草酸、蘋果酸、酒石酸、抗壞血酸、乳酸、乙酸、琥珀酸、檸檬酸(表3)。
表3 發(fā)酵過程泡蘿卜有機(jī)酸含量Table 3 Contents of organic acids in pickled radish during fermentation
新鮮蘿卜中草酸含量較高,發(fā)酵劑4接種泡蘿卜在0 d草酸含量高達(dá)(11.74±3.62)mg/g。隨著發(fā)酵時(shí)間的延長,所有泡蘿卜的草酸含量均有下降。發(fā)酵7 d,各實(shí)驗(yàn)組草酸含量差異不顯著(P>0.05),含量最高是發(fā)酵劑3接種泡蘿卜,為(3.64±0.39)mg/g。在發(fā)酵過程中,泡蘿卜酒石酸含量均呈先下降后穩(wěn)定的趨勢(shì),發(fā)酵劑3接種泡蘿卜發(fā)酵7 d后,酒石酸含量最高為(0.10±0.07)mg/g。泡蘿卜抗壞血酸變化趨勢(shì)與酒石酸類似,終含量最高的是接種發(fā)酵劑1的泡蘿卜,達(dá)(0.24±0.02)mg/g。琥珀酸在所有發(fā)酵劑發(fā)酵過程中的含量始終處于低水平,呈下降趨勢(shì)。琥珀酸作為三羧酸循環(huán)的中間產(chǎn)物,參與微生物的代謝過程,除此之外,還會(huì)與亞硝酸鹽進(jìn)行反應(yīng),生成微溶性鹽等,都會(huì)導(dǎo)致其含量的降低[32]。
蘋果酸、乳酸、乙酸和檸檬酸是泡蘿卜發(fā)酵過程含量上升的有機(jī)酸,也是發(fā)酵過程中主要生產(chǎn)有機(jī)酸。乳酸是泡蘿卜中的主要有機(jī)酸,它的產(chǎn)生和積累主要取決于糖的代謝和接種物的底物供應(yīng)[33],在本研究中,乳酸主要是由植物乳桿菌產(chǎn)生。所有實(shí)驗(yàn)組中乳酸含量呈先增加后穩(wěn)定趨勢(shì)。發(fā)酵7 d時(shí),各實(shí)驗(yàn)組之間差異不顯著(P>0.05),其中接種發(fā)酵劑2泡蘿卜所含有的乳酸含量較其他組略高,為(0.19±0.13)mg/g。在發(fā)酵過程中,各實(shí)驗(yàn)組之間乙酸含量差異顯著(P<0.05),尤其是在發(fā)酵后期。發(fā)酵7 d時(shí),發(fā)酵劑1、2、3接種泡蘿卜乙酸含量分別為(2.39±1.25)、(2.1±0.59)、(2.27±0.33)mg/g,而發(fā)酵劑4、5、6接種泡蘿卜乙酸含量在1.4 mg/g左右。根據(jù)Ozcelik等[34]的報(bào)道,在泡菜發(fā)酵過程中,乙酸只由腸系膜乳酸菌產(chǎn)生,植物乳桿菌不產(chǎn)生,而在本研究中,植物乳桿菌和布氏乳桿菌或食竇魏斯氏菌組成的體系均可以產(chǎn)生乙酸,且乙酸濃度顯著高于乳酸(P<0.05)。
發(fā)酵過程中檸檬酸變化趨勢(shì)均為先增加后降低,發(fā)酵劑2接種7 d后檸檬酸含量最高達(dá)(1.11±0.03)mg/g。檸檬酸鹽和葡萄糖果糖、乳糖或木糖在多種乳酸菌的作用下通過醋酸鹽激酶途徑代謝,導(dǎo)致檸檬酸含量逐漸降低[35]。所有實(shí)驗(yàn)泡蘿卜中蘋果酸含量在后期較高,其中發(fā)酵劑1接種泡蘿卜在第5天蘋果酸含量達(dá)到(3.93±0.11)mg/g。發(fā)酵7 d,發(fā)酵劑2接種泡蘿卜蘋果酸含量最高,為(1.31±0.31)mg/g??傊?,發(fā)酵7 d,發(fā)酵劑2接種泡蘿卜有機(jī)酸含量顯著高于其他實(shí)驗(yàn)組(P<0.05),且乳酸、乙酸等關(guān)鍵風(fēng)味物質(zhì)廣泛存在,能給予泡蘿卜良好的風(fēng)味品質(zhì)[12]。
在泡蘿卜發(fā)酵過程中,通過接種發(fā)酵劑,可以使乳酸菌迅速成為優(yōu)勢(shì)菌種,加速泡蘿卜成熟。6 種發(fā)酵劑對(duì)泡蘿卜的基本理化指標(biāo)、質(zhì)構(gòu)特性影響差異不顯著(P>0.05),均能使泡蘿卜亞硝酸鹽含量在國家限量標(biāo)準(zhǔn)內(nèi),但由布氏乳桿菌(68.65%)、植物乳桿菌(28.64%)和毛榛畢赤酵母(99.99%)組成發(fā)酵劑2能使泡蘿卜氨基酸和有機(jī)酸含量顯著高于其他組(P<0.05),賦予泡蘿卜良好的風(fēng)味和營養(yǎng)價(jià)值。在本研究中接種的發(fā)酵劑被稱為“老鹵水”,是在泡菜壇內(nèi)長期厭氧發(fā)酵形成的乳酸菌為主體的復(fù)合菌群[36]。發(fā)酵劑2中所含的植物乳桿菌、布氏乳桿菌是泡蘿卜發(fā)酵過程中的優(yōu)勢(shì)菌群,對(duì)各種風(fēng)味和營養(yǎng)物質(zhì)的產(chǎn)生具有重要的作用。毛榛畢赤酵母是發(fā)酵劑2中的主要真菌,常存在自然發(fā)酵食品中(例如葡萄酒、黃瓜、食用橄欖等)[37]。因此,通過對(duì)發(fā)酵劑2的進(jìn)一步研究有望得到發(fā)高品質(zhì)泡蘿卜專用發(fā)酵劑的發(fā)酵機(jī)制。