陳 浩 林銜亮 溫福利 薛來恩 陳 璟 李林睿 吳曉娟 林涯澤 楊 燊

(1.中國人民解放軍聯(lián)勤保障部隊第900醫(yī)院心血管內(nèi)科，福州 350025)(2.中國人民解放軍聯(lián)勤保障部隊第900醫(yī)院基礎(chǔ)醫(yī)學實驗室，福州 350025)(3.中國人民解放軍聯(lián)勤保障部隊第900醫(yī)院護理部，福州 350025)(4.廈門大學附屬東方醫(yī)院，福州 350025)(5.福建醫(yī)科大學福州總院臨床醫(yī)學院，福州 350025)

肺動脈高壓(pulmonary arterial hypertension，PAH)是一種嚴重且致命的疾病，指靜息時肺動脈平均壓力(mPAP)大于25 mmHg或運動時大于30 mmHg者。根據(jù)葛均波等[1]指出，該病特點是肺動脈壓升高和肺的病理改變，如內(nèi)皮損傷、肺血管平滑肌細胞增殖和遷移所導(dǎo)致的肺血管腔減小，以及最終伴發(fā)的右心室肥厚和終末期心臟衰竭。盡管常規(guī)療法有顯著進步，預(yù)后卻仍不理想，PAH至今仍缺乏高效特異性的治療方法。2012年，Chen等[2]率先提出肺動脈去神經(jīng)術(shù)(PADN)治療PAH，相關(guān)組織的動物實驗及臨床研究證實該治療的安全性和療效。傳統(tǒng)熱消融手術(shù)時間較長，且疼痛感強，術(shù)后需要抗凝，存在一定的短板。近年來，蓬勃發(fā)展的房顫冷凍球囊消融術(shù)，以其時限較短、痛苦小、術(shù)后無需抗栓等優(yōu)點，獲得了較好的臨床效果。這給肺動脈去交感神經(jīng)提供了一個全新的思路。因此，本研究旨在評估冷凍球囊消融去肺動脈神經(jīng)術(shù)治療PAH的療效。

1 材料和方法

1.1 材料

15只普通級成年比格犬，體質(zhì)量(10±1)kg，雄性，購自福州振和實驗動物技術(shù)開發(fā)有限公司，實驗動物生產(chǎn)許可證號：SCXK(閩)2018-0001，實驗動物合格證號：1108392011000026。動物飼養(yǎng)于聯(lián)勤保障部隊第九○○醫(yī)院實驗動物中心，環(huán)境設(shè)施合格證：SYXK(閩)2018-0005，正常飲食，自由飲水。動物福利和實驗過程均遵循聯(lián)勤保障部隊第九○○醫(yī)院實驗動物福利倫理委員會的相關(guān)規(guī)定，實驗動物倫理審查編號：2020-040。

將動物應(yīng)用隨機數(shù)字表法分為三組，每組5只。A組為冷凍消融組；B組為假手術(shù)組；C組為對照組。

主要試劑及儀器：野百合堿(CAS：315-22-0)，購自江蘇艾康生物醫(yī)藥研發(fā)有限公司，貨號：YRY091-20 mg；二甲基酰甲酰胺(FISHER)購自廣州市信洪貿(mào)易有限公司，規(guī)格：022915-1L；犬內(nèi)皮素-1，購自上海博湖生物科技有限公司，批號：BH-ELISA4294；電生理記錄儀(1.035)，購自Biosense Webster；辣根過氧化物酶(CAS:9003-99-0)，購自南京都萊生物技術(shù)有限公司，貨號：M413470，規(guī)格：Roche413470 10 mg。

1.2 方法

1.2.1PAH犬模型建立:戊巴比妥30 mg/kg腹腔注射麻醉，動物自主呼吸。按照Mattocks等[3]方法對野百合堿進行脫氫處理，脫氫后溶解在0.1 mL/kg的二甲基酰(Aldrich Milwaukee，WI)中備用。在進行血流動力學測定后，將脫氫野百合堿(3 mg/kg)注入右心室，8周后重復(fù)血流動力學測定。

