肖 平 蔡桂程 陳文婷

(1. ?？谑械谌嗣襻t(yī)院骨科，?？?571100)(2. 海南省人民醫(yī)院血液內(nèi)科，?？?570311)

多發(fā)性骨髓瘤(multiple myeloma，MM)是一種漿細胞異常克隆性增殖的血液系統(tǒng)惡性腫瘤，大量異常單克隆免疫球蛋白的產(chǎn)生導(dǎo)致了靶器官功能損害[1]。雖然近年來，蛋白酶體抑制劑、免疫調(diào)節(jié)藥物、自體干細胞移植對MM的緩解率和整體存活率起到了顯著的提高作用，但是復(fù)發(fā)或腫瘤細胞的耐藥使得MM仍屬于難以治愈的惡性血液腫瘤[2]。硼替佐米(bortezomib)商品名萬珂(velcade)，是一種可逆的蛋白酶體抑制劑，是目前MM一線治療藥物[3]，但是后期獲得性的耐藥使得硼替佐米僅僅是延遲疾病進展時間，對患者的整體存活率無顯著影響。硼替佐米耐藥機制極其復(fù)雜，目前仍未完全闡明[4]，長鏈非編碼 RNA(long non-coding RNA，lnc RNA)是一類長度大于200個核苷酸的非編碼轉(zhuǎn)錄片段，其在基因轉(zhuǎn)錄中的作用逐漸受到關(guān)注，其在腫瘤發(fā)病機制研究中的研究成為目前研究的熱點之一[5]，長鏈非編碼RNAH19(lncRNAH19)在胚胎中高表達，出生后表達下調(diào)，Zhu等[6]研究顯示lncRNAH19在多種惡性腫瘤中表達上調(diào)。本研究探討了lncRNAH19在多發(fā)性骨髓瘤硼替佐米耐藥中的作用。

1 臨床資料和方法

1.1 臨床病例資料

選取我院2017年2月—2018年12月治療的初診MM患者26例、硼替佐米化療緩解MM患者25例及硼替佐米化療后耐藥復(fù)發(fā)MM患者22例。納入對象：參照2017年修訂的中國多發(fā)性骨髓瘤診治指南診斷的MM患者[7]。排除對象：曾使用過免疫調(diào)節(jié)劑、自體干細胞移植或者其他生物治療者，伴發(fā)其他惡性腫瘤者。另取我院健康體檢者30例作為健康對照。對照組：男18例和女12例，年齡36～74歲，平均(58.24±11.34)歲；初診MM組：男15例和女11例，年齡35～73歲，平均(58.21±11.27)歲；緩解MM組：男14例和女11例，年齡35～75歲，平均(58.28±11.38)歲；耐藥MM組：男12例和女10例，年齡33～75歲，平均(58.19±11.24)歲，4組在性別及年齡方面均具有可比性，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

1.2 實驗試劑和儀器

人多發(fā)性骨髓瘤細胞系OPM2購自國家細胞資源庫；硼替佐米購自正大天晴藥業(yè)集團有限公司；RPMI1640 培養(yǎng)基、胎牛血清購自Gibco；細胞總RNA提取試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR Green熒光染料試劑盒、Lipofectamine 2000 轉(zhuǎn)染試劑盒、CCK-8細胞活力檢測試劑盒購自TaKaRa；lncRNAH19和內(nèi)參β-actin擴增引物為上海吉凱制藥技術(shù)有限公司設(shè)計與合成；siRNA-H19、siRNA-NC、lncRNA H19慢病毒載體以及空慢病毒載體由上海吉凱制藥技術(shù)有限公司構(gòu)建和提供，序列見表1所列；7000熒光定量Real-time PCR儀購自ABI；Med550酶標(biāo)儀購自Bio-Rad。

表1 引物序列表

1.3 lncRNA H19表達的熒光定量Real-time PCR檢測

抽取所有受試者靜脈血2 mL，使用細胞總RNA試劑盒提取細胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄處cDNA第一鏈，每例樣品取10 μg cDNA，加入lncRNAH19擴增引物和內(nèi)參引物，使用熒光定量PCR試劑盒進行擴展，檢測各樣品熒光的變化，擴增條件：94 ℃變性30 s，60 ℃退火15 s，72 ℃延伸 30 s，共反應(yīng)40個循環(huán)。對照內(nèi)參用2-△△Ct表示目的基因的表達水平。

