夏天爽，劉曉燕，蔣益萍，李曉瑾，王果平，辛海量 （. 海軍軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)系生藥學(xué)教研室，上海 00433；. 新疆維吾爾自治區(qū)中藥民族藥研究所，新疆 烏魯木齊 83000）

骨質(zhì)疏松癥（OP）是一種由骨吸收和骨形成之間的關(guān)系失衡造成，以低骨量和骨組織微結(jié)構(gòu)破壞為特征，導(dǎo)致骨質(zhì)脆性增加和易于骨折的全身性骨代謝疾病。其中，成骨細(xì)胞是骨形成的功能細(xì)胞，在維持骨穩(wěn)態(tài)中起到關(guān)鍵作用[1]。目前，高氧化應(yīng)激相關(guān)的骨丟失已成為骨質(zhì)疏松研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)。有研究表明，細(xì)胞保護(hù)酶是機(jī)體對(duì)抗氧化應(yīng)激狀態(tài)下活性氧（ROS）損傷的主要機(jī)制，其活性主要由轉(zhuǎn)錄因子Nrf2 和FoxO 調(diào)控，而二者所介導(dǎo)的氧化應(yīng)激通路同樣被證實(shí)具有調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞氧化還原平衡以及促進(jìn)骨形成分化的功能[2]。與此同時(shí)，β-淀粉樣蛋白（amyloid β-protein，Aβ）的沉積可使機(jī)體ROS 生成增多，進(jìn)而抑制成骨細(xì)胞的增殖、成骨基質(zhì)的產(chǎn)生及礦化[3]。由此可見，Aβ 沉積偶聯(lián)的氧化損傷是破壞成骨細(xì)胞骨形成，進(jìn)而引發(fā)骨丟失的一大誘因。

啤酒花（Hops,Humulus lupulusL.）為桑科葎草屬多年生草質(zhì)蔓生藤本植物，其雌性球穗花序不僅作為啤酒釀造的添加原料，也是全球廣泛應(yīng)用的植物藥，在歐洲廣泛用于緩解更年期潮熱及絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥[4]。我們前期研究發(fā)現(xiàn)啤酒花能夠促進(jìn)成骨細(xì)胞骨礦化結(jié)節(jié)的形成，降低活性氧水平，并顯著改善APP/PS1 轉(zhuǎn)基因小鼠的骨丟失[5-6]，但其對(duì)外源性Aβ 損傷成骨細(xì)胞的氧化應(yīng)激水平及骨形成的影響尚不明確。此外，我們首次確認(rèn)了氧化應(yīng)激和Aβ 沉積之間的雙向關(guān)聯(lián)，及其在老年性骨質(zhì)疏松癥發(fā)病中的重要作用[7-8]。故本文擬以Aβ 損傷的成骨細(xì)胞為模型，以Nrf2和FoxO1 兩條經(jīng)典氧化應(yīng)激相關(guān)通路為核心，對(duì)啤酒花的抗氧化能力及對(duì)骨形成干預(yù)作用進(jìn)行探究。

1 材料與方法

1.1 藥材及試劑

啤酒花藥材購(gòu)于昌吉市山水啤酒花有限公司（產(chǎn)地：新疆昌吉；批號(hào)：PJH-01），經(jīng)海軍軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)系生藥學(xué)教研室辛海量副教授鑒定為啤酒花Humulus lupulusL.的雌性球穗花序。稱取啤酒花藥材粉末70 g，加入料液比為1∶15 的75%乙醇，回流提取3 次，減壓濃縮干燥成浸膏，HPLC 測(cè)定得浸膏中主要成分黃腐酚含量為0.55%[9]，使用前配制成相應(yīng)濃度（生藥量/ml）的提取液。

其他試劑及廠家：Aβ1-42寡聚體（上海吉爾）；N-乙酰-L-半胱氨酸（NAC，上海碧云天）；胎牛血清（Gibco，美國(guó)）；α-MEM 培養(yǎng)基等細(xì)胞培養(yǎng)試劑（天津?yàn)螅?；堿性磷酸酶（ALP）染色試劑盒（南京建成）；I 型膠原酶（COL-I）、骨橋蛋白（OPN）、核因子-E2-相關(guān)因子（Nrf2）、血紅素加氧酶-1（HO-1）、NAD(P)H：醌氧化還原酶（NQO1）、細(xì)胞叉頭框蛋白O1（FoxO1）、超氧化物歧化酶（SOD-2）抗體（Abcam，英國(guó)）。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及原代成骨細(xì)胞分離培養(yǎng)