Seldinger法穿刺左股靜脈，置入動脈鞘，經(jīng)動脈鞘送入5F Swan-Ganz漂浮導(dǎo)管至右心房、右心室及肺動脈，測定血流動力學參數(shù)包括中心靜脈壓、右房壓、右室壓、肺動脈壓及肺毛細血管楔嵌壓。經(jīng)股動脈穿刺測定系統(tǒng)血壓。以熱稀釋法測定心輸出量，肺血管阻力由平均肺動脈壓除以心指數(shù)計算所得。使用Biosense Webster 1.035電生理記錄儀監(jiān)測壓力和心輸出量。

1.2.2冷凍球囊消融去肺動脈神經(jīng)術(shù):①20～30 mg/kg 的劑量靜脈注射3%戊巴比妥鈉溶液以麻醉實驗用犬，0.04 mg/kg 的劑量肌注硫酸阿托品注射液。在動物房麻醉后，送到導(dǎo)管室，犬取仰臥位，頭部及四肢固定于手術(shù)臺上。備皮后，行心電圖及動脈血壓監(jiān)測；②選取犬雙側(cè)股靜脈為穿刺血管入路。備皮后，常規(guī)消毒和鋪巾；③行股靜脈血管插管，在右側(cè)腹股溝韌帶下方2 cm 處觸及股動脈搏動，內(nèi)測0.5～1 cm定位，18號穿刺針斜面朝上進針，針尖指向股靜脈處，與皮膚成30°～45°角進針，有暗紅色血液流出時固定穿刺針，送入導(dǎo)絲，撤出穿刺針，再插入9F鞘管，退出導(dǎo)絲及擴張管，鞘管用低分子肝素生理鹽水沖洗；④安裝血壓監(jiān)測設(shè)備，并記錄犬的基線血壓；⑤在X光透視下，將導(dǎo)引導(dǎo)絲送入肺動脈遠端，經(jīng)導(dǎo)引導(dǎo)絲送入冷凍球囊至肺動脈開口，在肺動脈口部充盈球囊造影證實球囊封堵住肺動脈口，后球囊充氣冷凍，分6次間隔冷凍，每次持續(xù)1～2 min；⑥放入Achieve導(dǎo)管至肺動脈開口測量肺動脈交感神經(jīng)電位，驗證肺血管內(nèi)膜交感神經(jīng)電位隔離。

1.3 觀察指標

A、B和C三組采用Swan-Ganz漂浮導(dǎo)管至右心房、右心室及肺動脈，分別測定消融術(shù)前后血流動力學參數(shù)，包括中心靜脈壓、右房壓、右室壓、mPAP及肺毛細血管楔嵌壓(PCWP)；經(jīng)股動脈穿刺測定系統(tǒng)血壓；以熱稀釋法測定心輸出量；肺血管阻力=mPAP/心指數(shù)。使用Biosense Webster 1.035電生理記錄儀監(jiān)測壓力和心輸出量。

經(jīng)Swan-Ganz漂浮導(dǎo)管取實驗犬血液10 mL。采用雙抗體夾心ABC-ELISA法。犬內(nèi)皮素-1(ET-1)ELISA檢測試劑盒采購自上海博湖生物科技有限公司，批號：BH-ELISA4294。用抗狗ET-1單抗包被于酶標板上，標準品和樣品中的ET-1與單抗結(jié)合，加入生物素化的抗狗ET-1，形成免疫復(fù)合物連接在板上，辣根過氧化物酶標記的Streptavidin與生物素結(jié)合，加入底物工作液顯藍色，最后加終止液硫酸。在450 nm處測OD值，ET-1濃度與OD值成正比，可通過繪制標準曲線求出標本中ET-1濃度。

1.4 統(tǒng)計學方法

2 結(jié)果

2.1 一般資料比較

三組比格犬在建模前年齡、體質(zhì)量、mPAP、PCWP和ET-1比較，差異無統(tǒng)計學意義，見表1。

表1 三組患者一般資料比較

2.2 三組實驗犬8周后PADN前后各項指標比較

術(shù)后第6月，A組的mPAP、PCWP和ET-1均低于術(shù)前；術(shù)后，和C組比較，A組差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；和B組比較，A組術(shù)后的mPAP、PCWP和ET-1均低于B組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表2。