1.4 慢病毒或干擾RNA轉(zhuǎn)染OPM2細胞以及CCK-8細胞活力檢測

人多發(fā)性骨髓瘤OPM2細胞于37 ℃、5% CO2條件下，培養(yǎng)于胎牛血清配制的RPMI1640 培養(yǎng)基，取對數(shù)生長期細胞接種24 孔板，每孔105個細胞，使用Lipofectamine 2000 轉(zhuǎn)染試劑盒，轉(zhuǎn)染siRNA-H19、siRNA-NC、lncRNAH19慢病毒載體以及空慢病毒載體(MOI=100)，設(shè)立對照，37 ℃、5%CO2條件下轉(zhuǎn)染72 h，熒光下觀察細胞轉(zhuǎn)染率，PCR基因擴增鑒定轉(zhuǎn)染效果，轉(zhuǎn)染siRNA-H19的OPM2細胞標(biāo)記為OPM2/si-H19，轉(zhuǎn)染siRNA-NC的OPM2細胞標(biāo)記為OPM2/NC，轉(zhuǎn)染lncRNAH19慢病毒的OPM2細胞標(biāo)記為OPM2/H19、轉(zhuǎn)染空病毒載體的OPM2細胞標(biāo)記為OPM2/Blank。

取對數(shù)生長期對照OPM2細胞、OPM2/si-H19細胞、OPM2/NC細胞、OPM2/H19細胞和OPM2/Blank細胞接種到96 孔板，每孔104個細胞，適應(yīng)性培養(yǎng)12 h后，加入對半系列稀釋的硼替佐米(0、3.125 nmol/L、6.25 nmol/L、12.5 nmol/L、25 nmol/L、50 nmol/L和100 nmol/L)繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，按照CCK-8細胞活力檢測試劑盒說明書操作，加入CCK-8液，混勻，3 h后，酶標(biāo)儀450 nm波長處測定各孔顏色的變化，參照對照計算IC50值。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析

資料輸入SPSS 16.0軟件進行分析，所有實驗至少重復(fù)三次，計量資料采用t檢驗，多組均數(shù)比較使用方差分析，計數(shù)資料使用X2分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 MM患者中l(wèi)ncRNA H19表達的變化

由表2可知，對照組、初診MM組、緩解MM組和耐藥MM組lncRNAH19的2-△△Ct值分別為(0.107±0.032)、(0.324±0.067)、(0.218±0.042)和(0.486±0.095)，各組間具有顯著性差異(P<0.01)。其中，初診MM組顯著高于對照組和緩解MM組(P<0.01)，耐藥MM組又顯著高于初診MM組(P<0.01)。

表2 lncRNA H19表達的熒光定量PCR檢測

2.2 過表達或低表達lncRNA H19影響了硼替佐米對人多發(fā)性骨髓瘤OPM2細胞的敏感性

轉(zhuǎn)染后熒光顯微鏡下觀察對照組無熒光，OPM2/si-H19、OPM2/NC、OPM2/H19和OPM2/Blank組細胞陽性轉(zhuǎn)染率在90%以上，如圖1所示。經(jīng)PCR基因擴增后確認OPM2/si-H19組lncRNAH19表達顯著減低、OPM2/H19組lncRNAH19表達顯著增加，OPM2/NC和OPM2/Blank組lncRNAH19表達無顯著性變化(圖2)。

圖1 lncRNA H19基因轉(zhuǎn)染效率的熒光檢測

圖2 lncRNA H19表達的PCR檢測

CCK-8細胞活力實驗結(jié)果顯示，對照組、OPM2/si-H19組、OPM2/NC組、OPM2/H19組和OPM2/Blank組細胞的IC50值分別為(17.86±1.64)nmol/L、(6.83±1.05)nmol/L、(18.04±1.72)nmol/L、(31.14±3.57)nmol/L和(17.75±1.68)nmol/L。其中，對照組、OPM2/NC組和OPM2/Blank組無顯著性差異(P>0.05)，OPM2/si-H19組硼替佐米IC50值顯著低于對照組(P<0.01)，OPM2/H19組硼替佐米IC50值顯著高于對照組(P<0.01)(圖3)。