新生24 h Wistar 大鼠，購(gòu)自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司[合格證號(hào)：2013001831722；許可證號(hào)：SYXK（滬）2017-0004]。所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均符合實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理學(xué)要求。采用二次消化法從新生大鼠顱蓋骨分離得到原代成骨細(xì)胞，用含10%胎牛血清的α-MEM 培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)，取3～4 代成骨細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)分析。

1.3 成骨細(xì)胞增殖及堿性磷酸酶檢測(cè)

取3～4 代成骨細(xì)胞計(jì)算其數(shù)目，配制成細(xì)胞濃度為1×104個(gè)/ml 細(xì)胞懸液接種于96 孔板，根據(jù)前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果[9]設(shè)置分組：空白對(duì)照組，模型組（40 μmol/L Aβ），陽性對(duì)照組（NAC, 2.5 mmol/L），啤酒花提取物低劑量組（HLE, 4 μg/ml）、中劑量組（HLE, 20 μg/ml）、高劑量組（HLE, 100 μg/ml），每組設(shè)置4 個(gè)復(fù)孔。24 h 后按照上述分組更換為含藥培養(yǎng)液。給藥48 h 后采用MTT 法檢測(cè)成骨細(xì)胞的增殖情況。

取3～4 代成骨細(xì)胞計(jì)算其數(shù)目，配制成細(xì)胞濃度為5×104個(gè)/ml 細(xì)胞懸液接種于24 孔板。24 h后分別更換為含藥培養(yǎng)液（給藥濃度同上）。培養(yǎng)過程中每3 d 更換1 次含藥培養(yǎng)液。第8 天裂解細(xì)胞，收集細(xì)胞裂解液，于4 ℃、13 800×g離心5 min。用對(duì)硝基苯磷酸二鈉法測(cè)定細(xì)胞ALP 活性[10]。參照ALP 染色試劑盒說明書對(duì)成骨細(xì)胞進(jìn)行染色。

1.4 成骨細(xì)胞凋亡檢測(cè)

取3～4 代成骨細(xì)胞計(jì)算其數(shù)目，配制成細(xì)胞濃度為2×105個(gè)/ml 細(xì)胞懸液接種于6 孔板。24 h后分別更換為含藥培養(yǎng)液（給藥濃度同上）。給藥48 h后收集各孔中培養(yǎng)基上清液，加入200 μl 0.25%胰蛋白酶消化30 s，離心并重懸，參照凋亡檢測(cè)試劑盒裝載探針，室溫避光孵育5 min 后，用流式細(xì)胞儀進(jìn)行凋亡率檢測(cè)。

1.5 蛋白質(zhì)印跡檢測(cè)

取3～4 代成骨細(xì)胞接種于6 孔板，24 h 后分別更換為含藥培養(yǎng)液（給藥濃度同上）。給藥48 h后進(jìn)行細(xì)胞裂解，提取細(xì)胞總蛋白，根據(jù)BCA 試劑盒進(jìn)行蛋白定量。蛋白變性后進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，轉(zhuǎn)膜、封閉后，分別加入COL-I、OPN、Nrf2、HO-1、NQO1、FoxO1 及SOD-2 抗體，4 ℃孵育過夜。用洗膜緩沖液（Trisbuffered saline/Tween-20，TBST）洗膜3×10 min，加入二抗，室溫孵育30 min。用TBST 再次洗膜3×10 min，采用ECL 試劑進(jìn)行檢測(cè)。采用Tanon Image軟件對(duì)蛋白印跡進(jìn)行半定量分析。

1.6 免疫熒光檢測(cè)

