吡嗪酰胺酶活性與耐多藥肺結(jié)核近期臨床療效的相關(guān)性研究

吳碧彤 蔡杏珊 鄺浩斌 劉志輝 孟繁榮 王楠 高俊文 譚守勇

吡嗪酰胺(pyrazinamide)是唯一具有殺滅酸性環(huán)境中或巨噬細(xì)胞內(nèi)半休眠狀態(tài)結(jié)核分枝桿菌效果的抗結(jié)核藥品，其可顯著縮短初治肺結(jié)核的治療療程，提升治愈率。隨著吡嗪酰胺在結(jié)核病治療領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用，其耐藥率明顯上升[1]。吡嗪酰胺耐藥率上升給耐多藥肺結(jié)核(multidrug-resistant pulmonary tuberculosis，MDR-PTB)的治療帶來不利影響，但現(xiàn)階段吡嗪酰胺的藥物敏感性試驗(簡稱“藥敏試驗”)存在諸多缺陷，如陽性率低、檢測周期長、檢測重復(fù)性差等[2]。由于吡嗪酰胺僅在pH值為5.5的酸性條件下才能轉(zhuǎn)化為具有殺菌活性的吡嗪酸，而結(jié)核分枝桿菌在酸性環(huán)境下生長不良，使傳統(tǒng)藥物敏感性檢測方法不能可靠地反映菌株對吡嗪酰胺的耐藥情況，進(jìn)而導(dǎo)致吡嗪酰胺耐藥性檢測成為實驗室檢查的一個難題。吡嗪酰胺的殺菌作用是在吡嗪酰胺酶的作用下轉(zhuǎn)化為有活性的吡嗪酸，吡嗪酸能夠?qū)Y(jié)核分枝桿菌產(chǎn)生殺滅作用。有研究發(fā)現(xiàn)，吡嗪酰胺耐藥菌株的出現(xiàn)可能與吡嗪酰胺酶的活性喪失有關(guān)，吡嗪酰胺酶失活將導(dǎo)致吡嗪酰胺無法轉(zhuǎn)變?yōu)檫拎核幔M(jìn)而無法實現(xiàn)殺滅結(jié)核分枝桿菌的效果[3-4]。為明確吡嗪酰胺酶活性檢測是否有利于指導(dǎo)MDR-PTB患者使用吡嗪酰胺進(jìn)行治療，本研究采用前瞻性的研究方法，分析了吡嗪酰胺酶活性、吡嗪酰胺表型耐藥與MDR-PTB近期臨床療效的相關(guān)性。

資料和方法

一、研究對象

本研究經(jīng)廣州市胸科醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)(批準(zhǔn)編號：胸醫(yī)倫理〔2017〕26號)，患者知情并同意研究的內(nèi)容。研究將廣州市胸科醫(yī)院2018年7月1日至2019年12月31日收治的85例MDR-PTB患者作為研究對象。其中，男性54例，女性31例；年齡23～57歲，平均年齡(38.6±7.4)歲；73例并發(fā)空洞。剔除9例丟失、中斷治療、失訪患者，最終76例納入研究。76例患者中，病灶位于左側(cè)9例，右側(cè)17例，雙側(cè)50例；67例患者并發(fā)空洞。

二、納入、排除及退出標(biāo)準(zhǔn)

1. 納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)符合《WHO耐藥結(jié)核病治療指南(2016更新版)》[5]中關(guān)于耐多藥結(jié)核病的診斷標(biāo)準(zhǔn)；(2)年齡18～65歲；(3)治療前痰培養(yǎng)為陽性，并獲得一二線抗結(jié)核藥物藥敏試驗結(jié)果；(4)患者同意抗結(jié)核治療并簽署參與項目同意書。