圖3 各組OPM2細胞的CCK-8細胞活力實驗

3 討論

MM仍然是一種無法治愈的疾病，其復(fù)發(fā)率高，耐藥速度快是目前臨床治療的主要障礙[8]，因此探索其耐藥機制既有利于對MM 疾病本質(zhì)的認識，也可以為疾病的治療提供新的靶點[9]。

lncRNA不編碼蛋白質(zhì)，但其可以參與基因組的表觀遺傳調(diào)控、轉(zhuǎn)錄調(diào)控以及轉(zhuǎn)錄后調(diào)控。陳林等[10]研究顯示細胞外泌體中含量豐富，在腫瘤細胞中可以通過外泌體進行細胞間的傳遞。Shima等[11]研究顯示lncRNAH19在癌癥發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著作用。郭靜等[12]研究顯示高表達lncRNAH19的肝癌細胞以外泌體方式，通過激活蛋白磷脂酰肌醇-3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinases，PI3K)/蛋白激酶B (protein kinase B，PKB/Akt)/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，m TOR)(PI3K/AKT/m TOR)通路，增強其相鄰肝癌細胞的增殖、遷移和侵襲，可以促進肝癌的發(fā)生、發(fā)展。于潔等[13]在宮頸癌的研究中發(fā)現(xiàn)lncRNAH19可以調(diào)控 Bcl-2表達影響宮頸癌細胞的生物學(xué)行為，裸鼠移植瘤實驗顯示抑制lncRNAH19表達后宮頸癌細胞的增殖和侵襲能力也會得到顯著抑制。本研究檢測顯示MM組lncRNAH19的2-△△Ct值顯著高于對照組，說明了MM患者高表達lncRNAH19，提示了lncRNAH19可能也參與了MM的發(fā)生過程，進一步的分析顯示耐藥MM組lncRNAH19的2-△△Ct值顯著高于初診MM組，而緩解MM組lncRNAH19的2-△△Ct值出現(xiàn)了顯著的減低，提示了高表達lncRNAH19可能參與了硼替佐米的耐藥。

硼替佐米是目前治療MM最有效的化療藥物，但獲得性的耐藥常常阻礙了硼替佐米長期療效的發(fā)揮[14]，長鏈非編碼RNA在表觀遺傳、轉(zhuǎn)錄及轉(zhuǎn)錄后調(diào)控等多層面調(diào)控基因表達[15]，在惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、耐藥等過程存在很多潛在作用[16]。徐鵬翔等[17]在替莫唑胺抵抗的腦膠質(zhì)瘤中發(fā)現(xiàn)lncRNAH19可以通過上調(diào)6-甲基鳥嘌呤-DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(MGMT)mRNA的表達維持替腦膠質(zhì)瘤對莫唑胺的抗性。Shima等[11]在乳腺癌的研究中發(fā)現(xiàn)，lncRNAH19可以上調(diào)醛脫氫酶1(ALDH1)表達，維持腫瘤干細胞的表型，而腫瘤干細胞正是腫瘤耐藥的根源之一。本研究探討了lncRNAH19在MM患者硼替佐米耐藥中的作用，使用siRNA干擾OPM2細胞lncRNAH19后，硼替佐米對OPM2細胞的IC50值顯著減低，使用慢病毒過表達lncRNAH19后，硼替佐米對OPM2細胞的IC50值顯著升高，說明了lncRNAH19低表達可以顯著增加硼替佐米對OPM2細胞的敏感性，lncRNAH19高表達可以顯著降低硼替佐米對OPM2細胞的敏感性，上述結(jié)果提示了lncRNAH19高表達可能參與了MM的硼替佐米耐藥，但其具體的作用機制本文未做深入探討，為本研究的不足之處。

綜上所述，本研究觀察到MM患者lncRNAH19顯著升高，尤以硼替佐米耐藥MM患者為甚，高表達lncRNAH19可能參與了硼替佐米耐藥過程，為硼替佐米耐藥的克服提供了一個新的治療靶點。