取3～4 代成骨細(xì)胞配制成濃度為2×104個(gè)/ml細(xì)胞懸液接種于無菌激光共聚焦皿中。24 h 后分別更換為含藥培養(yǎng)液（Aβ, 40 μmol/L HLE, 100 μg/ml）。給藥48 h 后用4%的多聚甲醛固定細(xì)胞30 min，PBS 浸洗后用0.5% Triton X-100（PBS 配制）通透20 min，并用5% BSA 封閉液室溫封閉1 h。先后加入FoxO1 抗體及熒光二抗（TRITC 標(biāo)記山羊抗兔抗體）進(jìn)行孵育，加入DAPI 染液避光孵育10 min進(jìn)行染核。最后洗去多余的DAPI 染液，加入少量PBS 使細(xì)胞保持濕潤(rùn)，并置于熒光顯微鏡下觀察采集圖像。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 啤酒花提取物促進(jìn)Aβ 損傷成骨細(xì)胞增殖，提高ALP 活性

如圖1A 所示，與空白組相比，Aβ 損傷成骨細(xì)胞后，其增殖能力顯著降低。藥物治療后，低、中、高劑量的啤酒花提取物均可顯著促進(jìn)Aβ 損傷成骨細(xì)胞的增殖。另一方面，與空白組比，Aβ 顯著降低了成骨細(xì)胞的ALP 活性，而啤酒花提取物顯著逆轉(zhuǎn)了Aβ 損傷成骨細(xì)胞的ALP 活性，促進(jìn)成骨細(xì)胞的分化（圖1B-C）。

圖1 啤酒花提取物對(duì)Aβ 損傷成骨細(xì)胞增殖（A）及ALP 活性（B-C）的影響（n=4）

2.2 啤酒花提取物抑制Aβ 損傷成骨細(xì)胞凋亡

如圖2 所示，與空白組相比，Aβ 損傷提高了成骨細(xì)胞的凋亡率，而啤酒花提取物（20，100 μg/ml）可顯著抑制Aβ 損傷成骨細(xì)胞的凋亡。提示啤酒花提取物對(duì)Aβ 誘導(dǎo)的成骨細(xì)胞具有較強(qiáng)的抗凋亡作用。

圖2 啤酒花提取物對(duì)Aβ 損傷成骨細(xì)胞凋亡的影響（n=3）

2.3 啤酒花提取物促進(jìn)Aβ 損傷成骨細(xì)胞中骨形成相關(guān)蛋白表達(dá)

如圖3 所示，Aβ 損傷成骨細(xì)胞后，細(xì)胞中骨形成相關(guān)蛋白COL-I 和OPN 的表達(dá)顯著降低。給予啤酒花提取物（20，100 μg/ml）干預(yù)后，COL-I 及OPN 的表達(dá)顯著增加，提示啤酒花可顯著促進(jìn)Aβ 損傷成骨細(xì)胞的骨形成。

圖3 啤酒花提取物對(duì)Aβ 損傷成骨細(xì)胞中COL-I 及OPN 表達(dá)的影響（n=3）

2.4 啤酒花提取物調(diào)節(jié)Nrf2 氧化應(yīng)激通路

采用Western blot 分析Aβ 和啤酒花提取物對(duì)成骨細(xì)胞中Nrf2 及其下游抗氧化酶HO-1 和NQO1的影響。結(jié)果顯示，Aβ 顯著抑制了成骨細(xì)胞中Nrf2 及其下游蛋白HO-1 和NQO1 的表達(dá)；而低、中、高劑量的啤酒花提取物均可顯著促進(jìn)Aβ 損傷成骨細(xì)胞中Nrf2、HO-1 及NQO1 的表達(dá)（圖4），提示其能夠通過介導(dǎo)Nrf2 信號(hào)通路發(fā)揮抗氧化作用。

圖4 啤酒花提取物對(duì)Aβ 損傷成骨細(xì)胞中Nrf2、HO-1 及NQO1 表達(dá)的影響（n=3）

2.5 啤酒花提取物調(diào)節(jié)FoxO1 抗氧化通路

采用免疫熒光及Western blot 分析Aβ 和啤酒花提取物對(duì)成骨細(xì)胞中FoxO1 信號(hào)通路的影響。結(jié)果顯示，與空白組相比，Aβ 顯著降低了成骨細(xì)胞中的FoxO1 含量，而啤酒花提取物（100 μg/ml）可顯著下調(diào)FoxO1 的表達(dá)，且使其更多聚集在細(xì)胞核內(nèi)（圖5A）。此外，啤酒花提取物（4、20、100 μg/ml）還可顯著促進(jìn)Aβ 損傷成骨細(xì)胞中FoxO1 及其下游蛋白SOD-2 的表達(dá)，提示啤酒花能夠通過介導(dǎo)FoxO1 信號(hào)通路發(fā)揮抗氧化作用。