2. 排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)存在二線注射類抗結(jié)核藥品(卡那霉素、阿米卡星、卷曲霉素)耐藥和(或)氟喹諾酮類藥品(氧氟沙星、左氧氟沙星、莫西沙星)耐藥；(2)合并嚴(yán)重肝病[如丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)或天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)≥2.5倍正常值]；(3)合并腎病史(如血肌酐>177 μmol/L)；(4)合并精神疾病史；(5)孕婦及糖尿病患者；(6)合并塵肺病史；(7)HIV抗體陽性；(8)長期使用免疫抑制劑；(9)嚴(yán)重營養(yǎng)不良。

3. 退出標(biāo)準(zhǔn)：(1)因藥物不良反應(yīng)而更改治療方案；(2)中斷治療≥2個月；(3)失訪。

三、研究方法

2. 治療方法：所有患者均給予WHO推薦的耐多藥結(jié)核病治療方案(6Am-Mfx-PZA-Pto-Cs/18Mfx-PZA-Pto-Cs)進(jìn)行治療。具體用藥方法：阿米卡星0.4 g/次，1次/d，肌內(nèi)注射或靜脈注射；莫西沙星0.4 g/次，1次/d，口服；吡嗪酰胺1.5 g/次，1次/d，口服；丙硫異煙胺0.2 g/次，3次/d，口服；環(huán)絲氨酸0.25 g/次，2次/d，口服。治療期間對患者進(jìn)行隨訪跟蹤，每個月進(jìn)行復(fù)查，包括3次痰涂片找抗酸桿菌、1次痰結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)，記錄患者每個月的痰菌情況及藥物不良反應(yīng)發(fā)生情況；每2個月行1次胸部X線攝片檢查，記錄病灶變化情況。

3. 吡嗪酰胺酶活性檢測：采用Wayne法檢測，將2.35 g 7H9肉湯培養(yǎng)基，450 ml超純水，2 ml甘油，400 μg/ml 吡嗪酰胺，1.5%瓊脂糖混勻高壓滅菌，分裝5 ml于滅菌管中，保持管直立，備用。從羅氏培養(yǎng)基上刮取盡可能多的生長良好的細(xì)菌，分別接種于2個培養(yǎng)管中，于37 ℃培養(yǎng)，其中一管培養(yǎng)7 d，另一管培養(yǎng)14 d。培養(yǎng)7 d后取出一管加入1 ml 1%的硫酸亞鐵氨(現(xiàn)用現(xiàn)配)，于4 ℃冰箱內(nèi)放置4 h后取出，在日光燈下，以白紙作為背景，通過肉眼觀察培養(yǎng)管中的顏色變化，結(jié)果至少經(jīng)過2名研究者確認(rèn)。結(jié)果判讀：透明培養(yǎng)管中出現(xiàn)紅色條帶者(各種程度)，即為吡嗪酰胺酶陽性；如無紅色條帶，14 d后取出第二管，依上法進(jìn)行測定，如仍無紅色條帶即為吡嗪酰胺酶陰性。

4. 吡嗪酰胺藥物敏感性檢測：采用BACTEC MGIT 960系統(tǒng)法，取結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)物，制備1 mg/ml 菌懸液，稀釋到106CFU/L，取0.5 ml菌懸液加入至吡嗪酰胺藥敏試驗專用MGIT培養(yǎng)管中(含吡嗪酰胺添加劑，藥物濃度100 μg/ml)；以菌懸液1∶10的比例稀釋加入至吡嗪酰胺藥敏專用MGIT培養(yǎng)管中(生長對照管；不含吡嗪酰胺)。然后置于BACTEC MGIT 960儀器中，儀器根據(jù)分枝桿菌生長情況自動報告藥敏試驗結(jié)果。

5. 療效評估：比較MDR-PTB患者治療2、4、6個月末痰菌陰轉(zhuǎn)、病灶吸收和空洞閉合情況。

1)痰菌陰轉(zhuǎn)：采集患者痰液，痰液涂片檢查抗酸桿菌3次，結(jié)果均呈陰性，視為痰菌陰轉(zhuǎn)。

2)病灶吸收：(1)顯著吸收：病灶吸收≥1/2原病灶；(2)吸收：病灶吸收<1/2原病灶；(3)不變：病灶無明顯變化；(4)惡化：病灶擴(kuò)大。吸收率(%)=(顯著吸收例數(shù)+吸收例數(shù))/總例數(shù)×100%。