表2 三組PADN術(shù)前和術(shù)后各項指標比較

3 討論

近年來，PAH的治療有了開創(chuàng)性進展。Galiè等[4]研究發(fā)現(xiàn)，一些功能失調(diào)的內(nèi)皮源性通路參與了PAH的特征性血管重塑。以功能失調(diào)的內(nèi)皮源性通路為藥理學靶點，一些新的介入技術(shù)也應(yīng)運而生，從而被用于特定的患者身上。例如，Chiu等[5]和Hoeper等[6]報道，房間隔造口術(shù)及肺動脈球囊血管成形術(shù)被認為是治療不能手術(shù)的PAH和手術(shù)風險極高患者的一種有效方法。PADN也為PAH患者帶來了很多的臨床獲益。

在既往PAH臨床研究[7-8]中顯示，心率增快和骨骼肌交感神經(jīng)活性增強是PAH患者存在的主要臨床特征。臨床中，采用降低全身交感神經(jīng)活性的藥物β受體阻滯劑并不能有效降低PAH。因此推測，PAH患者除了全身交感神經(jīng)被激活之外，可能局部交感神經(jīng)被激活發(fā)揮更為重要的作用，為更精準的隔離肺動脈交感神經(jīng)提供理論依據(jù)。

Zhou等[9]研究結(jié)果表明，PADN可以改善PAH動物模型的血流動力學和心臟結(jié)構(gòu)，降低mPAP和PCWP減輕右心室肥厚，部分逆轉(zhuǎn)肺血管重構(gòu)。此外，在野百合堿誘導(dǎo)的PAH犬中，肺血管收縮和增殖的細胞因子和介質(zhì)的mRNA表達增加，在PADN后這些因子的表達明顯減少，并且這些效應(yīng)可持續(xù)至少幾個月，表明該手術(shù)可以永久性隔絕肺動脈交感神經(jīng)。陳紹良等[2]研究證實，行PADN術(shù)的患者3個月隨訪時，mPAP均明顯下降，超聲指標Tei index也明顯改善，但肺動脈傳統(tǒng)熱消融法消融時間長，患者耐受性差。

近些年來興起的房顫冷凍消融手術(shù)降低了房顫手術(shù)時限，減輕了患者痛苦，同時避免了手術(shù)后的抗栓治療，具有很好的應(yīng)用前景。本研究開展的動物實驗證實，在脫氫野百合堿誘導(dǎo)的PAH模型中，較術(shù)前，冷凍消融術(shù)后mPAP和PCWP及ET-1明顯降低。mPAP，術(shù)前：(30.20±2.60)mmHg；術(shù)后：(14.24±1.25)mmHg，P<0.05。PCWP，術(shù)前：(17.00±1.80)mmHg；術(shù)后：(9.36±1.59)mmHg，P<0.05。ET-1，術(shù)前：(135.00±14.60)pg/mL；術(shù)后：(77.00±7.20)pg/mL，P<0.05。冷凍消融組術(shù)后mPAP、PCWP和ET-1測量值水平和對照組比較，略有升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。和B組比較，A組術(shù)后的mPAP、PCWP和ET-1均低于B組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。上述結(jié)果表明，局部損傷或干預(yù)肺動脈交感神經(jīng)的完整性和功能后，比格犬的mPAP可得到顯著變化，且術(shù)后表現(xiàn)出降低mPAP效果的可延續(xù)性。同時說明冷凍消融術(shù)在肺動脈去交感神經(jīng)操作方面的可行性，為PAH治療提供了全新思路，為未來治療人類PAH提供了先進的手段。

綜上所述，冷凍球囊消融去肺動脈交感神經(jīng)術(shù)不失為一種治療PAH的有效手段，從神經(jīng)調(diào)節(jié)層面降低了肺動脈的高壓力。由于PAH發(fā)病的復(fù)雜性，從體液細胞學層面去干預(yù)PAH也是一個值得探討的問題[10]。同時，如何把冷凍消融去肺動脈交感神經(jīng)術(shù)應(yīng)用于臨床，切實可行的降低PAH患者的死亡率則需進一步探索。