圖5 啤酒花提取物對(duì)Aβ 損傷成骨細(xì)胞中FoxO1 及SOD-2 表達(dá)的影響（n=3）

3 討論

成骨細(xì)胞是骨形成的主要功能細(xì)胞，在骨形成過程中經(jīng)歷增殖、分化、礦化和凋亡四個(gè)階段。其中，成骨細(xì)胞的增殖水平反映骨形成的強(qiáng)弱，其分泌的ALP 是成骨細(xì)胞分化階段的關(guān)鍵酶[11]，可介導(dǎo)骨組織礦化。在骨形成相關(guān)蛋白中，COL-I 是骨細(xì)胞外基質(zhì)的主要成分之一，約占骨總蛋白的80%[12]，而OPN 是一種骨基質(zhì)糖蛋白，能夠促進(jìn)成骨細(xì)胞的黏附和分化[13]，二者均為成骨細(xì)胞分化成熟的標(biāo)志。此外，Aβ 沉積會(huì)引起機(jī)體的氧化損傷，在骨代謝中可降低骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞的分化，破壞成骨細(xì)胞的活性和功能，抑制骨形成[14]。我們前期研究同樣發(fā)現(xiàn)過量的Aβ 在聚集過程中會(huì)產(chǎn)生大量的活性氧，使機(jī)體處于高氧化應(yīng)激狀態(tài)，反過來又刺激Aβ 產(chǎn)生和聚集，形成Aβ 與氧化損傷相偶聯(lián)[15]。該機(jī)制在老年性骨質(zhì)疏松癥發(fā)病中處于特別重要的位置，并受到學(xué)界關(guān)注[16]。本研究中，啤酒花提取物可顯著逆轉(zhuǎn)Aβ 損傷所致的成骨細(xì)胞增殖水平下降、ALP 活性降低，以及COL-I 和OPN的低表達(dá)，表明其可顯著促進(jìn)成骨細(xì)胞的成熟分化；并抑制Aβ 損傷成骨細(xì)胞的凋亡，表明其可顯著改善Aβ 沉積所致成骨細(xì)胞的活性損傷，促進(jìn)骨形成，在維持骨穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮重要作用。

Nrf-2 信號(hào)通路是典型的抗氧化通路，能夠拮抗各種原因引起的氧化應(yīng)激。激活Nrf2 信號(hào)通路不僅能夠抑制氧化損傷成骨細(xì)胞的凋亡，促進(jìn)骨形成[17]，而且能夠拮抗Aβ 誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷[18-19]。應(yīng)激狀態(tài)下，Nrf-2 轉(zhuǎn)移入核內(nèi)，與基因中的抗氧化反應(yīng)元件結(jié)合，啟動(dòng)下游Ⅱ相代謝酶基因的表達(dá)和轉(zhuǎn)錄，以增加細(xì)胞對(duì)氧化應(yīng)激的抵抗作用，使細(xì)胞免于凋亡[20]。FoxO1 為調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞氧化還原平衡和成骨功能的主要轉(zhuǎn)錄因子，其入核可激活下游SOD-2 抗氧化酶，調(diào)控細(xì)胞內(nèi)的氧化還原平衡，并促進(jìn)成骨細(xì)胞的增殖與分化，在骨代謝中同樣發(fā)揮著重要作用[20]。本研究結(jié)果表明，啤酒花可激活A(yù)β 損傷成骨細(xì)胞的Nrf-2 和FoxO1 信號(hào)通路，促進(jìn)該氧化應(yīng)激信號(hào)通路中相關(guān)蛋白的表達(dá)，增加成骨細(xì)胞對(duì)氧化應(yīng)激的抵抗作用，使其免于凋亡，進(jìn)而促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖與分化。提示啤酒花具有通過抗氧化而調(diào)控骨代謝、維持骨穩(wěn)態(tài)之應(yīng)用潛力。