3)空洞閉合：(1)閉合：空洞閉合或阻塞閉合；(2)縮小：空洞縮小≥原空洞直徑的1/2；(3)不變：空洞縮小或增大<原空洞直徑的1/2；(4)增大：空洞增大>原空洞直徑的1/2?？斩撮]合有效率(%)=(閉合例數(shù)+縮小例數(shù))/總例數(shù)×100%。

4)不良反應(yīng)：包含胃腸道不良反應(yīng)、腎功能損傷、肝損傷、神經(jīng)系統(tǒng)損傷、疲勞等。

四、統(tǒng)計學(xué)處理

結(jié) 果

一、基線資料的比較

76例患者中，根據(jù)吡嗪酰胺藥敏試驗結(jié)果分為吡嗪酰胺耐藥(36例，47.4%)和吡嗪酰胺敏感(40例，52.6%)；根據(jù)吡嗪酰胺酶活性檢測結(jié)果，分為吡嗪酰胺酶陽性(32例，42.1%)和吡嗪酰胺酶陰性(44例，57.9%)；吡嗪酰胺藥物敏感性檢測與吡嗪酰胺酶活性檢測診斷結(jié)果一致性較高(Kappa=0.687)。吡嗪酰胺酶陽性與吡嗪酰胺酶陰性患者基線資料的比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P值均>0.05)。見表1。

表1 不同臨床特征在吡嗪酰胺酶陽性和陰性患者中的分布情況

二、吡嗪酰胺酶陽性與治療結(jié)果的關(guān)系

吡嗪酰胺酶陽性患者治療4個月末病灶吸收率及空洞閉合有效率均高于吡嗪酰胺酶陰性患者，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P值均<0.05)；吡嗪酰胺酶陽性患者治療6個月末空洞閉合有效率高于吡嗪酰胺酶陰性患者，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；兩組患者在治療2、4及6個月末痰菌陰轉(zhuǎn)率的比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P值均>0.05)；兩組患者在治療2、4及6個月末藥物不良反應(yīng)發(fā)生率的比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P值均>0.05)。見表2～5。

表2 吡嗪酰胺酶活性與耐多藥肺結(jié)核患者治療后不同時間點(diǎn)痰菌陰轉(zhuǎn)情況的比較[例(陰轉(zhuǎn)率，%)]

三、藥物不良反應(yīng)發(fā)生情況

吡嗪酰胺酶陽性患者在治療2個月末有3例患者出現(xiàn)藥物性肝損傷，經(jīng)護(hù)肝治療后好轉(zhuǎn)；1例出現(xiàn)尿酸升高，無關(guān)節(jié)疼痛表現(xiàn)，調(diào)整低尿酸飲食后好轉(zhuǎn)；治療4個月末有2例患者出現(xiàn)手足末端指關(guān)節(jié)麻木感，考慮為環(huán)絲氨酸導(dǎo)致的神經(jīng)毒性，加用維生素B6(200 mg/次，3次/d)治療后癥狀好轉(zhuǎn)；治療6個月末有1例患者出現(xiàn)聽力下降，考慮為阿米卡星引起的不良反應(yīng)，在強(qiáng)化期結(jié)束，停用阿米卡星后，患者聽力恢復(fù)。

表3 吡嗪酰胺酶活性與耐多藥肺結(jié)核患者治療后不同時間點(diǎn)病灶吸收情況的比較[例(吸收率，%)]

表4 吡嗪酰胺酶活性與耐多藥肺結(jié)核患者治療后不同時間點(diǎn)空洞閉合有效情況的比較[例(有效率，%)]

表5 吡嗪酰胺酶活性與耐多藥肺結(jié)核患者治療后不同時間點(diǎn)不良反應(yīng)發(fā)生情況的比較[例(發(fā)生率，%)]

吡嗪酰胺酶陰性患者在治療2個月末有1例出現(xiàn)藥物性肝損傷，經(jīng)護(hù)肝治療后好轉(zhuǎn)；2例出現(xiàn)尿酸升高，伴關(guān)節(jié)疼痛表現(xiàn)，給予別嘌呤醇治療后尿酸有所下降；2例出現(xiàn)胃腸道不良反應(yīng)，在調(diào)整為餐后服藥后癥狀有所緩解；治療4個月末有1例患者出現(xiàn)明顯疲乏的癥狀，加用維生素B6治療后癥狀好轉(zhuǎn)；另有1例出現(xiàn)尿酸升高，經(jīng)控制飲食后好轉(zhuǎn)。治療6個月末有2例患者出現(xiàn)聽力下降，停用阿米卡星后聽力恢復(fù)；2例患者出現(xiàn)促甲狀腺激素升高，經(jīng)減少丙硫異煙胺用量后，促甲狀腺激素降至正常水平。

討 論

吡嗪酰胺是抗結(jié)核化學(xué)治療的重要藥品，是唯一可在酸性環(huán)境中殺滅半休眠狀態(tài)結(jié)核分枝桿菌的藥品，可縮短抗結(jié)核治療療程。Njire等[6]研究發(fā)現(xiàn)，吡嗪酰胺在原發(fā)性MDR-PTB患者治療的預(yù)后優(yōu)于未使用吡嗪酰胺的患者，且遠(yuǎn)期復(fù)發(fā)率低于未使用吡嗪酰胺的患者。吡嗪酰胺與氟喹諾酮類藥物及異煙肼聯(lián)合使用可提升殺菌活性[7]。WHO于2016年制定的《WHO耐藥結(jié)核病治療指南(2016更新版)》[5]建議，耐多藥結(jié)核病患者治療的強(qiáng)化期至少選用包括吡嗪酰胺和4種核心的二線抗結(jié)核藥品。Shi 等[8]提出，吡嗪酰胺本身并無抗菌活性，其可被動擴(kuò)散進(jìn)入結(jié)核分枝桿菌內(nèi)，通過破壞跨膜質(zhì)子濃度，影響膜的能量代謝及膜的運(yùn)輸能力，引發(fā)細(xì)菌死亡。Khan等[9]和Bouzouita等[10]的研究發(fā)現(xiàn)，吡嗪酸可綁定對結(jié)核分枝桿菌至關(guān)重要的核糖體蛋白S1(RpsA)，抑制其與tmRNA之間的結(jié)合，阻止DNA編碼蛋白途徑，抑制維系結(jié)核病生存的蛋白，實現(xiàn)抑菌的功效，吡嗪酰胺耐藥菌株與吡嗪酰胺酶活性喪失密切相關(guān)。因此，吡嗪酰胺酶活性可作為吡嗪酰胺在耐多藥結(jié)核病療效評估中的重要指標(biāo)。

隨著吡嗪酰胺的廣泛應(yīng)用，其耐藥情況也日漸嚴(yán)重。車洋等[11]對浙江省寧波地區(qū)的110株耐多藥結(jié)核分枝桿菌菌株吡嗪酰胺耐藥性進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)耐藥率高達(dá)59.09%，且耐多藥結(jié)核分枝桿菌菌株的吡嗪酰胺耐藥性與鏈霉素、乙胺丁醇、氧氟沙星、左氧氟沙星的耐藥性密切相關(guān)。Yee等[12]對218例耐多藥結(jié)核病患者進(jìn)行的研究發(fā)現(xiàn)，單耐吡嗪酰胺治愈率低于全敏感患者，復(fù)發(fā)率及死亡率高于全敏感患者。筆者前期對120例MDR-PTB患者采用WHO推薦的含吡嗪酰胺的治療方案，截至24個月的隨訪研究發(fā)現(xiàn)，吡嗪酰胺敏感的耐多藥結(jié)核病患者的病灶吸收率高于吡嗪酰胺耐藥的患者；吡嗪酰胺敏感的耐多藥結(jié)核病患者的痰菌陰轉(zhuǎn)率高于吡嗪酰胺耐藥的患者，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義[13]。

目前，傳統(tǒng)吡嗪酰胺表型藥敏試驗存在諸多缺陷，包括檢測陽性率低、檢測周期長及不同實驗室的檢測結(jié)果一致性較差等。由于對吡嗪酰胺敏感的結(jié)核分枝桿菌可產(chǎn)生吡嗪酰胺酶，其可將吡嗪酰胺分解為有活性功能的吡嗪酸，而耐吡嗪酰胺者則缺少此酶。因此，測定吡嗪酰胺酶活性代替吡嗪酰胺藥物敏感性檢測可能是一種有效的篩選方法，本研究結(jié)果也顯示吡嗪酰胺表型藥敏試驗與吡嗪酰胺酶活性檢測方法的診斷結(jié)果一致性較高。檢測吡嗪酰胺酶活性的常見方法為Wayne 法，Wayne法陰性被認(rèn)為吡嗪酰胺酶無活性，結(jié)核分枝桿菌對吡嗪酰胺耐藥。本研究顯示，吡嗪酰胺酶陽性患者在治療4個月末的病灶吸收率及空洞閉合有效率，以及治療6個月末的空洞閉合有效率均高于吡嗪酰胺酶陰性患者，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義；但是兩組患者在治療2、4及6個月末痰菌陰轉(zhuǎn)率的比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義?？紤]結(jié)核空洞的形成可導(dǎo)致局部低氧環(huán)境及酸性環(huán)境的改變，均可增強(qiáng)吡嗪酰胺的活性，且方案中包含了氟喹諾酮類藥物，吡嗪酰胺與氟喹諾酮類藥物有協(xié)同殺菌作用，可增強(qiáng)療效，研究結(jié)果顯示治療2個月末吡嗪酰胺酶陽性患者的空洞閉合有效率雖較吡嗪酰胺酶陰性患者有所升高，但未達(dá)到有統(tǒng)計學(xué)意義的標(biāo)準(zhǔn)，考慮可能與本研究患者例數(shù)少，且影像學(xué)上吸收改變存在延遲有關(guān)。但總體仍說明對吡嗪酰胺敏感的MDR-PTB患者治療效果優(yōu)于對吡嗪酰胺耐藥的MDR-PTB患者，與文獻(xiàn)[14-16]的研究結(jié)論較為符合。

本研究的局限性在于，研究樣本量較小，且為非多中心研究，可能對研究結(jié)果產(chǎn)生偏倚。同時由于在進(jìn)行此項研究時，利奈唑胺、貝達(dá)喹啉等藥物在本院未能獲得有效供應(yīng)，因此所采用的是WHO早先提出的耐多藥結(jié)核病治療方案，而非近年的治療方案。對吡嗪酰胺酶活性檢測法為生化顯色反應(yīng)，檢測結(jié)果的判讀會存在主觀性誤判的可能，且吡嗪酰胺酶活性檢測法要求檢測樣本新鮮和樣本量大，如樣本不符合要求可能會導(dǎo)致無紅色條帶出現(xiàn)，從而導(dǎo)致結(jié)果的誤判。此外，由于研究時間較短，本研究中MDR-PTB患者療效均為強(qiáng)化期后進(jìn)行的評估，未納入鞏固期療效數(shù)據(jù)，吡嗪酰胺敏感性及吡嗪酰胺酶活性對遠(yuǎn)期療效的影響值得進(jìn)一步探討。吡嗪酰胺耐藥性與pncA基因突變關(guān)聯(lián)密切[17-19]，但是吡嗪酰胺酶活性與pncA基因突變的關(guān)聯(lián)尚未明確，本研究并未對全部患者的耐藥菌株進(jìn)行基因檢測，故上述基因誘發(fā)吡嗪酰胺酶活性的確切關(guān)聯(lián)還要留待后續(xù)研究加以明確。